阅读说明：本技术 一种多酶级联生产(r/s)-羟基蛋氨酸的方法 (Method for producing (R/S) -hydroxymethionine by multienzyme cascades ) 是由 刘立明 刘佳 张灿 宋伟 罗秋玲 陈修来 高聪 叶超 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多酶级联生产(R/S)-羟基蛋氨酸的方法,属于生物工程技术领域。本发明利用一锅法同步反应催化蛋氨酸生产(R)-HMTBA,通过分批补料解除底物抑制,转化周期由23h缩短至15h,(R)-HMTBA产量可达到97.0g/L,ee>99％,蛋氨酸摩尔转化率达到96.3％；利用一锅法同步反应催化蛋氨酸生产(S)-HMTBA,通过分批补料解除底物抑制,转化周期由23h缩短至18h,(S)-HMTBA产量可达到98.0g/L,ee>99％,蛋氨酸摩尔转化率达到98.6％。(The invention discloses a method for producing (R/S) -hydroxymethionine by multienzyme cascades, which belongs to the technical field of bioengineering and utilizes pot method synchronous reaction to catalyze methionine to produce (R) -HMTBA, substrate inhibition is removed by batch feeding, the conversion period is shortened from 23h to 15h, the yield of the (R) -HMTBA can reach 97.0g/L, ee is more than 99 percent, and the mol conversion rate of the methionine reaches 96.3 percent, utilizes pot method synchronous reaction to catalyze the methionine to produce (S) -HMTBA, substrate inhibition is removed by batch feeding, the conversion period is shortened from 23h to 18h, the yield of the (S) -HMTBA can reach 98.0g/L, ee is more than 99 percent, and the mol conversion rate of the methionine reaches 98.6 percent.)

一种多酶级联生产(R/S)-羟基蛋氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种多酶级联生产(R/S)-羟基蛋氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

羟基蛋氨酸(2-Hydroxy-4-(methylthio)butanoic acid，HMTBA)，学名为2-羟基-4-甲硫基丁酸，又称蛋氨酸羟基类似物，分子式为C₅H₁₀O₃S，相对分子质量为150.196。因其α碳为手性碳，所以存在两种不同的立体异构体：(R)-羟基蛋氨酸、(S)-羟基蛋氨酸(图1)。羟基蛋氨酸的钙盐形式是组成复方α-酮酸片的成分之一，用于治疗肾功能衰竭；同时在体内可转化为L-蛋氨酸，因此广泛应用于畜禽的饲料添加剂中。

羟基蛋氨酸的合成方法主要有化学合成法和酶转化法。化学法从头合成HMTBA，包括氰醇和酯的水解、丁二烯氧化法等：(1)氰醇水解法就是利用甲硫醇与丙烯醛反应合成3-甲硫基丙醛，随后和***反应生产2-羟基-4-甲硫基丁腈，最后利用65％～70％的盐酸或硫酸经过两步水解反应即可生成HMTBA；(2)酯水解法利用(1)方法得到的2-羟基-4-甲硫基丁腈在98℃下经氧化锰或四硼酸钠催化生成2-羟基-4-甲硫基丁酰胺，再与甲酸甲酯反应得到2-羟基-4-甲硫基丁酸甲酯，最后在95℃条件下使用H₂SO₄水解5h即可制备羟基蛋氨酸；该方法可避免硫酸铵的生成，但是合成过程复杂；(3)丁二烯氧化法以丁二烯作为原料，经多步化学氧化得到2-羟基-4-甲硫基丁醇，后经过戈登式菌或红球菌的氧化得到羟基蛋氨酸，该过程避免使用剧毒物质氢氰酸，但是最后氧化步骤的反应慢。上述化学合成法反应需在高温下进行，使用硫酸等强酸，因此能量需求高，造成设备腐蚀，且以有毒的丙烯醛、甲硫醇等作为原料，严重限制了HMTBA在食品和医药行业的应用。

相比化学合成法，酶转化具有很多的优势，例如在常温常压的条件下进行操作，很少使用有毒的化学物质。利用结构简单的L-蛋氨酸为底物，更加安全无毒。自然界不存在直接催化氨基酸合成羟基酸的酶，需要两个转化过程：(1)L-蛋氨酸向酮蛋氨酸的转化；(2)酮蛋氨酸向羟基蛋氨酸的转化。Busto等结合两个转化过程设计了多酶级联反应：分别在大肠杆菌中表达来源于Proteus myxofaciens的L-氨基酸脱氨酶将L-蛋氨酸转化为酮蛋氨酸，表达来源于Lactobacillus paracasei DSM的D-异己酸还原酶和FDH催化酮蛋氨酸合成(R)-HMTBA；表达来源于Lactobacillus confuses的L-异己酸还原酶用于转化酮蛋氨酸生产(S)-HMTBA，并伴随FDH介导的辅酶循环系统。一锅法以同步级联催化的模式，转化14h，(R/S)-HMTBA的产量为30g/L，转化率为99％。发明人团队的张灿分别在大肠杆菌中表达来源于Proteus vulgaris的L-氨基酸脱氨酶将L-蛋氨酸转化为酮蛋氨酸，表达来源于Pediococcus acidilactici的D-乳酸脱氢酶和来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶构用于催化酮蛋氨酸合成(R)-羟基蛋氨酸；表达来源于选择来源于Bacillus coagulans的L-乳酸脱氢酶和来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶用于转化酮蛋氨酸生产(S)-HMTBA，一锅法以分步级联催化的模式，反应23h，最终(R)-HMTBA和(S)-HMTBA产量达到97.6g/L和96.4g/L，转化率分别达到96.9％和95.8％。反应体系复杂，其中涉及三种酶和两种底物，最终转化为单一目标产品(R/S)-HMTBA。然而，催化剂选择性、反应相容性和反应的协同作用是限制生产力和转化率的重要瓶颈，因此需要对反应条件进行精确调整和优化。

