一种靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体T细胞及制备方法、应用

文档序号：1574551 发布日期：2020-01-31 浏览：10次 >En<

阅读说明：本技术 一种靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体T细胞及制备方法、应用 (humanized scFv chimeric antigen receptor T cells targeting CD19, and preparation method and application thereof ) 是由谭毅孔群芳张慧慧韩镇于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程和细胞生物学技术领域,具体涉及一种靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体T细胞及制备方法、应用。具体为构建含有靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体(anti-hCD19CAR)基因结构的慢病毒表达载体,通过慢病毒介导的方式将含有anti-hCD19CAR表达载体转导至T细胞,anti-hCD19CAR修饰的T细胞能够特异性杀伤CD19阳性的肿瘤细胞,能够有效避免鼠源CD19基因导致的人抗鼠抗体的产生,降低鼠源CAR的免疫原性,能够改善CAR-T细胞的存活时间,高特异性的与人源CD19蛋白结合,增强CAR-T的治疗效果,提高CAR-T治疗的安全性和有效性。(The invention belongs to the technical field of genetic engineering and cytobiology, and particularly relates to humanized scFv chimeric antigen receptor T cells targeting CD19, a preparation method and application thereof, wherein a lentivirus expression vector containing a gene structure of a humanized scFv chimeric antigen receptor (anti-hCD 19 CAR) targeting CD19 is constructed, the anti-hCD19CAR expression vector is transduced to the T cells in a lentivirus mediated mode, the anti-hCD19CAR modified T cells can specifically kill CD19 positive tumor cells, the generation of human anti-mouse antibodies caused by murine CD19 genes can be effectively avoided, the immunogenicity of murine CAR can be reduced, the survival time of the CAR-T cells can be improved, the high-specificity is combined with human CD19 protein, the treatment effect of CAR-T is enhanced, and the safety and the effectiveness of treatment of the CD-T are improved.)

技术领域

本发明属于基因工程和细胞生物学技术领域，具体涉及一种靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体（anti-hCD19CAR）T细胞及制备方法、应用。

背景技术

鉴于传统的化疗、放疗及造血干细胞移植等疗法对血液系统恶性肿瘤疗效欠佳即完全缓解率低（Complete response， CR）或复发率高，例如急性淋巴细胞白血病（ALL）虽化疗后CR率可达80%-90%，但70%右的复发率及仅30%左右的３年无病生存率（Disease freesurvival, DFS），使得研究者们仍需进一步探索更好的治疗方法。

随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，细胞免疫治疗近年来取得了长足的进步，被Science杂志列为2013年十大科学突破的首位。其中以嵌合抗原受体（Chimeric antigenrecepter, CAR）修饰的T细胞为代表的肿瘤靶向免疫治疗的成就尤为突出，在体外和临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。

CAR-T 细胞疗法通过外源基因转导技术，把识别肿瘤相关特异性抗原的单链抗体片段 (Single chain antibody fragment，scFv) 和 T 细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，这样 scFv 通过跨膜区与 T 细胞胞内的活化增殖信号域偶联，经回输患者体内后大量扩增，能够以抗原依赖、非 MHC 限制性的模式表现出较强的抗肿瘤作用。

目前针对血液系统恶性肿瘤的CAR-T细胞种类很多，其中以靶向CD19分子的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞（CD19CAR-T）在血液肿瘤治疗临床试验上取得的成就最为突出。CD19是一种属于Ig超家族成员的穿膜糖蛋白，表达于B系细胞（包括前B细胞、不成熟B细胞，成熟B细胞和活化B细胞）及滤泡树突状细胞上，是与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原。大部分B细胞恶性肿瘤细胞表面都表达CD19分子，而造血干细胞及非造血细胞则不存在CD19表达。因此CD19是诊断B淋巴细胞系肿瘤和鉴定B淋巴细胞的最好标志，是治疗B系肿瘤最有潜力的靶点。

2017年8月，美国FDA正式批准首个CAR-T药物Kymriah（CTL019）应用于临床治疗治疗复发或难治性(r/r)儿童和年轻成人B细胞急性淋巴细胞白血病，这是人类历史上的一个里程碑事件。同年10月，美国FDA批准了第2个CAR-T药物Yescarta（KTE-C10）用于治疗对其他疗法无响应或者接受过至少2种治疗方案后复发的特定类型成人大B细胞淋巴瘤患者，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤。

