无患子皂苷标准品的非标定量测定试剂盒及测定方法
阅读说明：本技术 无患子皂苷标准品的非标定量测定试剂盒及测定方法 (Non-calibration amount determination kit and determination method for soapberry saponin standard substance ) 是由 段志贵 陈爽 黄硕泉 刘炅峰 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物科技检测技术领域,具体公开一种无患子皂苷标准品的非标定量测定试剂盒及测定方法,该方法不需要无患子皂苷标准品,是一种非标定量的无患子皂苷含量测定方法；所述的试剂盒包括溶解剂、水解剂、指示剂、中和剂、显色剂及糖标准品,所述的测定方法包括以下步骤：A糖基含量的测定；B皂苷元含量的测定；C计算无患子皂苷样品中皂苷含量。本发明既可用于无患子皂苷标准品的建立,也可用于任何样品中无患子皂苷含量的测定。该发明针对皂苷中的糖基及皂苷元通过不同工艺分别进行提取、测定,相对于现有技术,本发明成本低、稳定性高。(The invention relates to the technical field of biotechnological detection, and particularly discloses a kit and a method for measuring the non-calibrated amount of a sapindoside standard substance, wherein the method does not need the sapindoside standard substance and is a non-calibrated amount method for measuring the content of sapindoside; the kit comprises a dissolving agent, a hydrolyzing agent, an indicator, a neutralizer, a color developing agent and a sugar standard substance, and the determination method comprises the following steps: measuring the content of A glycosyl; measuring the content of the sapogenin B; and C, calculating the saponin content in the soapberry saponin sample. The method can be used for establishing the soapnut saponin standard product and measuring the soapnut saponin content in any sample. The invention respectively extracts and determines glycosyl and sapogenin in the saponin through different processes, and compared with the prior art, the invention has low cost and high stability.)
技术领域
本发明涉及生物科技检测技术领域，尤其涉及一种无患子皂苷标准品的非标定量测定试剂盒及测定方法。
背景技术
专利“一种无患子总皂苷快速检测试剂盒及检测方法”(CN201710269527.8)公开一种无患子总皂苷快速检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括干燥辅助剂、提取剂、水解剂、指示剂、显色剂和标准品。所述干燥辅助剂为硅藻土或石英砂，所述提取剂为甲醇和乙酸，所述水解剂为盐酸，所述指示剂为酚酞，所述中和剂为氢氧化钠，所述显色剂为3、5-二硝基水杨酸，所述标准品为高纯度无患子总皂苷，适合无患子皂苷原料或制品的质量控制和工业生产过程中的快速抽检，然而该技术需采用高纯度无患子总皂苷作为标准品。标准品是用于样品的鉴别、检测、含量测定等的标准物质，在定量分析中，标准品的正确与否直接影响样品的测定结果，所以标准品的纯度标定至关重要。现有技术中，采用液相色谱质谱法及高效液相色谱法虽然能准确的测定和定量无患子皂苷，但除了存在仪器设备昂贵、维护成本高、所需操作人员的专业水平高、标准品昂贵等缺点外，仍然需要标准品。香草醛-高氯酸/浓硫酸法采用香草醛显色剂测定总皂苷含量，皂苷结构中的糖基本身可与香草醛发生显色反应，含有多种不同糖基数的皂苷致使香草醛出现显色结果差异，误差大，可靠性差；此外，标准品仍就是绕不开的技术障碍。
