阅读说明：本技术 一种眼氨肽注射液及其制备方法与应用 (Ophthalmic aminopeptide injection and preparation method and application thereof ) 是由 罗先隽 于 2019-12-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种眼氨肽注射液及其制备方法与应用。该制备方法包括以下步骤：取猪眼球,捣粹后两次乙醇溶液浸提和一次纯化水浸提,浸提后过滤,滤液合并得到合并液；合并液浓缩,加热至沸腾,过滤,滤液加活性炭吸附处理和钛棒过滤器处理后,滤液冷却得到带冷却液；冷却液经超滤处理后收集透过液,进行亲和层析处理,收集目标组分的洗脱液；洗脱液浓缩后,经调配灌封、灭菌,得到眼氨肽注射液。还讲所述眼氨肽注射液配制得到一种治疗复发性口疮的组合物药剂。本发明通过控制制备方法的过程参数,使得制备的眼氨肽注射液中的肽含量高达79.2％；经过复发性口疮的疗效试验,表明该眼氨肽注射液配制的组合物药剂具有治疗复发性口疮的药用效果。(The invention discloses an ophthalmic amino-peptide injection and a preparation method and application thereof. The preparation method comprises the following steps: taking the pig eyeball, smashing, extracting with ethanol solution twice and purified water once, filtering after extraction, and combining the filtrates to obtain a combined solution; concentrating the combined solution, heating to boil, filtering, adding activated carbon into the filtrate for adsorption treatment and titanium rod filter treatment, and cooling the filtrate to obtain a cooling liquid; collecting the permeate after the cooling liquid is subjected to ultrafiltration treatment, performing affinity chromatography treatment, and collecting the eluent of the target component; concentrating the eluent, blending, encapsulating and sterilizing to obtain the ophthalmic amino peptide injection. The ophthalmic amino peptide injection is also used for preparing a composition medicament for treating recurrent aphtha. According to the invention, by controlling the process parameters of the preparation method, the peptide content in the prepared ophthalmic amino peptide injection reaches 79.2%; the curative effect test of the recurrent aphtha shows that the composition medicament prepared by the ophthalmic amino peptide injection has the medicinal effect of treating the recurrent aphtha.)

一种眼氨肽注射液及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及组合物药剂技术领域，尤其是一种眼氨肽注射液及其制备方法与应用。

背景技术

复发性口疮是多因素作用产生的口腔黏膜病变的常见病，在普通感冒、消化不良、精神紧张、郁闷不乐等因素导致，并且具有一定的复发性。一般主要症状为口疮溃疡，呈现自限行，10天作用自愈，具体机制不明确。目前缺乏有效的治疗方案。致病因素还可能与α-溶血性L型链球菌感染、消化系统疾病、精神因素、内分泌紊乱，缺铁、锌、叶酸、维生素等有关。

眼氨肽是从猪眼球或牛眼球中提取的富含氨基酸、多肽、核苷酸及微量元素，且有促进眼组织的新陈代谢、伤痕愈合、吸收炎性渗出，并能促进眼角膜上皮组织的再生的眼部用药。对于眼氨肽的提取工艺，现有技术多采用醇提、活性炭吸附、脱色等步骤获得，提供工艺步骤多，投入大，提取产品中的眼氨肽含量低。

发明内容

本发明的目的是提供一种眼氨肽注射液及其制备方法与应用，提供眼氨肽注射液中多肽含量，并将其应用于治疗复发性口疮的组合物药剂配制中。

本发明提供的技术方案如下：

一种眼氨肽的制备方法，包括以下步骤：

提取：取猪眼球，捣粹后加乙醇溶液浸提，提取液过滤，得到第一滤液和第一残渣；所述第一滤渣再次用乙醇溶液浸提后过滤，得到第二滤液和第二残渣；所述第二滤渣用纯化水再次浸提后过滤，得到第三滤液和第三残渣，第一滤液、第二滤液和第三滤液合并得到合并液；

