阅读说明：本技术 一种玉米源增味调味液及其制备方法 (Corn-derived flavoring liquid and preparation method thereof ) 是由 袁利 栾小茜 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种玉米源增味调味液的制备方法,先用复合氨肽酶对玉米蛋白、固体玉米糖浆(或水解玉米淀粉糖)进行酶解,再以此作为底物,加入固定化谷氨酸棒状杆菌和产氨短杆菌固定化细胞进行生物转化。本发明中使用了专一性较强的氨肽酶进行水解,最大程度释放原料中的氨基酸。又使用固定化细胞对原料中的淀粉、糖、肽、无机氮等成分再利用生产呈味氨基酸和核苷酸。本发明获得的最终产品总氮和氨基酸态氮含量高,杂质少,可以用于食品增味调味使用。(The invention provides a preparation method of corn-derived flavoring liquid, which comprises the steps of carrying out enzymolysis on corn protein and solid corn syrup (or hydrolyzed corn starch sugar) by using compound aminopeptidase, taking the enzymolysis product as a substrate, and adding immobilized corynebacterium glutamicum and immobilized cells of ammonia-producing brevibacterium to carry out biotransformation. In the invention, aminopeptidase with stronger specificity is used for hydrolysis, and amino acid in the raw material is released to the maximum extent. And the immobilized cells are used for recycling components such as starch, sugar, peptide, inorganic nitrogen and the like in the raw materials to produce flavor amino acid and nucleotide. The final product obtained by the invention has high content of total nitrogen and amino acid nitrogen, has few impurities, and can be used for flavoring food.)

一种玉米源增味调味液及其制备方法

技术领域

本发明属于食品制备技术领域，具体涉及一种玉米源增味调味液的制备方法。

背景技术

氨基酸调味液通常用于配置调味产品，一般要求含有大量的呈味氨基酸(谷氨酸，甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬氨酸，丝氨酸等)，呈味氨基酸含量越高，调味液的质量越高，通常用氨基酸态氮和总氮来衡量其质量。玉米蛋白价格低廉，蛋白含量高，是理想的蛋白原料。但是玉米蛋白中含有玉米醇溶蛋白、谷蛋白、球蛋白和蛋白等，组成复杂，口感粗糙，水溶性差，限制了在食品工业中的应用。而玉米蛋白通过水解，可以增加水溶性，还能释放出多种呈味氨基酸和功能寡肽。

玉米蛋白水解方法有酸碱法、酶法、微生物法等，其中酸碱水解较为彻底，但易水解过度，产生氯丙醇等对人体有害的物质。微生物法一般使用曲霉、芽孢杆菌发酵，酶系丰富，能产生大量氨基酸，但其菌体生长需要消耗碳氮源，生长周期长，易污染，产物与菌体也不易分离。而酶法反应条件温和，环保无害，逐渐取代了酸碱的方法，但酶法降解的效率不如酸碱法彻底，不能直接将蛋白分解至氨基酸，而是生成许多分子量在1000Da以下的寡肽。

有报道研究发现，玉米蛋白中氨基酸分布并不均衡，疏水性氨基酸(如亮氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等)含量较高，因此水溶性差。使用传统的蛋白酶解法或微生物发酵法进行转化，水解率只能在60％左右，氨基酸生成率低，难以满足调味液的指标要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米源增味调味液及其制备方法，从而解决上述问题。

本发明首先提供一种玉米蛋白酶解液，是将玉米蛋白和玉米糖浆先用风味蛋白酶进行酶解，再加入脯氨酸氨肽酶和亮氨酸氨肽酶进行酶解，最后加入赖氨酸氨肽酶进行酶解获得的酶解液

