一种3-羟基丙酸的补料发酵生产方法
阅读说明：本技术 一种3-羟基丙酸的补料发酵生产方法 (Supplementary fermentation production method of 3-hydroxypropionic acid ) 是由 王陶 李文 杨英歌 董玉玮 张传丽 于 2021-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种3-羟基丙酸的补料发酵生产方法,属于微生物发酵技术领域；本发明所用菌株为汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii.)菌株IS451,保藏号为：CGMCC No.11893；发酵过程分为三个阶段：第一阶段为接种后48h内,第二阶段为接种后的第49-96h,第三阶段为接种后的第97-114h,所述第二阶段进行补料操作,补料成分为：葡萄糖、(NH-(4))-(2)SO-(4)、丙酸和甘油；所述第三阶段进行补料操作,补料成分为：葡萄糖、丙酸和植物油；利用本发明的生产方法,使得3-羟基丙酸的发酵产量提升至58.39g/L,发酵周期降低至114h。(The invention discloses a supplemented material fermentation production method of 3-hydroxypropionic acid, belonging to the technical field of microbial fermentation; the strain used by the invention IS Debaryomyces hansenii (Debaryomyces hansenii.) strain IS451 with the preservation number: CGMCC No. 11893; the fermentation process is divided into three stages: the first stage is within 48 hours after inoculation, the second stage is 49-96 hours after inoculation, the third stage is 97-114 hours after inoculation, the second stage is subjected to feeding operation, and the feeding components are as follows: glucose, (NH) 4 ) 2 SO 4 Propionic acid and glycerol; the third stage is used for feeding, and the feeding components are as follows: glucose, propionic acid and vegetable oils; by using the production method, the fermentation yield of the 3-hydroxypropionic acid is increased to 58.39g/L, and the fermentation period is reduced to 114 h.)
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种3-羟基丙酸的补料发酵生产方法。
背景技术
3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid，又称β-Hydroxypropionic acid，缩写为3-HP)是三碳、无手性有机酸，与乳酸互为同分异构体。3-羟基丙酸具有羟基和羧基两个官能团，是很多光学活性物质的前体，它脱水可以生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，还原生成1，3-丙二醇，聚合生成高分子材料，是一种重要的化工平台产品。
目前，许多的高校和科研机构致力于微生物法合成3-HP的研宄，生物发酵法合成3-HP主要依赖于微生物体内己知的代谢通路。专利CN105861341A成功筛选出一株汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii.)菌株IS451，其3-羟基丙酸的发酵产量达到48.96g/L，发酵周期为5天，但将其应用于工业化生产仍需进一步提升其发酵产量，并且进一步缩短发酵周期，这对于企业节降生产成品和提高产能具有重要的现实意义。由于不同的微生物其新陈代谢和生长特点不同，因此，有必要对汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii.)菌株IS451的发酵调控进行优化，以提升其3-羟基丙酸的发酵产量，降低其发酵周期。
发明内容
本发明的目的是提供一种3-羟基丙酸的补料发酵生产方法，以解决上述现有技术存在的问题，使基于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii.)菌株IS451的3-羟基丙酸的发酵产量得以提升，并降低其发酵周期。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种3-羟基丙酸的补料发酵生产方法，所用菌株为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii.)菌株IS451，保藏号为：CGMCC No.11893；
发酵过程分为三个阶段：第一阶段为接种后48h内，第二阶段为接种后的第49-96h，第三阶段为接种后的第97-114h；
所述发酵过程第一阶段的发酵培养基包括：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、酵母粉5g/L、豆粕粉3g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、(NH4)2SO4 10g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、丙酸10-15g/L、甘油5-10g/L；
所述第二阶段进行补料操作，补料成分为：葡萄糖8g/L、(NH4)2SO4 5g/L、丙酸5g/L、甘油5g/L；
所述第三阶段进行补料操作，补料成分为：葡萄糖5g/L、丙酸5g/L、植物油15g/L。
进一步地，发酵调控包括以下步骤：
所述第一阶段的pH值控制为5.0-6.0，温度30℃，控制溶氧35-40％；