现有数据显示抗CD19CAR-T治疗难治复发B-ALL患者完全缓解（CR）率为70%-90%。血液系统恶性肿瘤细胞的消退与CAR-T细胞的增殖水平及其在血液中的存活时间存在密切相关。而ALL患者体内的CAR-T细胞消失常伴随着正常B细胞的恢复，并且部分患者出现了CD19+白血病的复发。目前CAR-T技术中所应用的CD19抗原受体是采用鼠源基因，例如鼠源单克隆抗体FMC63，但是此类鼠源基因片段在治疗人类疾病过程中有引起人抗鼠抗体（HAMA,Human anti-mouse antibodies）的产生的可能性。有研究显示鼠源CAR序列产生的免疫原性可能导致CAR-T细胞无法活化及持续存在。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明提供了一种靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体（anti-hCD19CAR）T细胞。

本发明还提供了一种靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体（anti-hCD19CAR）T细胞的制备方法。

本发明还提供了上述靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体（anti-hCD19CAR）T细胞的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种慢病毒表达载体，其特征在于：包含有靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体（anti-hCD19CAR）基因结构，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3。

进一步的，所述嵌合抗原受体基因结构包含顺序串联的CD8穿膜信号肽、anti-hCD19scFv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区和CD3 Zeta TCR激活区。

上述CD8穿膜信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述anti-hCD19scFv包括或选自下述任一氨基酸序列： SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，其中，(b)、（c）及（a）所示的scFv具有相同功能；(b)、（c）及（a）所示的scFv氨基酸序列具有90%以上的一致性。(b)、（c）及（a）所示的scFv均由轻链可变区、轻重链连接区和重链可变区组成。所述CD8跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述4-1BB共刺激信号区氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述CD3 Zeta TCR激活区氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了一种含有上述慢病毒表达载体的靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体T细胞的制备方法，通过以下方法制备得到：

（1）质粒载体构建：anti-CD19 scFv片段经人源化改造后，获得anti-hCD19 scFv，片段前***Mlu I酶切位点和 CD8穿膜信号肽，片段后***BamH I酶切位点，合成含Mlu I+CD8a-hCD19scFv+ BamH I 的pUC57-Amp质粒经过Mlu I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果，胶回收获得修饰后的基因片段；同时将含CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区和CD3 Zeta TCR激活区的慢病毒骨架质粒pHR经过Mlu I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定之后胶回收长片段；将修饰后的anti-hCD19 scFv片段连接到慢病毒骨架质粒pHR中，提取质粒确定测序正确后，得到pHR-anti-hCD19CAR质粒；

（2）慢病毒制备：将所述携带有目的基因的pHR-anti-hCD19CAR质粒、pCMV载体和pMD.2G载体混合后转染到293FT 细胞中，转染后6h ～ 8h 更换为含10%FBS和1%谷氨酰胺的DMEM完全培养基培养，48h 后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm 滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒溶液，浓缩后备用；

（3） anti-hCD19CAR-T制备：取50mL新鲜血液，通过淋巴细胞分离液进行密度梯度离心来分离单个核细胞，将单个核细胞按1-2×10⁶/mL重悬CTS^TM AIM V^TM SFM培养基中，同时添加5%ICS， CD3单抗50ng/mL和CD28单抗50ng/mL来激活T淋巴细胞，37℃ 5%CO2培养48小时；培养2天后，收集细胞，重悬细胞至1x10⁶/mL，按照MOI= 5加入浓缩后的重组慢病毒溶液，同时加入终浓度为500U/mL IL-2和4ug/mL polybrene，混匀，37℃ 5%CO₂培养6-8小时，300g5min离心换液为新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基；每2-3天加入新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基，维持细胞密度在1×10⁶/mL左右，扩增培养10-12天即可。进一步的，步骤（3）中，所述CTS^TM AIM V^TM SFM培养基含有500U/mL IL-2。

本发明还提供了一种利用靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体T细胞用于制备预防和/ 或治疗和/ 或辅助治疗恶性肿瘤的药物的应用。