其中玉米糖浆可以全部或部分替换为水解玉米淀粉糖；

所述的风味蛋白酶进行酶解，其酶解条件如下：pH6.5-7.5,温度为50℃；

所述的脯氨酸氨肽酶+亮氨酸氨肽酶进行酶解，其酶解条件为pH6.5-7，温度为40℃；

所述的赖氨酸氨肽酶进行酶解，其酶解条件为pH 7.5,温度为40-50℃；

本发明再一个方面是提供一种玉米蛋白发酵液，是将上述的酶解液使用谷氨酸棒状杆菌和产氨短杆菌进行发酵制备的；

所述的谷氨酸棒状杆菌和产氨短杆菌进行发酵，其发酵条件为30-37℃。

所述的谷氨酸棒状杆菌和产氨短杆菌采用固定化的谷氨酸棒状杆菌和产氨短杆菌。

本发明所制备的玉米蛋白发酵液可用于制备调味液等食品。

本发明在制备的玉米蛋白中采用固定化谷氨酸棒状杆菌和产氨短杆菌进行发酵，可以对玉米蛋白进一步地利用和转化；生成谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸、肌苷酸、鸟苷酸等呈味物质，且不引入额外杂质，可以循环使用，且固定化的方式使物料分离更简单。

附图说明

图1：脯氨酸氨肽酶酶解最适pH和温度图；

图2：亮氨酸氨肽酶酶解最适pH和温度图；

图3：赖氨酸氨肽酶的酶解最适pH和温度图；

图4：玉米蛋白水解后的氨基酸组成情况图。

具体实施方式

玉米粉又称为玉米面，是玉米晒干后研磨所得的粗品，其主要成分是碳水化合物(淀粉)，含量占70％左右，蛋白质只占到8％左右。玉米粉通过精制可以得到玉米淀粉，玉米蛋白是其加工的副产品，主要成分是醇溶蛋白和球蛋白，蛋白含量超过65％，淀粉含量15％，纤维素2％。玉米蛋白作为一种廉价的蛋白源，溶解性差，难以利用，氨基酸组成不均衡，一般只能用于饲料，甚至随着废水排掉，不但浪费还污染环境。要对玉米蛋白进行高值化利用，首先要对其进行水解。

目前玉米蛋白水解多采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶(风味酶)搭配使用，蛋白酶可以将玉米蛋白水解为多肽，风味酶则可以降低多肽分子量，进一步将部分肽降解为氨基酸，来增进或改进水解物的口感风味。风味蛋白酶是利用米曲霉发酵后提取而成，是一种混合酶，兼有内切和外切酶特征。风味酶专一性差，外切位点随机，对于氨基酸的产生率有一定限制。

本发明先将玉米蛋白、固体玉米糖浆(或水解玉米淀粉糖)混合后，先经过风味蛋白酶处理，再经过脯氨酸氨肽酶水解后，Pro浓度提高了2.7倍，再协同亮氨酸氨肽酶处理后，Leu、Ile是酶解前的2.75和4倍，水解液中游离的其他疏水性氨基酸含量也大幅度提高。再使用固定化谷氨酸棒状杆菌是工业上主要的谷氨酸生产菌之一，还是苏氨酸、赖氨酸的主要产生菌，能够利用葡萄糖、果糖、蔗糖、有机酸等多种碳源分泌氨基酸。产氨短杆菌是肌苷酸二钠、鸟苷酸二钠等呈味核苷酸的生产菌之一，使用这两种菌共同固定化细胞的方法，进行发酵，可以对玉米蛋白进一步地利用和转化。增加苏氨酸、赖氨酸、腺苷酸、鸟苷酸等呈味物质的含量。

实施例1氨肽酶的作用条件

以L-脯氨酸-对硝基苯胺Pro-pNA、L-亮氨酸-对硝基苯胺Leu-pNA、L-赖氨酸-对硝基苯胺Lys-pNA为底物(底物储藏液用Tris-HCl pH 7.5缓冲液配制，浓度为4.25mM)来标记脯氨酸氨肽酶、亮氨酸氨肽酶和赖氨酸氨肽酶的酶活。反应体系包括2mLTris-HCl pH 7.5缓冲液，1mL底物储藏液和1mL稀释后的酶液，50℃水浴10min，时间一到立即放到冰水中终止反应并快速的在405nm波长下测定吸光值。50℃下每分钟分解Xaa-pNA产生1μM对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活单位(U)。