所述第二阶段的pH值控制为5.5-6.0，温度30℃，控制溶氧20-30％；
所述第三阶段的pH值控制为5.5-6.0，温度30℃，控制溶氧5-10％。
进一步地，在所述第二阶段的补料操作中，所述甘油在接种后第49h一次性加入，所述葡萄糖、(NH4)2SO4和丙酸在接种后第49h开始流加补料，流加时间为1.5-2h。
进一步地，在所述第三阶段的补料操作中，所述植物油在接种后第97h一次性加入，所述葡萄糖和丙酸在接种后第97h开始流加补料，流加时间为1.5-2h。
进一步地，所述补料发酵生产方法还包括菌种活化和种子培养操作。
进一步地，所述菌种活化所用斜面培养基为：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、蛋白胨20g/L、琼脂粉20g/L。
进一步地，所述种子培养所用种子培养基为：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、(NH4)2SO4 10g/L、酵母粉5g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、FeSO4·7H2O0.03g/L。
进一步地，所述第一阶段的初始发酵培养基中种子接种量为初始发酵培养基体积的10～15％。
进一步地，所述植物油包括菜籽油、花生油、大豆油或玉米油。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明使用速效氮源((NH4)2SO4)与迟效氮源(酵母浸膏、酵母粉和豆粕粉)相配合的发酵培养基配方，能够优化汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii.)菌株IS451的前期菌种生长和后期的产物积累；
(2)本发明通过分阶段补料的方式，使得培养基中的营养成分得到合理利用，提升了发酵后期产物的积累；
(3)本发明通过分阶段的pH值、温度和溶氧的调控，控制了菌种前期的生长繁殖速度，并合理调控了发酵中后期的产物稳定积累；
(4)本发明的发酵后期，发酵液过于粘稠，要想保证溶氧在设定的水平，需要大量提高转速，但转速过大产生的极强的剪切力对微生物的伤害过大，难以保证产物的正常积累，因此本发明在后期补料过程中加入了植物油，有利于增加发酵液中的溶氧量和提高氧的传递速率，此外还能将产物溶解到其中，发挥解除产物抑制的作用。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例所用菌株为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii.)菌株IS451，保藏号为：CGMCC No.11893。
实施例1
(1)菌种活化
将汉逊德巴利酵母菌株IS451接种于斜面培养基中进行活化，30℃恒温培养24h；以后重复2次，完成活化。
所用斜面培养基为：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、蛋白胨20g/L、琼脂粉20g/L。
(2)种子培养
将活化好的菌种接入种子液体培养基，在恒温振荡器中30℃培养48h，转速180r/min，制得IS451菌株种子液；
所用种子培养基为：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、(NH4)2SO4 10g/L、酵母粉5g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L。
(3)发酵培养
将IS451菌株种子液按照发酵培养基体积10％的接种量，接入发酵培养基中，该发酵培养基包括：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、酵母粉5g/L、豆粕粉3g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、(NH4)2SO4 10g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、丙酸12g/L、甘油6g/L。
之后，将发酵过程分为三个阶段进行调控：第一阶段为接种后48h内，第二阶段为接种后的第49-96h，第三阶段为接种后的第97-114h；
第一阶段：pH值控制为5.2，温度30℃，控制溶氧36％；
第二阶段：进行补料操作，补料成分为：葡萄糖8g/L、(NH4)2SO4 5g/L、丙酸5g/L、甘油5g/L，其中甘油在接种后第49h一次性加入，葡萄糖、(NH4)2SO4和丙酸在接种后第49h开始流加补料，流加时间为2h；本阶段pH值控制为5.6，温度30℃，控制溶氧25％；
第三阶段：进行补料操作，补料成分为：葡萄糖5g/L、丙酸5g/L、玉米油15g/L，其中植物油在接种后第97h一次性加入，葡萄糖和丙酸在接种后第97h开始流加补料，流加时间为2h；本阶段pH值控制为5.8，温度30℃，控制溶氧8％。
发酵培养114h后，放罐，取样，用高效液相色谱法(色谱柱：Ecosile C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：3％甲醇，用H3PO4调pH至2.0；检测条件：紫外检测器210nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL)检测发酵液中的3-羟基丙酸含量，结果为58.39g/L。
实施例2
(1)菌种活化
将汉逊德巴利酵母菌株IS451接种于斜面培养基中进行活化，30℃恒温培养24h；以后重复2次，完成活化。
所用斜面培养基为：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、蛋白胨20g/L、琼脂粉20g/L。
(2)种子培养
将活化好的菌种接入种子液体培养基，在恒温振荡器中30℃培养48h，转速180r/min，制得IS451菌株种子液；
所用种子培养基为：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、(NH4)2SO4 10g/L、酵母粉5g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L。
(3)发酵培养
将IS451菌株种子液按照发酵培养基体积15％的接种量，接入发酵培养基中，该发酵培养基包括：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、酵母粉5g/L、豆粕粉3g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、(NH4)2SO4 10g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、丙酸10g/L、甘油5g/L。
