阅读说明：本技术 一种基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进 (optimization and improvement of method for synthesizing ferulic acid and methyl ferulate based on enzyme method ) 是由 廖海黎 周嘉裕 陈安琪 李秋娥 张田 黄新河 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进,包括以下步骤：步骤1：将含有质粒<I>LCCOMT</I>-pET28a的大肠杆菌BL21菌株进行活化；步骤2：对步骤1得到的菌液进行扩大培养后,同时加入IPTG、咖啡酸/咖啡酸甲酯进行共发酵；步骤3：将共发酵后的发酵液离心,用乙酸乙酯萃取后即可得到阿魏酸/阿魏酸甲酯；本发明采用基因工程酶(LCCOMT)基因工程菌的共发酵制备阿魏酸或阿魏酸甲酯,工艺简单、成本低、过程可控且环保。(The invention discloses optimization and improvement of methods for synthesizing ferulic acid and methyl ferulate based on an enzyme method, which comprises the following steps of step 1, plasmid-containing LCCOMT -escherichia coli BL21 strain of pET28a for activation; step 2: after the bacterial liquid obtained in the step 1 is subjected to amplification culture, IPTG and caffeic acid/methyl caffeate are added for co-fermentation; and step 3: centrifuging the fermented liquid after co-fermentation, and extracting with ethyl acetate to obtain ferulic acid/methyl ferulate; the method adopts the co-fermentation of genetically engineered enzyme (LCCOMT) genetically engineered bacteria to prepare the ferulic acid or the ferulic acid methyl ester, and has the advantages of simple process, low cost, controllable process and environmental protection.)

一种基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进。

背景技术

阿魏酸是植物界普遍存在的一种酚酸，化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸。它有许多保健功能，如清除自由基、抗血栓、抗菌消炎、抑制肿瘤、防治高血压、心脏病、增强***活力、抑制人表皮黑素细胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性等。其中阿魏酸的主要用途包括1、保健化妆品中的增白成分；2、在食品工业，阿魏酸可作为香兰索的合成前体，后者在全球的年销量超过100亿元人民币；3、阿魏酸作为食品的抗氧化剂与防腐剂；4、以阿魏酸为主要成分的成品药超过20种，其市场前景极其广泛。

阿魏酸甲酯是一种紫外吸收剂，其对280nm～360nm波长的紫外线有良好的吸收能力且吸收率高，具有抗氧化、美白与消炎等功效。比如，在化妆品加入阿魏酸甲酯，不仅能够起到美白作用，长期使用还能够使皮肤具有绢质感。并且，阿魏酸甲酯还可作为强效美白剂阿魏酸异辛酯的合成中间体。最后，阿魏酸甲酯也是一个重要的医药中间体。

目前用于生产阿魏酸及阿魏酸甲酯单体仍主要通过化学提取与化学合成获得，以上方法对环境危害极大。随着人们环保意识的加强及国家生态文明的政策导向，利用环境友好的生物方法生产阿魏酸开始得到更多重视。因而采用现代基因工程合成阿魏酸是必然趋势。目前如专利号为2015100756780的一种酶法合成阿魏酸的方法，专利号为2019102612912的一种酶法合成阿魏酸甲酯的方法，解决了化学合成与化学提取方法的重污染缺点。但是由于需要超声破碎、LCCOMT重组酶的亲和层析、透析等步骤，过程步骤繁琐，成本较高、操作步骤复杂。

发明内容

本发明提供一种采用基因工程酶体内转化的基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进。

本发明采用的技术方案是：一种基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进，包括以下步骤：

步骤1：将含有质粒LCCOMT-pET28a的大肠杆菌BL21菌株进行活化；

步骤2：对步骤1得到的菌液进行扩大培养后，同时加入IPTG、咖啡酸或咖啡酸甲酯进行共发酵；

步骤3：将共发酵后的发酵液离心，用乙酸乙酯萃取后即可得到阿魏酸或阿魏酸甲酯。

2、根据权利要求1所述的一种基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进，其特征在于，所述步骤1中活化过程如下：

S11：将菌株在含浓度为10μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上划线接种，37℃恒温培养箱内倒置培养过夜；

S12：挑取单菌落接种至含有卡那霉素10μg/mL的LB液体培养基中进行初培养14～16h；

S13：吸取步骤S12得到的菌液于离心管中，加入灭菌的甘油，即可在-80℃条件下长期保存。

进一步的，所述步骤2中扩大培养如下：

将菌株于37℃、200rpm条件下培养至OD600介于0.6～0.8。

进一步的，所述步骤2中添加物为咖啡酸时共发酵的条件如下：发酵时间为24～48h，温度为20℃，IPTG的用量为95.32mg/L；添加物为咖啡酸甲酯时共发酵条件如下：发酵时间为24～48h，温度为30℃，IPTG的用量为95.32mg/L。