玉米蛋白由大分子蛋白构成，富含脯氨酸、亮氨酸等，经过风味酶处理后，玉米蛋白被内切为玉米肽，继续使用氨肽酶酶切后，释放出游离氨基酸。游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。取20ml试管，取待测样品1ml，加蒸馏水l ml，水合茚三酮(称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9ml PH4.54的醋酸盐缓冲液混匀)3.0ml，0.1％抗坏血酸0.1ml，混匀，封口。沸水浴加热15分钟，冷水中摇动冷却，用60％乙醇定溶至20ml，摇匀，于570mn测定吸光度A。

将各种氨肽酶在不同pH值下、在不同的温度下对风味酶处理过的玉米蛋白进行进一步水解，添加量为20U/ml，测定游离氨基酸的值，以确定其最适反应pH和温度。

脯氨酸氨肽酶水解玉米蛋白的适宜反应pH在7，在酸性环境中酶活丧失严重。在40-50℃条件下反应时催化活性最高，60℃反应1h后活性基本丧失，高温的耐受性差(图1)。亮氨酸氨肽酶的适宜反应pH在6.5，pH5.0～8.0有很好的稳定性。在40℃左右反应时催化活性最高，低温下催化效果好(图2)。赖氨酸氨肽酶的适宜反应pH在7.5，属于中性酶。在40-50℃条件下反应时催化活性好，对高温低温的耐受性都较好(图3)。

对脯氨酸氨肽酶、亮氨酸氨肽酶和赖氨酸氨肽酶的作用底物情况进行分析，以确定添加顺序。

用50mM pH 7.5的PBS缓冲液配制1mM的多肽底物，首先加入0.1mL稀释后的酶液(用50mM pH 7.5的PBS缓冲液稀释)和与多肽溶液，50℃反应10min，立即加入2.5mL乙酸和2.5mL酸性茚三酮溶液，混匀，沸水浴30min后冰上冷却，480nm处测定吸光值。空白对照以0.1mLPBS缓冲液代替稀释后的酶液做相同处理。将在50℃下每分钟分解多肽释放1μM氨基酸所需的酶量定义为氨肽酶对寡肽的一个水解活力单位(U)。

将寡肽先用少量DMSO溶剂溶解，再用0.05M pH 7.5的PBS缓冲液稀释至1mM。酶液(用50mM pH 7.5的PBS缓冲液稀释)与多肽溶液混合，50℃反应10min，立即加入2.5mL乙酸和2.5mL酸性茚三酮溶液，混匀，沸水浴30min后冰上冷却，480nm处测定吸光值。空白对照以0.1mLPBS缓冲液代替稀释后的酶液做相同处理。利用茚三酮测定所释放的游离氨基酸含量，从而确定氨肽酶对二三肽的水解能力，以水解能力最高者为100％。

表1：脯氨酸氨肽酶的底物选择性表

底物	相对活性(％)
		Pro-pNA(标准对照)	100.00
Pro-Phe	92.51
		Pro-Phe-Gly	104.50
Leu-Pro	11.05
		Pro-Leu	67.14
Pro-Leu-Ser	72.87
		Pro-Pro	57.30

表2：亮氨酸氨肽酶的底物专一性表

底物	相对活性(％)
		Leu-pNA(标准对照)	100.00
Pro-pNA	32.40
		Gly-Pro	0.41
Gly-pNA	12.74
		Glu-pNA	29.22
Ile-pNA	88.31

