一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法及其应用
阅读说明：本技术 一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法及其应用 (Method for biosynthesizing phenolic acid compound by using lignin and application thereof ) 是由 肖盈 陈佳志 张靖雯 麦裕良 于 2021-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物合成技术领域,具体公开了一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法及其应用。方法包括以下步骤：将暹罗芽孢杆菌菌液和漆酶接种到Tris-HCl溶液中,并添加碱木质素得混合液,将混合液震荡培养,离心取上清液加入乙酸乙酯和盐酸溶液,超声提取,旋干,复溶,得到酚酸类化合物；所述菌液和漆酶的体积比为1:0.5～2(v/v)。利用本发明的方法其制备得到的高活性酚酸类化合物含量较高,且制备方法具有高效率、低成本及环境友好的优点,并且将暹罗芽孢杆菌菌液和漆酶以特定体积比复配,使得制备得到的酚酸类化合物含量较高,其酚酸类化合物还表现出优异的抗氧化活性和抑菌活性。(The invention relates to the technical field of biosynthesis, and particularly discloses a method for biosynthesizing a phenolic acid compound by using lignin and application thereof. The method comprises the following steps: inoculating Siamese bacillus bacterial liquid and laccase into a Tris-HCl solution, adding alkali lignin to obtain a mixed solution, carrying out shake culture on the mixed solution, centrifuging, taking supernate, adding ethyl acetate and a hydrochloric acid solution, carrying out ultrasonic extraction, carrying out spin drying, and redissolving to obtain a phenolic acid compound; the volume ratio of the bacterial liquid to the laccase is 1: 0.5-2 (v/v). The content of the high-activity phenolic acid compound prepared by the method is higher, the preparation method has the advantages of high efficiency, low cost and environmental friendliness, and the Siamese bacillus liquid and the laccase are compounded according to a specific volume ratio, so that the content of the prepared phenolic acid compound is higher, and the phenolic acid compound also shows excellent antioxidant activity and antibacterial activity.)
技术领域
本发明涉及生物合成技术领域，尤其是涉及一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法及其应用。
背景技术
酚酸类化合物，包括对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、原儿茶酸、没食子酸、鞣花酸、丹参素、丹酚酸、迷迭香酸等，其具有优异的抗氧化、抗炎、抗菌、美白淡斑、降血脂、抗肿瘤、防治心脑血管疾病等生物活性，在医药、食品保健、化妆品、动植物营养等领域有着广泛的应用。
木质素是自然界储量最丰富的芳香族化合物，地球每年可产生6×1014t左右木质素，是极具潜力的可再生碳资源。在我国工业生产中，木质素年产量超过1100万吨，部分用于燃烧供能、低值化工产品等，大量被遗弃，有效利用率不到20％，这造成生物质资源巨大浪费和生态环境污染。由于木质素本征结构中具有与酚酸类化合物相类似的结构单元，因此，以木质素为原料来制备酚酸类化合物是实现木质素废弃物高值利用的有效途径，且具有潜在技术可行性。
现有技术中，利用木质素制备酚酸类化合物多采用化学法，通过热解、气化、水解、还原和氧化等方法将木质素解聚成小分子酚类化合物，制备过程采用均相金属盐催化剂和有机溶剂，致使后续分离提取操作将产生大量废液、废渣等，造成环境污染，且生产后期污、废水处理成本高，而生物合成方法环保且经济。因此，亟待开发一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法及其应用，利用本发明的方法其制备得到的高活性酚酸类化合物含量较高，且制备方法具有高效率、低成本及环境友好的优点。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法，包括以下步骤：