发明内容

本发明旨在通过对转化的反应条件进行优化，缩短转化周期，减少湿细胞的添加量，进一步降低HMTBA的生产成本，以期适用于工业化生产(R/S)-HMTBA。

本发明的第一个目的是提供一种转化生产HMTBA的方法，是以蛋氨酸为底物，利用L-氨基酸脱氨酶、甲酸脱氢酶和立体选择性脱氢酶同步级联催化蛋氨酸生成酮蛋氨酸，所述立体选择性脱氢酶包括R-立体选择性脱氢酶或S-立体选择性脱氢酶，所述转化的体系包括(1)或(2)：

(1)蛋氨酸、甲酸盐、表达L-氨基酸脱氨酶的全细胞、共表达R-立体选择性脱氢酶和甲酸脱氢酶的全细胞和NAD⁺；所述蛋氨酸的浓度为5～30g/L，所述蛋氨酸与甲酸盐摩尔比为1:1.5～2.5，所述表达L-氨基酸脱氨酶的全细胞的浓度为10～20g/L，所述共表达R-立体选择性脱氢酶和甲酸脱氢酶的全细胞的浓度为10～20g/L，所述NAD⁺的浓度为0.3～0.6mmol/L，转化过程中分批次将蛋氨酸与甲酸盐按照摩尔比1:1.5～2.5间歇补料到转化体系中，维持蛋氨酸浓度为5～30g/L；

(2)蛋氨酸、甲酸盐、表达L-氨基酸脱氨酶的全细胞、共表达S-立体选择性脱氢酶和甲酸脱氢酶的全细胞和NAD⁺；所述蛋氨酸的浓度为10～30g/L，所述蛋氨酸与甲酸盐摩尔比为1:1.5～2.5，所述表达L-氨基酸脱氨酶的全细胞的浓度为15～20g/L，所述共表达S-立体选择性脱氢酶和甲酸脱氢酶的全细胞的浓度为15～20g/L，所述NAD⁺的浓度为0.4～0.8mmol/L，转化过程中分批次将蛋氨酸与甲酸盐按照摩尔比1:1.5～2.5间歇补料到转化体系中，维持蛋氨酸浓度为5～35g/L。

进一步地，所述转化体系中还包括pH 7.0～8.0的Tris-HCl溶液。

进一步地，(1)中所述转化的温度为25～32℃，pH为7.0～8.0，转化时间为15～18h，转速为500～600rpm，通气量为1～2vvm。

进一步地，(2)中所述转化的温度为25～32℃，pH为7.0～8.0，转化时间为18～20h，转速为500～600rpm，通气量为1～2vvm。

进一步地，转化过程中利用了辅酶再生体系，所述辅酶再生体系是以甲酸盐为底物，通过甲酸脱氢酶将NAD⁺转化为NADH的辅酶再生系统。

进一步地，所述甲酸盐包括甲酸钠或甲酸铵。

进一步地，所述L-氨基酸脱氨酶的来源包括但不限于普通变形杆菌(Proteusvulgaris)。

进一步地，所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码所述L-氨基酸脱氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述R-立体选择性脱氢酶为D-乳酸脱氢酶。

进一步地，所述D-乳酸脱氢酶的来源包括但是不限于乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

进一步地，所述D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码所述D-乳酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，所述S-立体选择性脱氢酶为L-乳酸脱氢酶。

进一步地，所述L-乳酸脱氢酶的来源包括但是不限于凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。

进一步地，所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述L-乳酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步地，所述甲酸脱氢酶的来源包括但是不限于假丝酵母(Candidaboidinii)。

进一步地，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码所述甲酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步地，所述R-立体选择性脱氢酶或S-立体选择性脱氢酶和甲酸脱氢酶在同一大肠杆菌中表达。

进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的有益效果为：

(1)本发明利用一锅法同步反应催化蛋氨酸生产(R)-HMTBA，通过分批补料解除底物抑制，转化周期由23h缩短至15h，(R)-HMTBA产量可达到97.0g/L，ee>99％，蛋氨酸摩尔转化率达到96.3％；利用一锅法同步反应催化蛋氨酸生产(S)-HMTBA，通过分批补料解除底物抑制，转化周期由23h缩短至18h，(S)-HMTBA产量可达到98.0g/L，ee>99％，蛋氨酸摩尔转化率达到97.3％。

(2)转化底物为价格低廉的蛋氨酸，通过高密度发酵大量制备转化所需的甲酸脱氢酶、L-氨基酸脱氨酶、R-立体选择性脱氢酶或S-立体选择性脱氢酶，利用全细胞进行转化，操作简便，下游纯化简易，可建立一个高效节能、易于工业化放大生产的生物酶法合成HMTBA的工艺。

附图说明

图1：(R/S)-羟基蛋氨酸的化学结构。

图2：SDS-PAGE验证L-氨基酸脱氨酶表达菌株；M：DNA Marker；泳道1：PvLAAD菌株。

图3：SDS-PAGE验证D/L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达工程菌株；(a)中，M：DNAMarker；泳道1：CbFDH-PaDLDH；(b)中，M：DNA Marker；泳道1：CbFDH-BaLLDH。

图4：分步级联催化生产(R)-HMTBA。

图5：一次性投料同步级联催化生产(R)-HMTBA。

图6：分批补料同步级联催化生产(R)-HMTBA。

图7：分步级联催化生产(S)-HMTBA。

图8：一次性投料同步级联催化生产(S)-HMTBA。

图9：分批补料同步级联催化生产(S)-HMTBA。

具体实施方式

下述实验都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。

样品预处理：取转化液12000rpm离心10min收集上清液，并以(R/S)-HMTBA作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法检测。

酮蛋氨酸和(R/S)-HMTBA含量的测定：高效液相色谱法，流动相成分：5mmol/L稀硫酸，流速0.6mL/min；色谱柱：Aminex HPX-87H Ion Exclusion Column，300×7.8mm；检测器：紫外检测器，波长为210nm。