表3：赖氨酸氨肽酶的底物专一性表

底物	相对活性(％)
		Lys-pNA(标准对照)	100.00
Leu-pNA	81.14
		Arg-pNA	83.57
Met-pNA	79.66
		Val-pNA	74.75

从结果可以分析得出，脯氨酸氨肽酶可以特异地作用于N端的脯氨酸残基，对Pro-pNA、Pro-Phe-Gly水解效果最好，对三肽的水解效果优于二肽。此外，脯氨酸氨肽酶还具有一定的耐盐性，一定浓度的盐离子对其活性有促进作用，最高能耐受25％浓度的氯化钠浓度。在8％盐浓度下，相对酶活是对照的147％。亮氨酸氨肽酶对小肽N端的亮氨酸有非常强的水解活性，对异亮氨酸水解效果也很好，对其他氨基酸的水解较差，属于专一性酶。该酶是一种金属蛋白酶，Ca2+对该氨肽酶有激活作用，活性会提高到127％。赖氨酸氨肽酶对赖氨酸残基分解效率最高，对疏水氨基酸残基的切割效率都很高，它的底物相比于脯氨酸氨肽酶和亮氨酸氨肽酶更为广泛。

由以上结果可知，脯氨酸氨肽酶和亮氨酸氨肽酶对底物选择性高，赖氨酸氨肽酶选择性低。玉米蛋白被风味酶中的内切酶水解后可以形成许多中间肽，由于非特异性的蛋白酶一般不能都切割亚氨键，因此不能切割N末端为脯氨酸的多肽，中间肽末端携带脯氨酸的非常多。脯氨酸氨肽酶特异性地切除N末端的脯氨酸残基，能破除水解的障碍。因此首先加入脯氨酸氨肽酶进行反应，之后再加入亮氨酸氨肽酶，专一切割亮氨酸、异亮氨酸末端。最后使用赖氨酸水解酶进一步释放含量比较丰富的疏水氨基酸。

实施例2：风味蛋白酶和氨肽酶对玉米蛋白的水解

游离氨基酸的测定采用DABS-Cl衍生化法，用HPLC进行分析。将酶解结束后离心过的上清液，按照1:1加入7.5mM的DABS-Cl，密封后充分混合。70℃保温15min，反应结束后立即冰浴，加入3倍反应终止液(50％的50mM pH7.0的磷酸氢二钠溶液与50％的乙醇)。将混合物离心取上清液，进行HPLC检测。采用RP-C18的色谱柱(150×4.6mm，内径5μm)，流速1mL/min，进样量20μL，紫外检测器436nm检测。

考察了风味蛋白酶+脯氨酸氨肽酶、风味蛋白酶+脯氨酸氨肽酶+亮氨酸蛋白酶、风味蛋白酶+脯氨酸氨肽酶+亮氨酸蛋白酶+赖氨酸蛋白酶等协同作用对玉米蛋白的水解效果，

用50mM pH 7.5的PBS缓冲液配制20％的玉米蛋白浓浆，加入风味蛋白酶，50℃反应3h，沸水浴15min，冷却至40-50℃后，取样作为初始对照。再依次加入适量的脯氨酸氨肽酶反应2h，亮氨酸氨肽酶反应2h，最后加入赖氨酸氨肽酶45℃水浴过夜。分步骤取样10000rpm离心5min，测量上清液中多肽的分子量分布和呈味氨基酸含量。

如图4所示，玉米蛋白先经过风味酶处理，再经过脯氨酸氨肽酶水解后，Pro浓度提高了2.7倍，再协同亮氨酸氨肽酶处理后，Leu、Ile是酶解前的2.75和4倍，水解液中游离的其他疏水性氨基酸含量也大幅度提高。经三酶协同水解后，大部分蛋白水解率都有不同程度提高。

最终选用先加入风味酶50℃反应2h，灭活冷却至40-50℃后，依次加入适量的脯氨酸氨肽酶、亮氨酸氨肽酶和赖氨酸氨肽酶，45℃水浴过夜，通过三酶协同的方式对底物进行预水解。