将暹罗芽孢杆菌菌液和漆酶接种到Tris-HCl溶液中，并添加碱木质素得混合液，将混合液震荡培养，离心取上清液加入乙酸乙酯和盐酸溶液，超声提取，旋干，复溶，得到酚酸类化合物；
所述菌液和漆酶的体积比为1:0.5～2(v/v)。
在本发明的技术方案中，将暹罗芽孢杆菌菌液和漆酶接种到Tris-HCl溶液中，并添加碱木质素生物合成酚酸类化合物，其制备过程中不会导致产生大量的废液、废渣等，有利于环境的保护，并且本发明合成方法中原料少，成本低，效率高，有利于工业化生产。
本发明将暹罗芽孢杆菌菌液和漆酶以特定体积比复配，较好地转化木质素为酚酸类化合物，进而使得制备得到的酚酸类化合物(包括原儿茶酸、没食子酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等高活性酚酸类化合物)含量较高(10-30mg/g)，其酚酸类化合物还表现出优异的抗氧化活性和抑菌活性。
作为本发明所述利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法的优选实施方式，所述暹罗芽孢杆菌采用专利号为CN111040961A的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5，保藏编号为：CCTCC M 2019885。
当暹罗芽孢杆菌采用上述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5时，其与漆酶复配，可以提高酚酸类化合物的含量，且酚酸类化合物具有较佳的抗氧化和抑菌性能。
作为本发明所述利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法的优选实施方式，所述菌液和漆酶的体积比为1:0.5(v/v)。
当菌液和漆酶以体积比为1:0.5(v/v)复配时，更好地转化木质素为酚酸类化合物，进而制备得到的酚酸类化合物含量可达到25.6mg/g，且酚酸类化合物的抗氧化和抑菌性能最佳，IC50值为3.9mg/L，酚酸类化合物对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的最小抑制浓度分别为1.2500mg/mL、2.5000mg/mL和0.6250mg/mL。
作为本发明所述利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法的优选实施方式，所述碱木质素在混合液中的终浓度为1000mg/L。
作为本发明所述利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法的优选实施方式，所述暹罗芽孢杆菌菌液与Tris-HCl溶液的体积比为1:1。
更优选地，Tris-HCl溶液的浓度为50mM，pH 7.5。
作为本发明所述利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法的优选实施方式，将混合液于温度为20～40℃，速率为100～200r/min条件下振荡培养0.5～1天。
更优选地，将混合液于温度为30℃，速率为150r/min条件下振荡培养1天。
作为本发明所述利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法的优选实施方式，所述暹罗芽孢杆菌菌液的培养方法包括以下步骤：挑取暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5单菌落入LB液体培养基中预培养12～14h得预混液，将预混液于4000～5000r/min条件下离心2～5min后，再弃去上清液，留菌体用Tris-HCl溶液冲洗并重悬，得到浓度为105～106CFU/mL暹罗芽孢杆菌菌液。
作为本发明所述利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法的优选实施方式，所述LB液体培养基包括：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加蒸馏水定容至1L，pH 7.0。
第二方面，本发明提供了采用上述的方法制备得到的酚酸类化合物。
从功效评价实验结果上看，采用上述方法利用木质素生物合成具有高含量的酚酸类化合物，其酚酸类化合物表现较好的抗氧化活性及抑菌活性。
第三方面，本发明提供了上述酚酸类化合物在抑菌产品中的应用。
第四方面，本发明提供了上述酚酸类化合物在抗氧化产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明提供了一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法，制备方法简单，原料少，成本低，效率高，且绿色环保；