(R/S)-HMTBA的手性鉴定：高效液相色谱法，流动相成分：0.1％三乙胺溶液(用磷酸调节pH到3.0)/纯甲醇体积比＝4：6，流速：0.2mL/min；色谱柱：CHIRALPAK IG-3,0.46cmI.D.×25cm L×3μm；检测器：紫外检测器，波长205nm；ee＝(C_R-C_S)/(C_R+C_S)(其中CR和CS分别为R-异构体和S-异构体峰面积)。

氨基酸脱氨酶酶活力的测定方法：称取0.5g湿菌体于250mL锥形瓶中，加入30mL预热的L-蛋氨酸溶液，30℃、200rpm的摇床中反应15min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。酶活单位定义为1min内转化生成1μmol酮蛋氨酸所需的酶量。

R/S-立体选择性脱氢酶酶活力的测定方法：使用紫外分光光度计法测定，反应体系(200μL)：Tris-HCl 100mM pH 7.0，L-蛋氨酸20mM，NADH 0.25mM共计180μL，加入适当稀释后的D/L-乳酸脱氢酶20μL，反应10min取样检测生产的(R/S)-HMTBA的浓度。酶活单位(U)定义为每分钟生产1μmol(R/S)-HMTBA所需要的酶量。

甲酸脱氢酶酶活力的测定方法：

使用紫外分光光度计法测定，反应体系(200μL)：反应预混液中含有pH 7.5，0.167mmol/L的甲酸钠溶液和1.67mmol/L NAD⁺。加入20μL适量稀释的待测样品，启动反应并计时，在340nm下每30秒记录一次吸光值。酶活单位(U)定义为每分钟产生1μmol NADH所需要的酶量。

实施例1：表达氨基酸脱氨酶的工程菌PvLAAD的构建

对编码来源于普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)的基因进行密码子优化，以更好地适应大肠杆菌表达系统，优化后的基因序列如SEQ ID NO:1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。将人工合成的含有BamHI和XhoI酶切位点的L-AAD基因片段进行双酶切，将该基因连接至同样进行双酶切后的表达载体pET28a，得到表达质粒pET28a-LAAD；将构建好的表达质粒pET28a-LAAD导入E.coli BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB平板中培养过夜，筛选阳性克隆进行测序验证，选出目的基因完全正确的菌株，SDS-PAGE蛋白胶电泳验证如图2，表达氨基酸脱氨酶的工程菌PvLAAD构建成功。

实施例2：R/S-立体选择性脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达菌株的构建

对编码来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶(FDH)的基因进行密码子优化，使得基因序列更适应大肠表达系统，优化后的基因序列如SEQ ID NO:3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。将人工合成的含有BamHI和SalI酶切位点的fdh基因片段进行双酶切，然后与同样双酶切后得到的表达载体pET28a相连接，构建重组质粒pET28a-FDH。

(1)D-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达菌株的构建：以编码来源于乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)中的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)的基因为模板，利用特异性引物(D-LDH-1:5`-ACGGTCGACAAAGAGGAGAAAAAGCTTATGAAGATTATTGCTTATGGAATTC-3`；D-LDH-2:5`-ACGCCTCGAGTCAGTCAAACTTAACTTCATTCTTT-3`)扩增出两端含有Sal I和Xho I同时带有特定rbs的编码D-乳酸脱氢酶的基因(基因序列如SEQ ID NO:2所示，编码的氨基酸序列如SEQID NO:7所示)，用Xho I和Sal I双酶切pET28a-FDH质粒和上述编码D-乳酸脱氢酶的基因片段，过夜连接，并转化至大肠杆菌BL21中，在含有卡那霉素的LB平板中培养过夜，筛选阳性克隆进行测序验证，SDS-PAGE蛋白胶电泳验证如图3a，共表达R-立体选择性的脱氢酶和甲酸脱氢酶的基因工程菌株CbFDH-PaDLDH构建成功。

(2)L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达菌株的构建：以编码来源于凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)中的L-乳酸脱氢酶(L-LDH)的基因为模板，利用特异性引物L-LDH-1和L-LDH-2(L-LDH-1:5`-ACGGTCGACAAAGAGGAGAAAAAGCTTATGAAAAAGGTCAATCGTATTGCAG-3`；L-LDH-2:5`-ACGCCTCGAGTTACAATACAGGTGCCATCGTTTCT-3`)扩增出两端含有Sal I和Xho I同时带有特定rbs的编码L-乳酸脱氢酶的基因(基因序列如SEQ ID NO:4所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)，用Xho I和Sal I双酶切pET28a-FDH质粒和上述编码L-乳酸脱氢酶的基因片段，过夜连接，并转化至大肠杆菌BL21中，在含有卡那霉素的LB平板中培养过夜，筛选阳性克隆进行测序验证，SDS-PAGE蛋白胶电泳验证如图3b，共表达S-立体选择性的脱氢酶和甲酸脱氢酶的基因工程菌株CbFDH-BaLLDH构建成功。

实施例3：基因工程菌株的高密度发酵培养

(1)种子培养基配方：LB培养基，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

发酵培养基的成分为：甘油4g/L，酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，K₂HPO₄ 12.54g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L。

补料培养基的成分为：甘油600g/L，酵母粉30g/L。

(2)将基因工程菌PvLAAD和CbFDH-PaDLDH分别按照5％接种量接种于发酵培养基(添加100mg/L Kan(过滤除菌))，在通气量2.0vvm，温度37℃，搅拌速率400rpm，此时设定溶氧为100％，当培养至OD₆₀₀在14.0左右，将温度下降至20℃，加入12g/L乳糖诱导目标蛋白的表达，当溶氧突然上升时开始添加补料培养基，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在25～40％，发酵培养20h结束发酵。测定酶活力，氨基酸脱氨酶、D-乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶的酶活力分别为1.45U/mg、3.94U/mg、0.75U/mg。