上述恶性肿瘤细胞包括CD19阳性的B淋巴细胞白血病或B淋巴细胞瘤。

本发明中一些常用的术语说明如下：

CAR：chimeric antigen receptors，嵌合抗原受体

scFv:单链抗体片段

anti-hCD19CAR：靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体

anti-mCD19CAR: 靶向鼠源CD19 scFv嵌合抗原受体

T:T淋巴细胞

本发明提供了一种特异性杀伤CD19恶性B细胞肿瘤的靶向CD19的人源化scFv嵌合抗原受体（anti-hCD19CAR）T细胞制备方法。该嵌合抗原受体能够高特异性的与人源CD19蛋白结合，利用基因工程技术在T细胞中工程化表达整合在CAR中的靶向CD19的人源化抗体片段，得到的CAR-T细胞能够用于治疗表达CD19的血液系统恶性肿瘤。

本发明提供的anti-hCD19CAR T细胞能够特异性杀伤CD19阳性的肿瘤细胞，体外试验验证anti-hCD19CAR T杀伤作用，效应细胞与靶细胞比为3:1时杀伤效率达95%以上，杀伤过程中产生IL-2和IFN-γ等细胞因子。

本发明提供的anti-hCD19CAR T细胞能够有效保护B细胞淋巴瘤负荷小鼠，观察60天以后，小鼠生存率达75%，明显高于移植anti-mCD19CAR-T细胞的负荷瘤小鼠组。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供的anti-hCD19CAR T细胞，能够有效避免鼠源CD19基因导致的人抗鼠抗体的产生，降低鼠源CAR的免疫原性，能够改善CAR-T细胞的存活时间，高特异性的与人源CD19蛋白结合，增强CAR-T的治疗效果，提高CAR-T治疗的安全性和有效性。

附图说明

图1 本发明所述的anti-hCD19 scFv片段修饰示意图。

图2 本发明所述的pHR- anti-hCD19CAR质粒构建示意图。

图3本发明所述的慢病毒滴度流式检测结果示意图。

图4 本发明所述的流式细胞仪检测anti-hCD19CAR T细胞CAR蛋白表达情况。

图5 本发明所述的anti-hCD19CAR T细胞体外杀伤CD19阳性肿瘤细胞，不同效靶比下特异性杀伤结果示意图。

图6本发明所述的anti-hCD19CAR T细胞体外杀伤CD19阳性肿瘤细胞时分泌到胞外的IL-2、IFN-γ含量结果示意图。

图7 本发明所述的anti-hCD19CAR T细胞移植至人B细胞淋巴瘤移植瘤小鼠模型后，负荷瘤小鼠生存曲线示意图。

以下结合附图和

具体实施方式

对本发明进一步说明，并非对本发明的限制。根据本领域公知常识，本发明的实施方式并不仅限于实施例所公开的内容，因此凡依照本发明技术启示所进行的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：质粒载体构建

anti-CD19 scFv片段经人源化改造后，获得anti-hCD19 scFv，片段前***Mlu I酶切位点和 CD8穿膜信号肽，片段后***BamH I酶切位点（如图1所示），交由基因公司（金唯智）合成。由基因公司合成含Mlu I+CD8a-hCD19scFv+ BamH I 的pUC57-Amp质粒经过Mlu I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果，胶回收获得修饰后的基因片段,如图1所示。同时将实验室已有的含CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区和CD3 Zeta TCR激活区的慢病毒骨架质粒pHR（见专利CN 108753774 A）经过Mlu I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定之后胶回收长片段。将修饰后的anti-hCD19 scFv片段连接到慢病毒骨架质粒pHR中，提取质粒确定测序正确后，得到pHR-anti-hCD19CAR质粒（如图2所示）。

实施例2:慢病毒制备及滴度检测：

将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体、pCMV载体和pMD.2G载体混合后转染到293FT 细胞（购自ATCC）中，转染后6h ～ 8h 更换为完全培养基培养，48h 后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm 滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。慢病毒浓缩根据Lenti-XTM Concentrator （Takara，cat:631231）说明书进行。