因此，上述几种常用方法共同的缺陷是需要无患子皂苷标准品，而目前尚无可用的无患子皂苷标准品，导致上述方法测定到的无患子皂苷含量偏差很大。因此，要解决上述矛盾，就必须建立无患子标准品的测定方法。
发明内容
本发明的目的在于针对已有的技术现状，提供一种成本低、稳定性高的无患子皂苷标准品的非标定量测定试剂盒及测定方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的在于，提供一种无患子皂苷标准品的非标定量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1采用DNS比色法制作无水葡萄糖标准品的光密度值与其对应浓度的标准曲线；
S2称量W1无患子皂苷样品，用乙醇/乙酸液溶解，并用冰醋酸定容至v0，随后进行离心处理；
S3制备空白对照液：取步骤S2中上清液v1，加入蒸馏水和DNS试剂，沸水浴5分钟后，加入酚酞，冷却至室温并定容至v2；
S4制备待测液：取步骤S2中上清液v1，加入蒸馏水和6mol/l的盐酸至酸浓度为2.5±0.5mol/l，震荡混匀，沸水浴20-25分钟后，加入酚酞，用6mol/l的氢氧化钠滴至粉红；随后加入DNS试剂，沸水浴5分钟。冷却至室温并定容至v2；
S5以步骤S3的空白对照液为空白对照测定步骤S4中待测液的光密度值；
S6根据步骤S1中的标准曲线及步骤S5中测得的光密度值得到待测液中还原性单糖的含量m1；再按照下列公式计算无患子皂苷样品中的糖基含量P1：
S7水解：称量W1无患子皂苷样品，加入2.5±0.5mol/l的盐酸，充分溶解后沸水浴加热20-30分钟；
S8过滤：将水解液用砂芯漏斗真空抽滤，1mol/l甲酸溶液淋洗3次，得滤液和滤渣；
S9将步骤S8中的滤渣冷冻干燥，称取质量m2；
S10将步骤S8中的滤液用氢氧化钠中和至pH7-8；
S11将中和后的液体流经大孔非极性吸附树脂或C18反相柱，流速为1ml/min，随后用70-80％乙醇溶液冲洗，收集洗脱液；
S12减压蒸馏去除乙醇，冷冻干燥，称取质量m3；
S13按照下列公式计算无患子皂苷样品中皂苷元的含量P2：
P2(％)＝(m2×1.022+m3)/W1；P2:皂苷元含量；1.022为校正系数；
S14按照下列公式计算无患子皂苷样品中皂苷含量：P＝P1+P2；P：无患子皂苷样品中皂苷的实际含量。
优选地，所述步骤S1包含以下步骤：
(1)配置葡萄糖标准母液；
(2)取葡萄糖标准母液用蒸馏水稀释配置一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液，分别向各葡萄糖标准溶液中加入等量DNS试剂，沸水浴5分钟后，冷却至室温并定容，测定各葡萄糖标准溶液的光密度值，根据各葡萄糖标准溶液的浓度和光密度值的线性关系制作标准曲线。
进一步的，步骤(1)中所述的配置葡萄糖标准母液包括以下步骤：取无水葡萄糖标准品，用蒸馏水溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液。
进一步的，所述步骤(2)中分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml步骤(1)中的葡萄糖标准母液，再分别加入1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4ml蒸馏水，配置为一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液，以含0ml葡萄糖标准母液的蒸馏水为空白对照测定各葡萄糖标准溶液的光密度值。
优选地，所述步骤S2中称量W1无患子皂苷样品，用乙醇/乙酸液溶解，并用冰醋酸定容至100ml，随后进行离心处理，所述的离心处理为12000rpm离心5min；
步骤S3中所述的制备空白对照液为取步骤S2中上清液0.1ml，加入1ml蒸馏水和1mlDNS试剂。沸水浴5分钟后，加入5uL酚酞，冷却至室温并定容至10ml；
步骤S4中所述的制备待测液为取步骤S2中上清液0.1ml，加入1.3ml蒸馏水和1ml6mol/L的盐酸，震荡混匀，沸水浴20-25分钟后，加入5uL酚酞，用6mol/L的氢氧化钠滴至粉红；随后加入DNS试剂，沸水浴5分钟。冷却至室温并定容至10ml。
优选地，步骤S7中所述水解为称量W1无患子皂苷样品，加入2.5±0.5mol/l的盐酸10*W1ml，充分溶解后沸水浴加热20-30分钟。
本发明的另一个目的在于，提供一种无患子皂苷标准品的非标定量测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括溶解剂、水解剂、指示剂、中和剂、显色剂及糖标准品，所述水解剂为2.5±0.5mol/l的盐酸，中和剂为6mol/l的氢氧化钠，糖标准品为0.1％的葡萄糖溶液。