(3)将基因工程菌PvLAAD和CbFDH-BaLLDH分别按照5％接种量接种于发酵培养基(添加100mg/L Kan(过滤除菌))，在通气量2.0vvm，温度37℃，搅拌速率5000rpm，此时设定溶氧为100％，当培养至OD₆₀₀在14.0左右，将温度下降至25℃，加入10g/L乳糖诱导目标蛋白的表达，当溶氧突然上升时开始添加补料培养基，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在25～45％，发酵培养20h结束发酵。测定酶活力，氨基酸脱氨酶、L-乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶的酶活力分别为1.50U/mg、2.89U/mg、0.71U/mg。

实施例4：分步级联催化生产(R)-HMTBA

离心分别收集实施例3得到的PvLAAD和CbFDH-PaDLDH发酵菌体用于催化生产(R)-HMTBA，转化体系为：第一阶段为将100g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，pH 7.5Tris-HCl，在600rpm、2vvm、25℃条件下，转化14h；第二阶段为向转化体系中再加入20g/L CbFDH-PaDLDH湿菌体，85g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，在30℃下继续反应9h。反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸、酮蛋氨酸和(R)-HMTBA的含量。

转化过程曲线如图4所示：第一阶段，100g/L的L-蛋氨酸，转化14h，中间产物酮蛋氨酸的转化率为99.0％，此时反应到达终点，升高温度到30℃，进行第二阶段的反应，进一步转化9h后(R)-HMTBA为97.3g/L，检测生产的(R)-HMTBA的光学纯度ee＞99％，L-蛋氨酸向(R)-HMTBA的转化率为96.6％，(R)-HMTBA的生产强度为4.23g/L/h。

实施例5：分步级联催化生产(S)-HMTBA

离心分别收集实施例3得到的PvLAAD和CbFDH-BaLLDH发酵菌体用于催化生产(S)-HMTBA，转化体系为：第一阶段为将100g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，pH 7.5Tris-HCl，在500rpm、2vvm、25℃条件下，转化14h；第二阶段为向转化体系中再加入20g/L CbFDH-BaLLDH湿菌体，85g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，在30℃下继续反应10h。反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸，酮蛋氨酸和(S)-HMTBA的含量。

转化过程曲线如图7所示：第一阶段，100g/L的蛋氨酸，转化14h，中间产物酮蛋氨酸的转化率为99.0％，此时反应到达终点，升高温度到30℃，进行第二阶段的反应，进一步转化10h后(S)-HMTBA为97.0g/L，检测生产的(S)-HMTBA的光学纯度ee＞99％，蛋氨酸向(S)-HMTBA的转化率为96.3％，(S)-HMTBA的生产强度为4.04g/L/h。

实施例6：同步级联催化生产(R)-HMTBA

(1)取用实施例3中收集PvLAAD和CbFDH-PaDLDH发酵菌体用于催化生产(R)-HMTBA，转化体系为：100g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，20g/L CbFDH-PaDLDH湿菌体，91g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.5Tris-HCl，在600rpm、2vvm、28℃条件下，转化24h，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸、酮蛋氨酸和(R)-HMTBA的含量。

转化过程曲线如图5所示：将菌体与底物一次性投料于转化体系中，随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，但16h以后蛋氨酸浓度不再降低，可能是由于转化体系中离子浓度过高，导致PvLAAD蛋白快速失活，反应无法继续，24h时酮蛋氨酸消耗完毕，(R)-HMTBA积累77.0g/L。

(2)取用实施例3中收集PvLAAD和CbFDH-PaDLDH发酵菌体用于催化生产(R)-HMTBA，转化体系为：30g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，20g/L CbFDH-PaDLDH湿菌体，18.2g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.5Tris-HCl，0～10h通过分批补料添加蛋氨酸与甲酸钠(摩尔比1:2.0)到转化体系中，维持蛋氨酸浓度为5～30g/L。在600rpm、2vvm、28℃条件下，转化24h，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸、酮蛋氨酸和(R)-HMTBA的含量。

转化过程曲线如图6所示：在2h、4h、6h、8h分别添加20g/L、20g/L、20g/L和10g/L蛋氨酸，随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，相应地，酮蛋氨酸也不断消耗，反应协同性好，最终转化15h，(R)-HMTBA积累97.0g/L，相比于分步级联催化转化周期缩短了8h。

实施例7：同步级联催化生产(S)-HMTBA

(1)取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-BaLLDH发酵菌体用于催化生产(S)-HMTBA，转化体系为：100g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，20g/L CbFDH-PaDLDH湿菌体，91g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.0Tris-HCl，在500rpm、2vvm、30℃条件下，转化24h，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸，酮蛋氨酸和(S)-HMTBA的含量。

转化过程曲线如图8所示：将菌体与底物一次性投料于转化体系中，可能是由于转化体系中离子浓度过高，体系复杂，反应协同性差，18h之后蛋氨酸浓度不再降低，反应无法继续，24h时酮蛋氨酸消耗完毕，(S)-HMTBA积累85.6g/L。

(2)取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-BaLLDH发酵菌体用于催化生产(S)-HMTBA，转化体系为：30g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，20g/L CbFDH-BaLLDH湿菌体，18.2g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.0Tris-HCl，0～10h通过分批补料添加蛋氨酸与甲酸钠(摩尔比1:2.0)到转化体系中，维持蛋氨酸浓度为5～35g/L。在500rpm、2vvm、30℃条件下，转化22h，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸，酮蛋氨酸和(S)-HMTBA的含量。

转化过程曲线如图9所示：在2h、6h、10h分别添加25g/L、25g/L和20g/L蛋氨酸，随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，相应地，酮蛋氨酸也不断消耗，反应协同性好，最终转化18h，(S)-HMTBA积累98.1g/L，相比于分步级联催化转化周期缩短了6h，(S)-HMTBA生产强度达到5.45g/L/h。

