一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法
阅读说明：本技术 一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法 (Method for synthesizing phenyllactic acid by using semi-hydrophobic crystal gum base whole-cell catalyst in bioreactor ) 是由 张玮 李亦斌 楼小玲 贠军贤 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法,所述的方法是在搅拌式生物反应器内,以半疏水阴离子交换晶胶作为载体,通过将副干酪乳杆菌细胞固载在晶胶上形成高菌体浓度的全细胞催化剂,将晶胶投入生物反应器内进行悬浮培养,通过减轻底物抑制,提高转化过程的生物量,进而提高苯乳酸的产量。本发明提供的方法比常规游离细胞转化所得的苯乳酸的产量高,转化过程简单,操作方便,安全性好,放大容易,在苯乳酸制备领域具有广泛的应用前景。(The invention discloses a method for synthesizing phenyllactic acid by using a semi-hydrophobic crystal gum base whole-cell catalyst in a bioreactor, which is characterized in that semi-hydrophobic anion exchange crystal gum is used as a carrier in a stirring bioreactor, lactobacillus paracasei cells are immobilized on the crystal gum to form a whole-cell catalyst with high thallus concentration, the crystal gum is put into the bioreactor for suspension culture, and the biomass in the conversion process is improved by reducing substrate inhibition, so that the yield of the phenyllactic acid is improved. Compared with the conventional free cell transformation method, the method provided by the invention has the advantages of high yield of the phenyllactic acid, simple transformation process, convenience in operation, good safety, easiness in amplification and wide application prospect in the field of phenyllactic acid preparation.)
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法。
背景技术
苯乳酸是一种新型高值有机酸，有很好的抗菌抑菌作用，也是合成聚苯乳酸新材料的重要单体，被广泛应用于食品、化工、生物、制药等领域。
目前苯乳酸的制备方法存在一定的弊端，化学合成法路径复杂，易产生副产物、环境污染严重；传统生物合成法成本高、产率低，高产菌株缺乏。
利用超大孔隙晶胶载体固载副干酪乳杆菌细胞形成生物催化剂，在生物反应器内转化合成苯乳酸副产物较少、对环境污染小、成本较低、催化效率较高，为苯乳酸的合成提供了新的方向。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明目的在于提供一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于将副干酪乳杆菌细胞固载在半疏水阴离子交换晶胶上形成高浓度全细胞催化剂，然后将固载有副干酪乳杆菌细胞的晶胶投入到含有转化液的搅拌式生物反应器内进行悬浮培养，催化转化合成苯乳酸。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1）将副干酪乳杆菌菌株在MRS培养基中经过两次活化得到种子液，将种子液接至MRS培养基中，进行静置培养；
2）将干燥的半疏水阴离子交换晶胶投入步骤1）所得含有种子液的MRS培养基中，静置培养得到种子晶胶；
3）将步骤2）所得种子晶胶再次投入MRS培养基中，继续静置培养得到高浓度全细胞催化剂，所述高浓度全细胞催化剂为固载了副干酪乳杆菌细胞的晶胶；