之后，将发酵过程分为三个阶段进行调控：第一阶段为接种后48h内，第二阶段为接种后的第49-96h，第三阶段为接种后的第97-114h；
第一阶段：pH值控制为5.0，温度30℃，控制溶氧35％；
第二阶段：进行补料操作，补料成分为：葡萄糖8g/L、(NH4)2SO4 5g/L、丙酸5g/L、甘油5g/L，其中甘油在接种后第49h一次性加入，葡萄糖、(NH4)2SO4和丙酸在接种后第49h开始流加补料，流加时间为1.5h；本阶段pH值控制为5.5，温度30℃，控制溶氧20％；
第三阶段：进行补料操作，补料成分为：葡萄糖5g/L、丙酸5g/L、玉米油15g/L，其中植物油在接种后第97h一次性加入，葡萄糖和丙酸在接种后第97h开始流加补料，流加时间为1.5h；本阶段pH值控制为5.5，温度30℃，控制溶氧5％。
发酵培养114h后，放罐，取样，用高效液相色谱法(色谱柱：Ecosile C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：3％甲醇，用H3PO4调pH至2.0；检测条件：紫外检测器210nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL)检测发酵液中的3-羟基丙酸含量，结果为56.70g/L。
实施例3
(1)菌种活化
将汉逊德巴利酵母菌株IS451接种于斜面培养基中进行活化，30℃恒温培养24h；以后重复2次，完成活化。
所用斜面培养基为：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、蛋白胨20g/L、琼脂粉20g/L。
(2)种子培养
将活化好的菌种接入种子液体培养基，在恒温振荡器中30℃培养48h，转速180r/min，制得IS451菌株种子液；
所用种子培养基为：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、(NH4)2SO4 10g/L、酵母粉5g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L。
(3)发酵培养
将IS451菌株种子液按照发酵培养基体积15％的接种量，接入发酵培养基中，该发酵培养基包括：葡萄糖20g/L、酵母浸膏10g/L、酵母粉5g/L、豆粕粉3g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、(NH4)2SO4 10g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、丙酸15g/L、甘油10g/L。
之后，将发酵过程分为三个阶段进行调控：第一阶段为接种后48h内，第二阶段为接种后的第49-96h，第三阶段为接种后的第97-114h；
第一阶段：pH值控制为5.5，温度30℃，控制溶氧40％；
第二阶段：进行补料操作，补料成分为：葡萄糖8g/L、(NH4)2SO4 5g/L、丙酸5g/L、甘油5g/L，其中甘油在接种后第49h一次性加入，葡萄糖、(NH4)2SO4和丙酸在接种后第49h开始流加补料，流加时间为1.5h；本阶段pH值控制为6.0，温度30℃，控制溶氧30％；
第三阶段：进行补料操作，补料成分为：葡萄糖5g/L、丙酸5g/L、玉米油15g/L，其中植物油在接种后第97h一次性加入，葡萄糖和丙酸在接种后第97h开始流加补料，流加时间为1.5h；本阶段pH值控制为6.0，温度30℃，控制溶氧10％。
发酵培养114h后，放罐，取样，用高效液相色谱法(色谱柱：Ecosile C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：3％甲醇，用H3PO4调pH至2.0；检测条件：紫外检测器210nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL)检测发酵液中的3-羟基丙酸含量，结果为57.91g/L。
实验例1
将实施例1中的玉米油替换为菜籽油、花生油、大豆油和蓖麻油，其它操作同实施例1，进行发酵培养，并检测各发酵液中的3-羟基丙酸含量，结果见表1。从表1可以看出，在第二阶段补加玉米油能够很好地提升发酵效果，这可能是因为玉米油中的脂肪酸的链长适合被菌体吸收，从而有利于3-羟基丙酸的生成；而补加蓖麻油反而大量降低了发酵液中的3-羟基丙酸含量，这可能与蓖麻油中的抗菌物质抑制了发酵液中的菌体生长有关。
表1
植物油
发酵液中的3-羟基丙酸含量，g/L
玉米油
58.39
菜籽油
55.85
花生油
56.41
大豆油
55.00
蓖麻油
50.02
对比例1
同实施例1，区别仅在于，发酵培养不进行补料操作，所有发酵培养基成分一次性加入，即发酵培养基为：葡萄糖33g/L、酵母浸膏10g/L、酵母粉5g/L，豆粕粉3g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、(NH4)2SO4 15g/L、MgSO4·7H2O 1g/L；FeSO4·7H2O 0.03g/L、丙酸22g/L、甘油11g/L、玉米油15g/L；pH值控制为5.0-6.0，温度30℃，不进行溶氧调控。
发酵培养114h后，放罐，取样，按照实施例1的方法检测发酵液中的3-羟基丙酸含量，结果为49.29g/L。
对比例2
同实施例1，区别仅在于，发酵培养不进行补料操作，所有发酵培养基成分一次性加入，即发酵培养基为：葡萄糖33g/L、酵母浸膏10g/L、酵母粉5g/L，豆粕粉3g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、(NH4)2SO4 15g/L、MgSO4·7H2O 1g/L；FeSO4·7H2O 0.03g/L、丙酸22g/L、甘油11g/L、玉米油15g/L。
发酵培养114h后，放罐，取样，按照实施例1的方法检测发酵液中的3-羟基丙酸含量，结果为52.71g/L。
对比例3
同实施例1，区别仅在于，第二阶段的补料操作未补入玉米油，通过提高转速的方式来达到设定溶氧量。
发酵培养114h后，放罐，取样，按照实施例1的方法检测发酵液中的3-羟基丙酸含量，结果为55.03g/L。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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