对比例1

取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-PaDLDH发酵菌体用于催化生产(R)-HMTBA，转化体系为：20g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，10g/L CbFDH-PaDLDH湿菌体，18.2g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.5Tris-HCl，0～10h通过恒速补料添加蛋氨酸与甲酸钠(摩尔比1:2.0)到转化体系中，维持蛋氨酸浓度为5～25g/L。在600rpm、2vvm、30℃条件下，转化24h，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸、酮蛋氨酸和(R)-HMTBA的含量。随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，相应地，酮蛋氨酸也不断消耗，最终转化18h，(R)-HMTBA积累96.0g/L，蛋氨酸摩尔转化率达到95.4％，相比于分步级联催化转化周期缩短了5h。

对比例2

取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-BaLLDH发酵菌体用于催化生产(S)-HMTBA，转化体系为：20g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，15g/L CbFDH-BaLLDH湿菌体，18.2g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.0Tris-HCl，0～10h通过恒速补料添加蛋氨酸与甲酸钠(摩尔比1:2.0)到转化体系中，维持蛋氨酸浓度为10～30g/L。在500rpm、2vvm、30℃条件下，转化24h，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸，酮蛋氨酸和(S)-HMTBA的含量。随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，相应地，酮蛋氨酸也不断消耗，最终转化周期18h，(S)-HMTBA积累97.1g/L，蛋氨酸摩尔转化率达到96.4％，相比于分步级联催化转化周期缩短了6h。

对比例3

取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-PaDLDH发酵菌体用于催化生产(R)-HMTBA，转化体系为：50g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，20g/L CbFDH-PaDLDH湿菌体，57.0g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.5Tris-HCl，反应10h时同时加入50g/L蛋氨酸和57.0g/L甲酸钠(摩尔比为1:2.5)。在600rpm、2vvm、30℃条件下转化，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸、酮蛋氨酸和(R)-HMTBA的含量。随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，相应地，酮蛋氨酸也不断消耗，最终转化23h，(R)-HMTBA积累94.2g/L，蛋氨酸摩尔转化率达到93.6％，与分步级联催化转化周期一致。

对比例4

取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-BaLLDH发酵菌体用于催化生产(S)-HMTBA，转化体系为：50g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，25g/L CbFDH-BaLLDH湿菌体，57g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.5Tris-HCl，反应10h时同时加入50g/L蛋氨酸和57.0g/L甲酸钠(摩尔比为1:2.5)。在500rpm、2vvm、30℃条件下转化，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸、酮蛋氨酸和(S)-HMTBA的含量。随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，相应地，酮蛋氨酸也不断消耗，最终转化周期24h，(S)-HMTBA积累94.8g/L，蛋氨酸摩尔转化率达到94.2％，相比于分步级联催化周期并未缩短。

对比例5

取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-PaDLDH发酵菌体用于催化生产(R)-HMTBA，转化体系为：30g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，20g/L CbFDH-PaDLDH湿菌体，13.7g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.5Tris-HCl，0～14h通过恒速补料添加蛋氨酸与甲酸钠(摩尔比1:1)到转化体系中，维持蛋氨酸浓度为10～25g/L。在600rpm、2vvm、30℃条件下转化，反应过程中取样，HPLC检测蛋氨酸、酮蛋氨酸和(R)-HMTBA的含量。随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，最终转化24h，(R)-HMTBA积累95.0g/L，蛋氨酸摩尔转化率为94.3％，甲酸钠添加量不足，导致NADH再生不能够完全满足第二步反应，转化周期并未缩短且转化率下降。

对比例6

取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-BaLLDH发酵菌体用于催化生产(S)-HMTBA，转化体系为：30g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，25g/L CbFDH-BaLLDH湿菌体，13.7g/L甲酸钠，0.4mM NAD⁺，pH 7.5Tris-HCl，0～14h通过恒速补料添加蛋氨酸与甲酸钠(摩尔比1:1)到转化体系中，维持蛋氨酸浓度为10～25g/L。在500rpm、2vvm、30℃条件下转化，反应过程中取样，HPLC检测蛋氨酸、酮蛋氨酸和(S)-HMTBA的含量。随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，最终转化周期24h，(S)-HMTBA积累93.8g/L，蛋氨酸摩尔转化率为93.2％，甲酸钠添加量不足，导致NADH再生不能够完全满足第二步反应，转化周期并未缩短且转化率下降。

对比例7

取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-PaDLDH发酵菌体用于催化生产(R)-HMTBA，转化体系为30g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，20g/L CbFDH-PaDLDH湿菌体，18.2g/L甲酸钠，pH 7.5Tris-HCl，NAD⁺浓度为0.2mM，0～14h转化过程中通过分批添加蛋氨酸与甲酸钠(摩尔比1:2.0)维持蛋氨酸浓度为10～25g/L。在600rpm、2vvm、30℃条件下转化，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸、酮蛋氨酸和(R)-HMTBA的含量。最终转化周期23h，(S)-HMTBA积累96.9g/L，蛋氨酸摩尔转化率为96.4％，NAD⁺添加量不足，导致NADH再生不能够完全满足第二步反应，转化速率降低，转化周期与分步级联催化相比并未缩短。

对比例8

取用实施例3中收集的PvLAAD和CbFDH-BaLLDH发酵菌体用于催化生产(S)-HMTBA，转化体系为：30g/L蛋氨酸，20g/L PvLAAD湿菌体，20g/L CbFDH-BaLLDH湿菌体，18.2g/L甲酸钠，0.2mM NAD⁺，pH 7.0Tris-HCl，0～14h通过分批补料添加蛋氨酸与甲酸钠(摩尔比1:2.0)到转化体系中，维持蛋氨酸浓度为10～30g/L。在500rpm、2vvm、30℃条件下转化，反应过程中离心取上清，HPLC检测蛋氨酸，酮蛋氨酸和(S)-HMTBA的含量。随着转化进行，蛋氨酸不断消耗，最终转化周期24h，(S)-HMTBA积累94.1g/L，蛋氨酸摩尔转化率为93.5％，NAD⁺添加量不足，导致NADH再生不能够完全满足第二步反应，转化周期与分步级联催化相比并未缩短，转化率出现降低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

无锡宸明生物技术有限公司

<120> 一种多酶级联生产(R/S)-羟基蛋氨酸的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1416