4）将步骤3）所得高浓度全细胞催化剂透性化处理后，投入到含有转化液的搅拌式生物反应器内进行悬浮培养，通过全细胞催化将转化液中的苯丙氨酸转化合成苯乳酸。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于所述的半疏水阴离子交换晶胶为聚甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸丁酯基阴离子交换球状晶胶载体，其直径2.0~5.0mm，有效孔隙率为74%~85%。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1）种子液接种到MRS培养基中，种子液的体积为MRS培养基体积的1~3%，优选为2%；步骤1）中，培养的温度为33~37℃，优选为35℃，静置培养的时间为10~14 h，优选为12 h。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤2）半疏水阴离子交换晶胶投入到MRS培养基中，所述晶胶的体积为MRS培养基体积的4~8%，优选为6%；步骤2）中，静置培养的温度为33~37 ℃，优选为35 ℃，静置培养的时间为14~18 h，优选为16 h。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤3）种子晶胶载体投入到MRS培养基中，静置培养的时间为36~60 h，优选为48 h。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤4）固载了副干酪乳杆菌细胞的晶胶投入到转化液中，所述晶胶体积为所述转化液体积的1~5%，优选为2%。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤4）利用搅拌式生物反应器进行悬浮培养，悬浮培养在搅拌下进行，搅拌转速为60~140 rpm，优选为80 rpm，催化转化的温度为33~37 ℃，优选为35 ℃，催化转化的时间为12~84 h。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤4）所述转化液中含有葡萄糖、苯丙氨酸和副干酪乳杆菌菌体成分，其中葡萄糖浓度在1~3 mg/mL，苯丙氨酸浓度在0.8~1.5mg/mL，副干酪乳杆菌菌体浓度80~120mg/mL。
所述的一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤4）中，透性化处理的过程为：在-18~ -25℃下冷冻5~8h后，常温解冻。
通过采用上述技术，本发明具有如下有益效果：
1）本发明提供的方法，以阴离子交换晶胶作为载体，将副干酪乳杆菌细胞固载在晶胶上形成高浓度全细胞催化剂，利用搅拌式生物反应器进行悬浮培养，通过减轻底物抑制，提高转化过程的生物量，增加苯乳酸的产量。通过本发明的方法合成苯乳酸的产量比常规游离细胞转化合成的苯乳酸产量高，由于细胞吸附于晶胶载体，转化液中细胞浓度低，粘度小，苯乳酸分离容易。转化完成后，转化液的后续分离可以采用常规分离方法，如吸附、结晶、晶胶层析、钙盐沉淀等。
2）本发明提供的方法，晶胶载体孔隙率高，孔径大，底物和产物的传质和扩散迅速，晶胶作为菌体细胞的载体，可以提高细胞表面酶系的稳定性，减小底物抑制。
3）本发明提供的方法，需要在搅拌式生物反应器内，通过悬浮培养进行。转化过程简单，操作方便，安全性好，放大容易，在生物化工合成领域有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
一种在生物反应器内利用半疏水晶胶基全细胞催化剂合成苯乳酸的方法，包括以下步骤：
1）配置MRS培养基，经过121 ℃灭菌20 min。将保藏的副干酪乳杆菌菌株接种至10mL的MRS液体培养基中，35 ℃静置培养12 h，再以2%的接种量接种于液体MRS培养基中，35℃静置培养12 h，二次活化得到种子液体。将种子液按体积分数6%的接种量接种于500 mL的MRS液体培养基中，35 ℃静置培养12 h，得到含有种子液的MRS培养基；
2）按培养基体积分数的6%量取晶胶载体，晶胶载体为聚甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸丁酯基阴离子交换晶胶微球载体，其直径2.6~4.3 mm，有效孔隙率为76%，绝干孔隙率为88%。将晶胶载体投入步骤1）所得含有种子液的MRS培养基中，35 ℃静置培养16 h，得到种子晶胶；然后将种子晶胶再次投入MRS培养基中，35 ℃静置培养48h，制备成全细胞催化剂；在-20 ℃下冷冻6 h，常温解冻，然后投入到含有5 L转化液的搅拌式生物反应器内，转化液中副干酪乳杆菌菌体浓度100 mg/mL，葡萄糖浓度2 mg/mL，苯丙氨酸浓度1 mg/mL。设定转化温度35 ℃，搅拌转速60 rpm，转化时间84 h，离心后取上清液，检测转化液中苯乳酸含量为0.11 mg/mL，计算结果为苯乳酸的转化率为11%。
实施例2
实验步骤重复实施例1，不同之处仅在于“步骤2）中，搅拌式生物反应器内搅拌转速替换为80 rpm”，其余步骤重复实施例1，反应结束后、离心取上清液，检测转化液中苯乳酸含量，计算结果为苯乳酸的转化率为18%。
实施例3
实验步骤重复实施例1，不同之处仅在于“步骤2）中，搅拌式生物反应器内搅拌转速替换为100 rpm”，其余步骤重复实施例1，反应结束后、离心取上清液，检测转化液中苯乳酸含量，计算结果为苯乳酸的转化率为15%。
实施例4
实验步骤重复实施例1，不同之处仅在于“步骤2）中，搅拌式生物反应器内搅拌转速替换为120 rpm”，其余步骤重复实施例1，反应结束后、离心取上清液，检测转化液中苯乳酸含量，计算结果为苯乳酸的转化率为14%。
实施例5
实验步骤重复实施例1，不同之处仅在于“步骤2）中，搅拌式生物反应器内搅拌转速替换为140 rpm”，其余步骤重复实施例1，反应结束后、离心取上清液，检测转化液中苯乳酸含量，计算结果为苯乳酸的转化率为14%。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。