吸附：合并液浓缩，调节pH值至3.0-4.0，加热至沸腾，以滤布滤过，滤液加活性炭吸附处理和钛棒过滤器处理后，滤液冷却至25-40℃得到带冷却液；

精制：所述冷却液经超滤处理后收集透过液，进行亲和层析处理，收集目标组分的洗脱液；

后处理：所述洗脱液浓缩后，加入0.05-0.08g/ml经活性炭吸附澄清的氯化钠溶液，混匀过滤，混合比例为20-30:1，添加稳定剂，灌装灭菌后得到所述眼氨肽注射液，于2-8℃保藏。

本发明还提供了一种眼氨肽注射液在制备治疗复发性口疮组合物药剂中的应用，所述组合物药剂包括以下原料按重量份配制而成的药剂：眼氨肽200-300份、煅石膏400-700份、维生素10-30份、玄明粉50-100份、冰片10-30份、黄芪100-200份，水3000份，所述药剂是悬浊剂。

本发明提供的技术方案至少包括以下有益效果：

1、本发明通过控制提取过程中的乙醇溶液处理浸提参数、纯化水浸提参数，吸附过程中的活性炭加入量，精制层析选用层析，并且控制层析过程中第一缓冲液、第二缓冲液选用量，以及控制层析的上样pH和洗脱pH，使得制备的眼氨肽注射液中的肽含量高达79.2％，显著高于对比例。

2、进一步经过复发性口疮的疗效试验，结果表明，本发明提供的眼氨肽注射液配制的组合物药剂具有治疗复发性口疮的药用效果。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。

一、眼氨肽注射液的制备

本发明提供一种眼氨肽注射液的制备方法，包括步骤：将猪眼球经提取、吸附、精制和后处理制备而成。

初提：取猪眼球，捣粹后加乙醇溶液浸提，提取液过滤，得到第一滤液和第一残渣；所述第一滤渣再次用乙醇溶液浸提后过滤，得到第二滤液和第二残渣；所述第二滤渣用纯化水再次浸提后过滤，得到第三滤液和第三残渣，第一滤液、第二滤液和第三滤液合并得到合并液；提取通过将猪眼球经过两次乙醇溶液提取和一次纯化水提起，能够重复将猪眼球中的眼氨肽提取出来。为满足这一要求，猪眼球与每次浸提用乙醇溶液的质量比为1:100-400，其中，乙醇溶液(记为T1)含70-75％体积比乙醇，每次乙醇溶液浸提处理时间不低于6h。猪眼球与纯化水(记为T2)的质量为1:1000-3000，纯化水浸提处理时间不低于6h。提取过程中，采用100目304不锈钢滤网进行过滤。

吸附：合并液浓缩，调节pH值至3.0-4.0，加热至沸腾，以滤布滤过，滤液加活性炭吸附处理和钛棒过滤器处理后，滤液冷却至25-40℃得到带冷却液；活性炭吸附处理和钛棒过滤器处理依次进行两次。第一次活性炭吸附处理的活性炭与滤布过滤后滤液的质量比5-3:1000，经第一次钛棒过滤后的滤液调节pH值至8.5；第二次所述活性炭吸附处理的活性炭与所述滤布过滤后滤液的质量比1-3:1000，经第二次钛棒过滤后的滤液温度冷却至25-30℃得到带冷却液。通过活性炭吸附处理，能够将经提取得到的合并液中的溶解的大分子进行吸附，再经钛棒将活性炭过滤掉，如此，达到去除溶解的大分子目的。具体的，钛棒过滤器，为采用不锈钢为基材使用金属钛粉烧结而形成的滤芯作为过滤介质而制成的过滤器。过滤精度为0.2μm。

精制：冷却液经超滤处理后收集透过液，进行亲和层析处理，收集目标组分的洗脱液。超滤膜的截留分子量不大于5KD，以免生物大分子混入最终产品中。亲和层析所用填料为交联壳聚糖基质偶联亲和素-生物素复合体，亲和层析处理过程中，先用第一缓冲液平衡层析柱，再用第二缓冲液进行洗脱，收集目标组分溶液。第一缓冲液的处理pH值为7.0-9.0，第一缓冲液选自PBS(记为H1)、磷酸氢二钠-氯化钠(记为H2)、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液(记为H3)或磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(记为H4)中的一种；第二缓冲液的处理pH值为3.0-4.0，第二缓冲液选自磷酸氢二钠-柠檬酸(记为H5)、硼酸(记为H6)、Gly-HCL(记为H7)或邻苯二甲酸-HCl缓冲液(记为H8)中的一种。