<212> DNA

<213> 普通变形杆菌

<400> 1

atggcaatta gccgccggaa atttattatt ggggggaccg ttgttgcggt tgcggccggt 60

gcgggtattt taacgccgat gttaacgcgg gaggggcggt ttgttccggg gacgcctcgt 120

catggttttg ttgaggggac cgagggggcg ctgccgaagc aagcagatgt tgtagttgtt 180

ggggcgggga ttttagggat tatgacagca attaatctgg tggaacgtgg attaagcgtt 240

gttattgttg aaaaaggaaa cattgcaggt gaacagagta gccggtttta tgggcaggca 300

attagctata agatgccgga tgagaccttt ctgctgcatc atttagggaa acatcgttgg 360

cgcgaaatga acgcaaaagt tggtattgat accacctatc gtacccaggg tcgggttgaa 420

gttccgctgg acgaagaaga tctggtgaac gttcgtaaat ggattgacga aagaagcaaa 480

aatgtgggca gtgacattcc gtttaaaacc cgtattatag aaggtgcaga actgaatcag 540

agactgcggg gagcaacaac cgattggaaa attgcaggct ttgaggaaga tagtgggagc 600

tttgatccgg aagttgccac atttgttatg gcagaatatg cgaagaaaat gggggttcgg 660

atttatacac agtgcgcagc aagaggatta gaaacacagg caggagttat tagcgatgtt 720

gtgaccgaga agggtgcaat taaaaccagt caggtggttg tggcaggggg ggtttggtcg 780

cgtctgttta tgcagaatct gaatgttgat gttccaacct taccggcata tcagagtcag 840

cagctgatta gtggtagccc aacagcacca ggtggtaatg ttgcattacc ggggggtatt 900

ttttttcggg aacaggcaga cggtacctat gcaaccagcc ctcgtgttat agttgcacct 960

gttgttaagg agagctttac ctatggttat aaatatctgc cgctgttagc gttaccggat 1020

tttcctgtgc atatttcact gaacgaacaa ctgattaatt cttttatgca gagcacccat 1080

tggaacctgg atgaggttag cccgtttgaa cagtttagaa atatgactgc cttaccggat 1140

cttccggaac tgaatgcaag cctggaaaaa ctgaaagccg aatttccagc attcaaagaa 1200

tcaaaactga tagatcagtg gagcggagca atggcaatcg cgccggatga gaacccgatt 1260

ataagcgaag tgaaagaata tccgggcctg gtgatcaata ccgcaaccgg ttgggggatg 1320

accgaaagcc cggttagcgc agaactgacg gcagacttac tgctgggaaa aaaaccggtt 1380

ctggacccta aaccgtttag cctgtatcgt ttttaa 1416

<210> 2

<211> 996

<212> DNA

<213> 乳片球菌

<400> 2

atgaagatta ttgcttatgg aattcgtgac gatgaaaaac catatttaga cgaatgggta 60

acgaagaacc atatcgaggt taaagcggtc cccgatttgt tagattctag taacattgat 120

ttggcaaagg attacgatgg ggtagttgct taccaacaaa agccttacac cgctgattta 180

tttgataaga tgcacgaatt tgggattcat gccttctcgc tgcgtaacgt cggagttgat 240

aacgtacccg cagatgcact caagaaaaat gatatcaaaa tttcgaacgt accagcatat 300

tctccaagag caattgctga attgtcagtc acccaactgt tagcattact ccgtaagatt 360

cctgaatttg aatacaaaat ggctcatggc gattatcgtt gggaaccaga catcggtttg 420

gaacttaatc aaatgaccgt tggggtaatt ggtaccggac ggattggccg tgctgcaatt 480

gacattttta aaggatttgg cgcaaaggta attgcgtacg atgttttccg taatcctgca 540

ttagaaaagg aaggcatgta tgtagatact ttagaagaac tttaccaaca agctaacgtg 600

attactttac acgttccagc actaaaggat aattaccaca tgttggatga aaaggccttt 660

ggtcaaatgc aagacggaac cttcatttta aacttcgcgc gggggacttt aattgataca 720

cctgcacttt taaaggcgtt agatagtggt aaagttgccg gagctgcgct agatacttac 780

gaaaacgaag tcggcatttt tgatgtcgat catggtgatc aaccaattga tgacccagtc 840

tttaacgatt tgatgagtcg ccgtaacgta atgattacgc cacacgctgc cttctacacc 900

cgtccagcgg ttaaaaacat ggttcaaatc gccttagaca acaaccggga cttaattgaa 960

aagaattctt caaagaatga agttaagttt gactaa 996

<210> 3

<211> 1098

<212> DNA

<213> 假丝酵母

<400> 3

atgaagatcg tgttagtcct ttacgacgca ggaaagcatg ccgcggacga ggaaaagtta 60

tacggatgta ccgaaaataa acttggtatc gcgaattggc ttaaagatca aggccatgag 120

ctgattacta ccagtgataa agaaggcggg aacagtgttt tagaccaaca tatcccagac 180

gcggatatta tcattaccac cccgtttcac ccggcttata tcacgaagga gcgtattgat 240

aaagccaaga agttgaagct ggtggtagtc gccggggttg gtagtgacca catcgactta 300

gactatatca accaaactgg taaaaaaatt agtgttttgg aagttactgg atcaaacgta 360

gtgtccgtgg ccgaacatgt tgtaatgacg atgctggtgc ttgttcgcaa ctttgtgccc 420

gcgcacgagc aaattattaa ccatgactgg gaagtcgctg ctattgcgaa agacgcttac 480

gatatcgaag ggaagactat tgcaaccatt ggtgccggtc gcatcggtta ccgcgtgtta 540

gagcgccttg tcccgtttaa ccctaaggaa cttttgtatt atgactatca agcgctgcca 600

aaggacgcgg aggagaaagt gggagctcgc cgcgtagaga atatcgagga gttagtagcc 660

caggcggata tcgttactgt aaacgcccct ttgcacgccg gaactaaggg cctgattaat 720

aaagagttat taagcaaatt taagaaggga gcttggttag tcaacactgc tcgcggtgct 780

atttgtgtgg cagaggatgt tgctgctgct ttggaatcag ggcagttacg tggatacggt 840