2)本发明将暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5菌液和漆酶以特定体积比复配，较好地转化木质素为酚酸类化合物，进而使得制备得到的酚酸类化合物(包括原儿茶酸、没食子酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等高活性酚酸类化合物)含量较高(10-30mg/g)，其酚酸类化合物还表现出优异的抗氧化活性和抑菌活性。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在本发明中，暹罗芽孢杆菌采用专利号为CN111040961A的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5，保藏编号为：CCTCC M 2019885，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2019年11月1日。
在以下实施例及对比例中，漆酶购于Sigma-Aldrich公司，货号SAE0050；LB液体培养基的配方包括：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加蒸馏水定容至1L，pH 7.0；当需要配置成LB固体培养基时，则还需要加入15g/L琼脂粉，高压蒸汽灭菌后即得。Tris-HCl溶液浓度为50mM，pH 7.5。
实施例1
一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法，包括以下步骤：
1)挑取暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5单菌落入LB液体培养基中预培养12h得预混液，将预混液于4000r/min条件下离心2min后，再弃去上清液，留菌体用Tris-HCl溶液冲洗并重悬，得到暹罗芽孢杆菌L5菌液，暹罗芽孢杆菌L5在菌液中的浓度为105～106CFU/mL，更优选地，暹罗芽孢杆菌L5在菌液中的浓度为106CFU/mL；
2)将500uL暹罗芽孢杆菌菌液和250uL漆酶接种到50mL Tris-HCl溶液的250mL三角瓶中，并添加碱木质素得混合液，使得碱木质素在混合液中的终浓度为1000mg/L，将混合液于温度为30℃，速率为150r/min条件下振荡培养1天，离心取上清液，加入50mL乙酸乙酯和2mL盐酸溶液，超声提取30min，45℃旋干，采用甲醇复溶，得到酚酸类化合物。
采用HPLC-UV分析酚酸类化合物中含有原儿茶酸、没食子酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸，总含量为25.6mg/g。
实施例2
一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法，包括以下步骤：
1)挑取暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5单菌落入LB液体培养基中预培养12h得预混液，将预混液于4000r/min条件下离心2min后，再弃去上清液，留菌体用Tris-HCl溶液冲洗并重悬，得到暹罗芽孢杆菌L5菌液，暹罗芽孢杆菌L5在菌液中的浓度为105～106CFU/mL；
2)将500uL暹罗芽孢杆菌菌液和500uL漆酶接种到50mL Tris-HCl溶液的250mL三角瓶中，并添加碱木质素得混合液，使得碱木质素在混合液中的终浓度为1000mg/L，将混合液于温度为30℃，速率为150r/min条件下振荡培养1天，离心取上清液，加入50mL乙酸乙酯和2mL盐酸溶液，超声提取30min，45℃旋干，采用甲醇复溶，得到酚酸类化合物。
采用HPLC-UV分析酚酸类化合物中含有原儿茶酸、没食子酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸，总含量为18.4mg/g。
实施例3
一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法，包括以下步骤：
1)挑取暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5单菌落入LB液体培养基中预培养12h得预混液，将预混液于4000r/min条件下离心2min后，再弃去上清液，留菌体用Tris-HCl溶液冲洗并重悬，得到暹罗芽孢杆菌L5菌液，暹罗芽孢杆菌L5在菌液中的浓度为105～106CFU/mL；
2)将500uL暹罗芽孢杆菌菌液和1mL漆酶接种到50mL Tris-HCl溶液的250mL三角瓶中，并添加碱木质素得混合液，使得碱木质素在混合液中的终浓度为1000mg/L，将混合液于温度为30℃，速率为150r/min条件下振荡培养1天，离心取上清液，加入50mL乙酸乙酯和2mL盐酸溶液，超声提取30min，45℃旋干，采用甲醇复溶，得到酚酸类化合物。
采用HPLC-UV分析酚酸类化合物中含有原儿茶酸、没食子酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸，总含量为16.2mg/g。
实施例4
一种利用木质素生物合成酚酸类化合物的方法，包括以下步骤：
1)挑取暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5单菌落入LB液体培养基中预培养14h得预混液，将预混液于5000r/min条件下离心5min后，再弃去上清液，留菌体用Tris-HCl溶液冲洗并重悬，得到暹罗芽孢杆菌L5菌液，暹罗芽孢杆菌L5在菌液中的浓度为105～106CFU/mL；
2)将500uL暹罗芽孢杆菌菌液和250uL漆酶接种到50mL Tris-HCl溶液的250mL三角瓶中，并添加碱木质素得混合液，使得碱木质素在混合液中的终浓度为1000mg/L，将混合液于温度为40℃，速率为200r/min条件下振荡培养1天，离心取上清液，加入50mL乙酸乙酯和2mL盐酸溶液，超声提取30min，45℃旋干，采用甲醇复溶，得到酚酸类化合物。