进一步的，所述的溶解剂为1:1-2的乙醇/乙酸液，指示剂为0.1-0.5％的酚酞，显色剂为DNS试剂(3.5-二硝基水杨酸试剂)。
本发明的有益效果在于：
本发明克服了当前没有无患子标准品的窘况，是一种不需要标准品的绝对定量方法。既可用于无患子皂苷标准品的建立，又可用于无患子皂苷样品的定量检测，是一种实用性强的技术方法。该方法针对皂苷中的糖基及皂苷元通过不同工艺分别进行提取、测定，相对于现有技术，本发明成本低、稳定性高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
本发明公开一种无患子皂苷标准品的非标定量测定方法，包括以下步骤：
A.糖基含量的测定:
S1采用DNS比色法制作无水葡萄糖标准品的光密度值与其对应浓度的标准曲线：
(1)配置葡萄糖标准母液：称取100mg无水葡萄糖标准品，用蒸馏水定容至100ml。
(2)制作标准曲线：分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml步骤(1)中的葡萄糖标准母液，再分别加入1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4ml蒸馏水，随后分别加入1mlDNS试剂，沸水浴5分钟后，冷却至室温并定容至10ml，以含0ml葡萄糖标准母液的蒸馏水为空白对照测定各葡萄糖标准溶液的光密度值，根据各葡萄糖标准溶液的浓度和光密度值的线性关系制作标准曲线。
S2称量W1g无患子皂苷样品，用乙醇/乙酸液溶解，并用冰醋酸定容至100ml，随后12000rpm离心5min。
S3制备空白对照液：取步骤S2中上清液0.1ml，加入1ml蒸馏水和1mlDNS试剂。沸水浴5分钟后，加入5uL酚酞，冷却至室温并定容至10ml。
设置空白对照液，排除无患子皂苷样品中糖类杂质的影响。
S4制备待测液：取步骤S2中上清液0.1ml，加入1.3ml蒸馏水和1ml6mol/l的盐酸，震荡混匀，沸水浴20-25分钟后，加入5uL酚酞，用6mol/l的氢氧化钠滴至粉红；随后加入DNS试剂，沸水浴5分钟，冷却至室温并定容至10ml。
S5以步骤S3的空白对照液为空白对照测定步骤S4中待测液的光密度值。
无患子皂苷中的主要成分为三萜皂苷和倍半萜糖苷类，通过酸水解法使苷中的结合糖降解为还原性单糖，由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，计算多糖含量是应乘以系数0.9。
S6根据步骤S1中的标准曲线及步骤S5中测得的光密度值得到待测液中还原性单糖的含量m1mg；再按照下列公式计算无患子皂苷样品中的糖基含量P1：
P1(％)＝(m1*100mL*0.9*100)/(W1*0.1mL)
B.皂苷元含量的测定:
S7水解：称量W1g无患子皂苷样品，加入2.5±0.5mol/l的盐酸50ml，充分溶解后沸水浴加热20-30分钟，在酸性条件下加热，使皂苷水解成皂苷元，实验证明，采用2.5±0.5mol/l的盐酸、沸水浴加热20-30分钟，皂苷中的皂苷元水解较彻底。
S8过滤：将水解液用砂芯漏斗真空抽滤，1mol/l甲酸溶液淋洗3次，得滤液和滤渣。
S9将步骤S8中的滤渣冷冻干燥，称取质量m2mg。
S10将步骤S8中的滤液用氢氧化钠中和至pH7-8。
S11将中和后的液体流经大孔非极性吸附树脂或C18反相柱，流速为1ml/min，蒸馏水冲洗去除杂质后，用70-80％乙醇溶液冲洗，收集洗脱液。
S12减压蒸馏去除乙醇，冷冻干燥，称取质量m3。
S13按照下列公式计算无患子皂苷样品中皂苷元的含量P2：
P2(％)＝(m2×1.022+m3)/W1；P2：皂苷元含量；1.022为校正系数；
C.计算无患子皂苷样品中皂苷含量:
本发明中，通过多次试验确定皂苷元计算公式中的校正系数，进一步提高精准度。
S14按照下列公式计算无患子皂苷样品中皂苷含量：P＝P1+P2；P：无患子皂苷样品中皂苷的实际含量。
实施例2
本发明公开一种无患子皂苷标准品的非标定量测定试剂盒，试剂盒包括溶解剂、水解剂、指示剂、中和剂、显色剂及糖标准品，其中：
溶解剂为1:1-2的乙醇/乙酸液，用于糖基含量测定中溶解无患子皂苷样品，乙醇/乙酸液的体积比为1:1-2时，溶解效果较佳；
水解剂为2.5±0.5mol/l的盐酸，用于皂苷元含量测定中水解无患子皂苷样品；
中和剂为6mol/l的氢氧化钠，用于中和盐酸；
指示剂为0.1-0.5％的酚酞，用于酸碱度指示；
显色剂为DNS(3.5-二硝基水杨酸)试剂；
糖标准品为0.1％的葡萄糖溶液，用于糖基含量测定中的标准参照物。
以上结合具体实施方式描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。