ggtgatgttt ggttccctca accagcgccg aaagaccacc cgtggcgcga catgcgtaat 900

aagtatgggg cagggaacgc tatgacgccg cactattctg gcactacatt ggatgcgcag 960

acacgttacg ctcaagggac taaaaacatt ttggagtctt tcttcaccgg taagttcgat 1020

taccgccctc aagatatcat tcttttgaat ggagaatacg tcacaaaggc ctacgggaaa 1080

cacgataaaa aataataa 1098

<210> 4

<211> 939

<212> DNA

<213> 凝结芽孢杆菌

<400> 4

atgaaaaagg tcaatcgtat tgcagtggtt ggaacgggtg cagttggtac aagttactgc 60

tacgccatga ttaatcaggg tgttgcagaa gagcttgttt taatcgatat taacgaagca 120

aaagcagaag gggaagccat ggacctgaac cacggcctgc catttgcgcc tacgccgacc 180

cgcgtttgga aaggcgatta ttccgattgc ggcactgccg atcttgttgt cattacggca 240

ggttccccgc aaaaaccggg cgaaacaagg cttgatcttg ttgccaaaaa cgcaaaaatt 300

tttaaaggca tgattaagag catcatggac agcggcttta acgggatttt tcttgttgcc 360

agcaacccgg ttgacatttt gacatatgta acttggaaag agtccggcct gccgaaagaa 420

catgttatcg gttcgggcac agtgcttgac tccgcgcgtc tccgcaactc tttaagcgcc 480

cacttcggaa ttgacccgcg caatgtccat gccgcaatta tcggcgaaca cggcgacacg 540

gaacttccgg tttggagcca tacaacgatc ggttatgaca ccattgaaag ctatctgcaa 600

aagggaacca ttgaccaaaa aacattagat gatatttttg tcaacacgag agatgcggct 660

taccatatca ttgaacgaaa aggggccaca ttttacggca tcgggatgtc tctgacccgg 720

atcacaagag cgatcctgaa caatgaaaac agtgttttga cagtctctgc ctttttggaa 780

ggccagtacg gaaacagcga tgtgtacatt ggtgttcctg ccgttattaa ccgccaaggc 840

gtccgtgaag tggttgaaat cgagctgaac gacaaagaac aggaacaatt tagccattct 900

gttaaagtat taaaagaaac gatggcacct gtattgtaa 939

<210> 5

<211> 311

<212> PRT

<213> 凝结芽孢杆菌

<400> 5

Met Lys Lys Val Asn Arg Ile Ala Val Val Gly Thr Gly Ala Val Gly

1 5 10 15

Thr Ser Tyr Cys Tyr Ala Met Ile Asn Gln Gly Val Ala Glu Glu Leu

20 25 30

Val Leu Ile Asp Ile Asn Glu Ala Lys Ala Glu Gly Glu Ala Met Asp

35 40 45

Leu Asn His Gly Leu Pro Phe Ala Pro Thr Pro Thr Arg Val Trp Lys

50 55 60

Gly Asp Tyr Ser Asp Cys Gly Thr Ala Asp Leu Val Val Ile Thr Ala

65 70 75 80

Gly Ser Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val Ala Lys

85 90 95

Asn Ala Lys Ile Phe Lys Gly Met Ile Lys Ser Ile Met Asp Ser Gly

100 105 110

Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr

115 120 125

Tyr Val Thr Trp Lys Glu Ser Gly Leu Pro Lys Glu His Val Ile Gly

130 135 140

Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Leu Arg Asn Ser Leu Ser Ala

145 150 155 160

His Phe Gly Ile Asp Pro Arg Asn Val His Ala Ala Ile Ile Gly Glu

165 170 175

His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Trp Ser His Thr Thr Ile Gly Tyr

180 185 190

Asp Thr Ile Glu Ser Tyr Leu Gln Lys Gly Thr Ile Asp Gln Lys Thr

195 200 205

Leu Asp Asp Ile Phe Val Asn Thr Arg Asp Ala Ala Tyr His Ile Ile

210 215 220

Glu Arg Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Met Ser Leu Thr Arg

225 230 235 240

Ile Thr Arg Ala Ile Leu Asn Asn Glu Asn Ser Val Leu Thr Val Ser

245 250 255

Ala Phe Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Asn Ser Asp Val Tyr Ile Gly Val

260 265 270

Pro Ala Val Ile Asn Arg Gln Gly Val Arg Glu Val Val Glu Ile Glu

275 280 285

Leu Asn Asp Lys Glu Gln Glu Gln Phe Ser His Ser Val Lys Val Leu

290 295 300

Lys Glu Thr Met Ala Pro Val

305 310

<210> 6

<211> 471

<212> PRT

<213> 普通变形杆菌

<400> 6

Met Ala Ile Ser Arg Arg Lys Phe Ile Ile Gly Gly Thr Val Val Ala

1 5 10 15

Val Ala Ala Gly Ala Gly Ile Leu Thr Pro Met Leu Thr Arg Glu Gly

20 25 30

Arg Phe Val Pro Gly Thr Pro Arg His Gly Phe Val Glu Gly Thr Glu

35 40 45

Gly Ala Leu Pro Lys Gln Ala Asp Val Val Val Val Gly Ala Gly Ile

50 55 60

Leu Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Val Glu Arg Gly Leu Ser Val

65 70 75 80

Val Ile Val Glu Lys Gly Asn Ile Ala Gly Glu Gln Ser Ser Arg Phe

85 90 95

Tyr Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Lys Met Pro Asp Glu Thr Phe Leu Leu

100 105 110

His His Leu Gly Lys His Arg Trp Arg Glu Met Asn Ala Lys Val Gly

115 120 125

Ile Asp Thr Thr Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Val Pro Leu Asp