进一步的，所述步骤3具体过程如下：将发酵液在4℃条件下离心10min收集上清液；然后用乙酸乙酯萃取多次，即可获得阿魏酸或阿魏酸甲酯。

本发明的有益效果是：

(1)本发明无需对基因工程菌超声破碎，无需昂贵的镍亲和柱对LCCOMT重组蛋白进行亲和纯化、无需加入价格较高的S-腺苷甲硫氨酸，也无需透析袋等，因此成本更低；

(2)本发明采用基因工程酶体内转化方法，省去了提取LCCOMT重组酶的亲和层析、透析等过程，流程更短，操作更简单、工艺时间缩短；

(3)本发明不需要LCCOMT分离纯化，所以无需使用盐酸、镍亲和柱的处理需要碱性溶液，因此工艺更加环保；

(4)本发明工艺操作步骤较少、操作性更强、能够满足不同层次操作人员的要求。

附图说明

图1为本发明的工艺流程示意图。

图2为现有基因工程合成阿魏酸的工艺流程示意图。

图3为本发明实施例中得到阿魏酸的HPLC图。

图4为本发明实施例中得到阿魏酸甲酯的HPLC图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

如图1所示，一种基于酶法合成阿魏酸及阿魏酸甲酯方法的优化与改进，包括以下步骤：

步骤1：将含有质粒LCCOMT-pET28a的大肠杆菌BL21菌株进行活化；

基因工程菌的菌种来源：本实验中使用的基因工程菌是实验室保存的含有质粒LCCOMT-pET28a的大肠杆菌BL21菌株。

该菌株的制备方法如下(2015100756780，一种酶法合成阿魏酸的方法中详细公开了菌株的获取方法)：

1、用分别带有EcoR1和BamH1双酶切位点的引物(A1：CGCGGATCCATGAATACGGAGCTGATCCCACC；A2：CGGAATTCACATTAAGCAGATGCCAGACACCC)从川芎cDNA中通过PCR扩增出川芎COMT基因的全长阅读框；

2、将扩增出来的川芎COMT基因片段和pET28a分别用EcoR1和BamH1双酶切消化，获得两端带有粘性末端的片段；用T4DNA连接酶连接两个片段，体系为10*T4DNA ligasebuffer 2.5ul、双酶切后的川芎COMT DNA片段6ul、双酶切后的pET28a载体2ul、T4DNAligase 1ul，用灭菌的双蒸水补足25ul；16℃连接过夜；获得连接好的重组质粒；

3、取10ul重组质粒转化BL21感受态细胞。将转化成功的重组BL21基因工程菌涂布于含有50mg/L卡那霉素的平板中筛选阳性克隆；

4、将初步筛选出来的重组菌株用菌落PCR和质粒双酶切鉴定后，经测序以确定阅读框的正确，得到预期的重组菌株。

活化过程如下：

S11：将菌株在含浓度为10μg/ml卡那霉素(卡那霉素终浓度为10μg/mL)的LB固体培养基平板上划线接种，37℃恒温培养箱内倒置培养过夜；

S12：挑取单菌落接种至50mL含有卡那霉素终浓度为10μg/mL的LB液体培养基中进行初培养14～16h；

S13：吸取步骤S12得到的菌液800μL于1.5mL离心管中，加入150μL灭菌的甘油，即可在-80℃条件下长期保存。

步骤2：对步骤1得到的菌液进行扩大培养后，同时加入IPTG、咖啡酸进行共发酵；

取1mL过夜培养的重组菌株接种于100mL含10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/lNaCl、50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD 600＝0.6-0.8。

加入IPTG作为诱导剂LCCOMT的高效表达，IPTG的终浓度为1mol/L。同时加入底物咖啡酸或咖啡酸甲酯；其中咖啡酸的终浓度为0.2g/L，咖啡酸甲酯的终浓度为0.16g/L进行共发酵。

本发明中进行共发酵的条件为20～25℃，150rpm，共发酵培养10～12h。在此基础上进行正交试验，进而得到最佳的发酵条件。经过正交试验得到制备阿魏酸的最佳发酵条件为：发酵时间为24～48h，温度为20℃，IPTG的用量为95.32mg/L。经过正交试验得到制备阿魏酸甲酯的最佳发酵条件为：发酵时间为24～48h，温度为30℃，IPTG的用量为95.32mg/L。

步骤3：将共发酵后的发酵液离心，用乙酸乙酯萃取后即可得到阿魏酸或阿魏酸甲酯。

将获得的发酵液4℃条件下，13000g离心10min，收集上清液。用乙酸乙酯萃取4次，即获得阿魏酸或阿魏酸甲酯的粗品。

然后进行高相液相色谱检测

最后根据前期单因素实验结果，选择共发酵时间，共发酵温度与IPTG用量等三个主要参数运用正交设计助手进行L9(4³)正交实验。以期得到最适的共发酵工艺和共发酵效果。