应用梯度稀释法测定病毒滴度，24孔板中每孔铺1×10⁵个K562细胞，取浓缩后的病毒稀释10倍，分别加入1μL、3μL、10μL、30μL病毒，37℃ 5%CO₂培养48小时，每孔取200μL细胞液做流式检测。每个样品加10μL FITC-Labeled HumanCD19（20-291）Protein抗体标记，未感染病毒的K562为阴性对照，室温避光孵育15min，400g离心5min，1mL PBS洗2遍后，沉淀用200μL 2%多聚甲醛重悬后上机检测（Millipore guava easyCyte HT）。结果如图3所示，随着病毒加入量的增加，阳性细胞的比例逐渐增大。当阳性率≤10%，认为病毒颗粒数与细胞数相等，因此病毒浓缩后滴度为1.35×10⁸IU/mL。

实施例3 CAR-T细胞的制备及CAR阳性率检测

1. anti-hCD19CAR-T制备

取50mL新鲜血液，通过淋巴细胞分离液（天津灏洋）进行密度梯度离心来分离单个核细胞。将单个核细胞按1-2×10⁶/mL重悬CTS^TM AIM V^TM SFM培养基（GIBCO，货号A3021002）中。同时添加5%ICS (GIBCO，A2596101)， CD3单抗（Ebioscience）50ng/mL和CD28单抗（Ebioscience）50ng/mL来激活T淋巴细胞，37℃ 5%CO2培养48小时。

培养2天后，收集细胞，重悬细胞至1x10⁶/mL，按照MOI= 5加入实施例2种浓缩后的慢病毒，同时加入终浓度为500U/mL IL-2（泉港）和4ug/mL polybrene（Sigma），混匀，37℃5%CO2培养6-8小时，300g 5min离心换液为新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基（含500U/mL IL-2）。

每2-3天加入新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基（含500U/mL IL-2），维持细胞密度在1×10⁶/mL左右，扩增培养10-12天。

2.CAR-T细胞的CAR阳性率检测

采用流式细胞术检测CAR-T细胞的CAR阳性率，所用抗体为FITC-Labeled HumanCD19（20-291）Protein。取病毒感染后培养2天的anti-hCD19CAR-T细胞5×10⁵，每个样品加10μL抗体，4℃避光孵育1 h，400g离心5min，1mL PBS洗3遍后，沉淀用200μL 2%多聚甲醛重悬后上机检测（Millipore guava easyCyte HT）。

结果如图4所示，anti-hCD19CAR T细胞中CAR阳性率达60.8%。

实施例4CAR-T细胞功能验证

1.anti-hCD19CAR-T细胞体外杀伤效率检测

K562细胞和K562-CD19细胞均为淋巴瘤细胞株， K562表面不表达CD19分子，而K562-CD19细胞表面表达CD19分子（见发明专利CN 107365798 A）。将两种细胞按1:1接种于96孔板中，每孔1×10⁵/种，按E:T=1:1、3:1、6:1分别接种培养9天的T细胞、anti-hCD19CAR-T细胞和anti-mCD19CAR-T细胞，每组3个复孔。37℃ 5%CO₂培养24小时，每孔吸取100μL上清液-80℃保存备用。剩余细胞每孔加入1μL PE anti-human CD19（Biolegend）和1μL FITCanti-human CD3（Biolegend），室温避光孵育15min，400g离心5min，1mL PBS洗2遍后，沉淀用200μL 2%多聚甲醛重悬后上机检测（Millipore guava easyCyte HT）。结果如图5所示，anti-hCD19CAR-T细胞对K562-CD19细胞有特异性杀伤，效靶比为1:1、3:1、6:1时特异性杀伤比均值为61%、97%、99%，杀伤率随效靶比的增加而升高。anti-hCD19CAR-T细胞杀伤效率高于anti-mCD19CAR-T细胞组。两组配对t检验P<0.05，具有显著差异。