采用HPLC-UV分析酚酸类化合物中含有原儿茶酸、没食子酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸，总含量为23.5mg/g。
对比例1
与实施例1相比，对比例1的区别在于，不添加暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)L5和漆酶，其余参数、步骤与实施例1相同。
采用HPLC-UV分析，产物中没有检测到原儿茶酸、没食子酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等物质。
对比例2
与实施例1相比，对比例2的区别在于，步骤2)：将500uL暹罗芽孢杆菌菌液接种到50mL Tris-HCl溶液的250mL三角瓶中，其余参数、步骤与实施例1相同。
采用HPLC-UV分析酚酸类化合物中含有对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸，总含量为5.3mg/g。
对比例3
与实施例1相比，对比例3的区别在于，步骤2)：将250uL漆酶添加到50mL Tris-HCl溶液的250mL三角瓶中，其余参数、步骤与实施例1相同。
采用HPLC-UV分析酚酸类化合物中含有香草醛、丁香醛，总含量为1.1mg/g。
试验例
1、酚酸类化合物组成的HPLC-UV分析方法
准确称取50mg实施例1-4及对比例1-3制备的酚酸类化合物样品，用色谱级甲醇定容至25mL，超声10min使酚酸类化合物完全溶解，用HPLC-UV定量分析酚酸类化合物活性成分含量：色谱柱采用C18柱，以乙腈/0.1％磷酸水溶液为流动相，272nm为检测波长，用标准曲线法计算各活性成分的量。
2、抗氧化功效评价方法
DPPH·自由基清除：配置0.01,0.025,0.05,0.1mg/mL待测样品甲醇溶液，依次移取3.0ml实施例1-4及对比例1-3待测酚酸类化合物样品溶液于10ml比色管中，分别加入3.0ml 0.15mM的DPPH·甲醇溶液，摇匀，室温避光反应30min，在517nm处测量样品的吸光度值A1；同样条件，甲醇代替DPPH·溶液测定本底吸光度值A2；样品溶剂代替样品测定空白值A0。DPPH·的清除率(％)＝(A0-(A1-A2))/A0*100％。DPPH·清除率与待测样品浓度拟合曲线，DPPH·清除率为50％时待测样品的浓度，即得到IC50值。
3、抑菌功效评价方法
采用二倍稀释法，测定实施例1-4及对比例1-3制备的酚酸类化合物抑制菌株的最小抑制浓度(MIC)值，实验菌株为铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。将不同质量浓度的酚酸类化合物提取液添加到LB培养基中，摇匀，配成酚酸类化合物终浓度为40.0000、20.0000、10.0000、5.0000、2.5000、1.2500、0.6250、0.3125mg/mL的培养基。取0.20mL浓度为106-107CFU/mL菌液，于培养基中30℃恒温培养24h。以不含酚酸类化合物的LB培养基为空白对照，以无细菌生长的样液最低浓度为MIC。
结果如表1所示。
表1
从表1的数据可知，经过HPLC-UV分析，采用本发明实施例1-4的方法制备的酚酸类化合物中含有原儿茶酸、没食子酸、对香豆酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸，总含量可高达25.6mg/g；且酚酸类化合物的抗氧化和抑菌性能较佳，其中以实施例1为最佳实施例，采用实施例1的方法制备的酚酸类化合物其IC50值为3.9mg/L，酚酸类化合物对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的最小抑制浓度分别为1.2500mg/mL、2.5000mg/mL和0.6250mg/mL。
与实施例1相比，对比例1的方法中不添加暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5和漆酶，其经过HPLC-UV分析，产物中没有检测到原儿茶酸、没食子酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸，说明没有转化木质素生成酚酸类化合物；对比例2或3只添加暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5和漆酶其中一种时，其获得的酚酸类化合物总含量远差于实施例1-4，并且IC50值及菌株的最小抑制浓度(MIC)值较高，说明酚酸类化合物的抗氧化活性及抑菌活性较差，说明暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5和漆酶的复配，可以较好地转化木质素为酚酸类化合物，使得制备得到的酚酸类化合物(包括原儿茶酸、没食子酸、香草醛、丁香醛、对羟基苯甲酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等高活性酚酸类化合物)含量较高，提高酚酸类化合物抗氧化活性和抑菌活性。当菌液和漆酶的体积比不在本发明范围内，则酚酸类化合物总含量会下降，抗氧化性能及抑菌性能也会减弱。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。