130 135 140

Glu Glu Asp Leu Val Asn Val Arg Lys Trp Ile Asp Glu Arg Ser Lys

145 150 155 160

Asn Val Gly Ser Asp Ile Pro Phe Lys Thr Arg Ile Ile Glu Gly Ala

165 170 175

Glu Leu Asn Gln Arg Leu Arg Gly Ala Thr Thr Asp Trp Lys Ile Ala

180 185 190

Gly Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Phe Asp Pro Glu Val Ala Thr Phe

195 200 205

Val Met Ala Glu Tyr Ala Lys Lys Met Gly Val Arg Ile Tyr Thr Gln

210 215 220

Cys Ala Ala Arg Gly Leu Glu Thr Gln Ala Gly Val Ile Ser Asp Val

225 230 235 240

Val Thr Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Gln Val Val Val Ala Gly

245 250 255

Gly Val Trp Ser Arg Leu Phe Met Gln Asn Leu Asn Val Asp Val Pro

260 265 270

Thr Leu Pro Ala Tyr Gln Ser Gln Gln Leu Ile Ser Gly Ser Pro Thr

275 280 285

Ala Pro Gly Gly Asn Val Ala Leu Pro Gly Gly Ile Phe Phe Arg Glu

290 295 300

Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Thr Ser Pro Arg Val Ile Val Ala Pro

305 310 315 320

Val Val Lys Glu Ser Phe Thr Tyr Gly Tyr Lys Tyr Leu Pro Leu Leu

325 330 335

Ala Leu Pro Asp Phe Pro Val His Ile Ser Leu Asn Glu Gln Leu Ile

340 345 350

Asn Ser Phe Met Gln Ser Thr His Trp Asn Leu Asp Glu Val Ser Pro

355 360 365

Phe Glu Gln Phe Arg Asn Met Thr Ala Leu Pro Asp Leu Pro Glu Leu

370 375 380

Asn Ala Ser Leu Glu Lys Leu Lys Ala Glu Phe Pro Ala Phe Lys Glu

385 390 395 400

Ser Lys Leu Ile Asp Gln Trp Ser Gly Ala Met Ala Ile Ala Pro Asp

405 410 415

Glu Asn Pro Ile Ile Ser Glu Val Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Val Ile

420 425 430

Asn Thr Ala Thr Gly Trp Gly Met Thr Glu Ser Pro Val Ser Ala Glu

435 440 445

Leu Thr Ala Asp Leu Leu Leu Gly Lys Lys Pro Val Leu Asp Pro Lys

450 455 460

Pro Phe Ser Leu Tyr Arg Phe

465 470

<210> 7

<211> 331

<212> PRT

<213> 乳片球菌

<400> 7

Met Lys Ile Ile Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Tyr Leu

1 5 10 15

Asp Glu Trp Val Thr Lys Asn His Ile Glu Val Lys Ala Val Pro Asp

20 25 30

Leu Leu Asp Ser Ser Asn Ile Asp Leu Ala Lys Asp Tyr Asp Gly Val

35 40 45

Val Ala Tyr Gln Gln Lys Pro Tyr Thr Ala Asp Leu Phe Asp Lys Met

50 55 60

His Glu Phe Gly Ile His Ala Phe Ser Leu Arg Asn Val Gly Val Asp

65 70 75 80

Asn Val Pro Ala Asp Ala Leu Lys Lys Asn Asp Ile Lys Ile Ser Asn

85 90 95

Val Pro Ala Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr Gln

100 105 110

Leu Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ile Pro Glu Phe Glu Tyr Lys Met Ala

115 120 125

His Gly Asp Tyr Arg Trp Glu Pro Asp Ile Gly Leu Glu Leu Asn Gln

130 135 140

Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala Ile

145 150 155 160

Asp Ile Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Val Phe

165 170 175

Arg Asn Pro Ala Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu Glu

180 185 190

Glu Leu Tyr Gln Gln Ala Asn Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala Leu

195 200 205

Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asp Glu Lys Ala Phe Gly Gln Met Gln

210 215 220

Asp Gly Thr Phe Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Ile Asp Thr

225 230 235 240

Pro Ala Leu Leu Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala Ala

245 250 255

Leu Asp Thr Tyr Glu Asn Glu Val Gly Ile Phe Asp Val Asp His Gly

260 265 270

Asp Gln Pro Ile Asp Asp Pro Val Phe Asn Asp Leu Met Ser Arg Arg

275 280 285

Asn Val Met Ile Thr Pro His Ala Ala Phe Tyr Thr Arg Pro Ala Val

290 295 300

Lys Asn Met Val Gln Ile Ala Leu Asp Asn Asn Arg Asp Leu Ile Glu

305 310 315 320

Lys Asn Ser Ser Lys Asn Glu Val Lys Phe Asp

325 330

<210> 8

<211> 364

<212> PRT

<213> 假丝酵母

<400> 8

Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp

1 5 10 15

Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn

20 25 30

Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu

35 40 45

Gly Gly Asn Ser Val Leu Asp Gln His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile

50 55 60

Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Ile Asp

65 70 75 80

Lys Ala Lys Lys Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp

85 90 95

His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val

100 105 110

Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val

115 120 125

Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln

130 135 140

Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr

145 150 155 160

Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly

165 170 175

Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu

180 185 190

Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Asp Ala Glu Glu Lys Val Gly

195 200 205

Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile

210 215 220

Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn

225 230 235 240

Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr

245 250 255

Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu

260 265 270

Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro

275 280 285

Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala

290 295 300

Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln

305 310 315 320

Thr Arg Tyr Ala Gln Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr

325 330 335

Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu

340 345 350

Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys

355 360

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

acggtcgaca aagaggagaa aaagcttatg aagattattg cttatggaat tc 52

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

acgcctcgag tcagtcaaac ttaacttcat tcttt 35

<210> 11

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

acggtcgaca aagaggagaa aaagcttatg aaaaaggtca atcgtattgc ag 52

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

acgcctcgag ttacaataca ggtgccatcg tttct 35