2. ELISA检测杀伤上清中细胞因子的浓度

用ELISA法测定E:T=3:1杀伤上清样本中IL-2和IFN-γ的浓度，按试剂盒说明书HumanIL-2 ELISA MAX™ Deluxe（Biolegend，431804）、Human IFN-γ ELISA MAX™ Deluxe（Biolegend，430104）操作，所有标准品、样本均做3个复孔。具体操作方法如下：

a) 使用试剂盒前，所有试剂室温平衡1 h。

b) 一抗包被：检测前一天，按照说明书稀释一抗，加100μl /孔到96孔酶标板，4℃放置过夜。

c) 第二天弃去包被液，用PBST洗涤4次，每孔加入200μl封闭液室温封闭1 h。

d) 500pg/ml→7.81 pg/ml标准品的配制：按照试剂盒说明书，准备7只Eppendorf管，分别标记上500pg/ml，250pg／ml，125pg／ml，62.5pg／ml，31.3pg／ml，15.6 pg／ml，7.81pg／ml。配制500pg/ml至1ml，其余6管均加500μL样品稀释液，取500μL的标准品加入标记250pg／ml的管中，混匀后同样取出500μL，加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。

e) 样品稀释：按40μl样本加样品稀释液360μl将样品稀释10倍。

f) 加样：弃去封闭液，用PBST洗涤4次，分别设空白孔（样品稀释液）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上准确加样100μl，室温孵育2 h。

g) 加检测抗体：弃去样本，用PBST洗涤4次，准确检测抗体100μl，室温孵育1 h。

h) 加酶：弃去检测抗体，用PBST洗涤4次，每孔加入酶标试剂100μl，室温孵育30min。

i) 显色：弃去酶标试剂，用PBST洗涤5次，每孔先加入显色剂100μl，轻轻震荡混匀，室温避光显色30 min。

j) 终止：每孔加终止液100μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

k) 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

结果如图6所示，anti-hCD19CAR-T细胞、anti-mCD19CAR-T细胞分别与靶细胞混合培养后，可分泌大量IL-2和IFN-γ细胞因子来杀伤细胞，且anti-hCD19CAR-T组细胞因子含量高于anti-mCD19CAR-T细胞组，与T细胞组间差异显著。

3. anti-hCD19CAR-T细胞体内杀伤实验

用人B细胞淋巴瘤移植瘤模型检测本发明的anti-hCD19CAR-T对小鼠生存期的影响。

1）构建人B细胞淋巴瘤移植瘤小鼠模型

6-8周SPF级NCG免疫缺陷小鼠，尾静脉注射1x10⁵ Raji细胞/300μl生理盐水，构建移植瘤模型。

2） anti-hCD19CAR-T细胞移植实验

接种肿瘤4天后，将实验小鼠随机分成3组，每组8只：感染空质粒T细胞组（Mock组）、anti-hCD19CAR-T细胞组和anti-mCD19CAR-T细胞组，尾静脉注射相应的T细胞3×10⁷/500μl 生理盐水。观察小鼠存活数量，记录小鼠生存期计算存活率。持续观察60天。

结果如图7所示，持续观察记录60天后，移植anti-hCD19CAR-T细胞的负荷瘤小鼠仍有75%的存活率，明显高于移植anti-mCD19CAR-T细胞的负荷瘤小鼠组（50%存活率），而Mock组则在24天时全部死亡。说明本发明提供的anti-hCD19CAR-T细胞对疾病模型小鼠的生存时间有明显的有延长作用。

经上述实施例证明，本发明提供的anti-hCD19CAR-T细胞具有抑制肿瘤细胞增殖、特异性杀伤CD19阳性肿瘤细胞的优势，有望避免鼠源CD19CAR-T导致的人抗鼠抗体反应，可用于治疗CD19阳性的B淋巴细胞白血病或B淋巴细胞瘤。

对比例1

专利（CN 104788573 A）公布了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8a-CD28-CD3ζ基因结构，制备的CAR-T细胞特异性杀伤CD19阳性的肿瘤细胞，CAR-T细胞与靶细胞共培养上清中IL-2含量（约1250pg/ml）低于本发明。

对比例 2

专利（CN 107880128 A）公布了一种抗CD19的全人源抗体或抗体片段，其CAR基因结构包含依次连接的CSF2RA信号肽序列、CD19scFv、C-myc检测标签、铰链区、CD8跨膜结构和CD28、4-1BB、CD3Zeta功能性信号传导结构域，其制备的CAR-T细胞与CD19阳性的靶细胞共培养，培养上清中IL-2含量（约500pg/ml）和IFN-γ（约1250pg/ml）含量均低于本发明。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

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