具体的，先用pH7.0-9.0、0.05-0.2mol/L第一缓冲液充分平衡层析柱，然后用超滤的透过液上样层析柱，上样流速以10-75cm/h，所述cm/h为流速单位，即缓冲液每小时通过介质材料的高度。然后以pH3.0-4.0、0.05-0.2mol/L第二缓冲液以10-55cm/h的流速洗脱层析柱，洗脱体积为层析床体积的3-10倍，收集目标洗脱液。

后处理：所述洗脱液浓缩后，加入0.05-0.08g/ml经活性炭吸附澄清的氯化钠溶液，混匀过滤，混合比例为20-30:1，添加稳定剂，稳定剂如吐温-80，加入比例为混合液的1-2‰体积比，灌装灭菌后得到所述眼氨肽注射液，于2-8℃保藏。

具体的实施步骤过程中部分参数如表1中所示，得到实施例1-10和对比例1-3，其中对比例2采用凝胶排阻层析技术进行精制。表1中的实施步骤过程参数包括提取过程中乙醇溶液处理浸提参数、纯化水浸提参数，吸附过程中的活性炭加入量，精制层析中第一缓冲液、第二缓冲液选用量，以及层析的上样pH和洗脱pH，最终考察眼氨肽注射液中的肽含量(质量百分比)。

具体的眼氨肽注射液中的多肽含量测定采用AccQ.Tag方法对待测样品进行处理，用反相HPLC分析检测。

表1结果表明，提取过程中的乙醇溶液处理浸提参数、纯化水浸提参数，吸附过程中的活性炭加入量，精制层析选用亲和层析，并且层析过程中第一缓冲液、第二缓冲液选用量，以及层析的上样pH和洗脱pH都对最终产品中的肽含量产生影响。相对于对比例，实施例1获得眼氨肽注射液中的多肽含量最高。

表1猪眼球眼氨肽注射液的制备

二、对复发性口疮的治疗效果

实施例一：实施例1的眼氨肽300份、煅石膏400份、维生素10份、玄明粉100份、冰片30份、黄芪100份，水3000份，所述药剂是悬浊剂。

实施例二：实施例1的眼氨肽100份、煅石膏600份、维生素20份、玄明粉800份、冰片20份、黄芪180份，水3000份，所述药剂是悬浊剂。

实施例三：实施例1的眼氨肽200份、煅石膏700份、维生素30份、玄明粉50份、冰片10份、黄芪200份，水3000份，所述药剂是悬浊剂。

对比例一：对比例1的眼氨肽300份、煅石膏400份、维生素10份、玄明粉100份、冰片30份、黄芪100份，水3000份，所述药剂是悬浊剂。

试验材料：实验药剂：上述实施例一到三，对比例一的药剂，上述实验药剂均为的重量份，其中眼氨肽的重量为实施例1制备的眼氨肽注射液经过冷冻干燥获得固体重量份。其中维生素为维生素A或维生素B12。对照药剂：左旋咪唑。

试验对象：经确诊为轻型或重型复发性复发性口疮患者，病程半年以上。

试验方法：将484例患者分为三组，分为试验组：每日20mg试验药剂泡服；对照组：每日餐后服用，每日50mg；同时进行2个月为一疗程治疗。临床疗效判断标准分为痊愈、有效和无效三类。痊愈为：5-7天内主要症状消失，复发性口疮内溃疡消失，复发周期延长至1年以上。有效：5-7天内主要症状消失，治疗后半年内复发1-2次。无效：7天后愈合，治疗后每月复发。

试验结果：

表2试验组与对照组的疗效比较

表2中，有效率为判定为痊愈和有效的病例数占每一分组的占比。试验组的有效率高于对照组，并且试验组中实施例一、二、三的有效率高于对比例一；另外试验组的痊愈病例显著高于对照组。结果表明，相对于对照组，本发明提供的组合物药剂具有治疗复发性口疮的药用效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。