对于正交实验得到的最佳工艺条件进行进一步探索发现共发酵时间对其产率有较大的影响，且具有较好的经济性。因此，后续实验经共发酵时间延长到了24和48h，以确定最终工艺条件。

将得到的阿魏酸及阿魏酸甲酯粗品经0.22μm的有机相超滤膜过滤，取滤液上清液进行高效液相色谱检测。高效液相色谱条件：色谱柱为依利特Hypersil ODS2(4.6mm×200mm，5μm)，上样量为10μL。

其中样品来源：咖啡酸、S-腺苷-L-甲硫酸铵(SAM)购自生工生物工程(上海)有限公司、咖啡酸甲酯标准品购于上海源叶生物科技有限公司、阿魏酸标准品购自成都市药检所、阿魏酸甲酯标准品购于成都克洛玛生物科技有限公司。

阿魏酸检测体系：流动相为0.1％的磷酸-甲醇(66:34)，流速：1mL/min，柱温30℃，检测波长为323nm。

阿魏酸甲酯检测体系：流动相为0.1％的磷酸-甲酯(55:45)，流速：1mL/min，柱温30℃，检测波长为330nm。

根据底物和产物积分后的峰面积来计算最后的产率。

正交实验优化：

根据前期单因素实验结果，选择共发酵温度，共发酵时间，IPTG用量等三个参数运用正交设计助手进行正交实验。采用L9(4³)正交表安排实验，实验结果见表1、表2和表3。

表1.正交实验因素及水平表

表2.阿魏酸正交实验结果

表3.阿魏酸甲酯正交实验结果

由上述正交实验结果可见，对于阿魏酸产率的影响大小顺序依次是：共发酵时间、IPTG用量、共发酵温度。由正交实验得出的最适基因工程菌株共发酵合成阿魏酸的结果是：共发酵时间18h、IPTG用量为95.32mg/L、共发酵温度20℃。实验结果显示在最适工艺条件下基因工程菌共发酵合成阿魏酸的产率可以达到39.19％、78mg/L。

对于阿魏酸甲酯产率的影响大小顺序分别是：IPTG用量、共发酵温度、共发酵时间。由正交实验得出的最适基因工程菌株共发酵合成阿魏酸的结果是：共发酵时间16h、IPTG用量95.32mg/L、共发酵温度30℃。实验结果显示在最优工艺条件下基因工程菌株共发酵合成阿魏酸甲酯的产率可以达到24.14％、78mg/L。

对于正交实验得到的最适工艺条件进一步探索发现共发酵时间对其产率有较大的影响，且具有较好的经济性。因此在后续实验中，我们固定发酵温度与IPTG用量，将共发酵时间分别延长至24h和48h。

阿魏酸的最终工艺条件：共发酵温度20℃、IPTG用量95.32mg/L、分别发酵24h和48h。实验结果显示共发酵24h后阿魏酸的产率可以达到48.43％(96.86mg/L)。共发酵48h后阿魏酸的产率可以达到89.85％(178mg/L)。

阿魏酸甲酯的最终工艺条件：共发酵温度30℃、IPTG用量95.32mg/L、分别发酵24h和48h。实验结果显示共发酵24h后阿魏酸甲酯的产率可以达到99.21％(158.4mg/L)。共发酵48h后阿魏酸的产率可以达到100％(160mg/L)。结果如表4所示。

表4.共发酵后阿魏酸和阿魏酸甲酯的产率

本发明采用基因工程酶体内转化方法，只需要在基因工程菌发酵的同时，加入诱导剂(IPTG)与底物咖啡酸和咖啡酸甲酯，无需加入价格昂贵的S-腺苷甲硫氨酸，发酵完成后，通过离心及萃取即可获得阿魏酸或阿魏酸甲酯粗品。与现有方法相比1、无需对基因工程菌超声破碎，所以无需购置超声破碎仪、无需昂贵的镍亲和柱(380元/g)对LCCOMT重组蛋白进行亲和纯化、无需加入价格较高的S-腺苷甲硫氨酸(24元/g)、无需透析袋(1cm内径，180元/米)等，因此成本更低。2、由于采用共发酵方法，采用了直接在菌体内进行生物合成，省去了提取LCCOMT重组酶的亲和层析、透析(24h)等过程。流程更短、操作更简单、工艺时间缩短。3、由于LCCOMT重组酶的分离纯化过程需要使用盐酸、镍亲和柱的处理需要碱性溶液，因此本工艺过程更加环保。4、由于本工艺操作步骤较少，操作性更强、能够满足不同层次操作人员的要求。因此本发明工艺简单、成本低、过程可控且更环保，具有重要的应用价值和良好的经济性。