通过水解，玉米蛋白中的氨基酸得以彻底释放，剩余寡肽可以作为复合氮源，淀粉和固体玉米糖浆(或水解玉米淀粉糖)可以作为碳源，还释放了少量离子和维生素成分，成为微生物发酵和转化的优良底物。

实施例3谷氨酸棒状杆菌和产氨短杆菌的细胞固定化以及对玉米蛋白酶解液的转化制备玉米蛋白发酵液

种子培养基(g/L)：葡萄糖5,酵母膏1,牛肉膏1,胰蛋白胨2,pH 7.2；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏0.5，尿素0.5，磷酸二氢钾0.1，磷酸氢二钾0.1，氯化钠0.1，硫酸镁0.2，pH 8.0。

将将冻存于–70℃的甘油管保藏谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)菌株于斜面培养基上划线，37℃培养24-36小时，利用接种环挑取活化好的新鲜菌苔，接种于发酵培养基中，37℃、200r/min培养48h，离心收集菌体，使用生理盐水配置成菌体浓度30％的菌体悬液。

制备固定化细胞：配制一定浓度的海藻酸钠溶液2L，加入100ml菌体悬液，混合均匀后，用自制固定化反应器将混合液逐滴注入不断搅拌的2％CaCl2溶液中，形成光滑小球后在室温4℃下静置硬化1h。用蒸馏水洗涤数次，以除去多余离子，得颗粒状固定化细胞，其颗粒大小约为1mm，放入密封袋内于4℃保存备用。

将玉米蛋白、固体玉米糖浆(或水解玉米淀粉糖)按照1:2混合，加水至总含固含量为20-30％；在混合液中加入0.5-2％的强化复合氨肽酶，按照实施例2的方式进行预水解，先加入风味酶50℃反应2h，灭活冷却至40-50℃后，依次加入适量的脯氨酸氨肽酶、亮氨酸氨肽酶和赖氨酸氨肽酶，45℃水浴过夜；酶解结束后，85℃以上保温15min灭酶。

调节水解液浓度，使其糖含量在14％左右,将200g固定化细胞凝珠装入到直径2cm、高20cm的反应柱中，从底部通入氨肽酶处理后的水解液，转化温度控制在35℃,调整流速反复循环直至残糖降至0.5％以下。再向里面继续补加酶解液，进行循环反应。

本发明的发酵方法有效解决了发酵液中pH急剧下降，易产生产物抑制的现象；而无需流加氨水或引入其他成分。

将发酵液不断进行浓缩，在115℃焦糖化40-60min后，过滤去除杂质得到玉米蛋白调味液。

使用盐酸浓度为6mol/l直接对玉米蛋白(20％，糊状)进行水解过夜，与本发明提供工艺所获得的调味液相比：

表4：本发明调味液与酸水解玉米蛋白对比

项目	本发明调味液	酸水解玉米蛋白
			干燥失重	29.9％	80％
总氮(占干重比)	10.46g/100g	10.34g/100g
			氨基酸态氮(占干重比)	5.43g/100g	5.03g/100g
3-氯-1,2-丙二醇	未检出(≤0.01)	未检出(≤0.01)
			铵盐	未检出(≤0.01)	0.61g/100g

经检测，该调味液生产过程中未曾添加其他物质，总氮(占干重比)约10％，氨基酸态氮(占干重比)5％,氨基酸总和为29.55％，全部来源于玉米蛋白和固定化细胞转化生成的氨基酸，不含3-MCPD。与酸解玉米蛋白相比，总氮和氨基氮量相当，可以完全替代酸解法，且铵盐含量低，远远超出SB/T 10338-2000规定中酸水解植物蛋白的限量要求(总氮≥1.5％；氨基酸态氮≥1％；3-氯-1,2-丙二醇≤1mg/kg)

本发明制备的玉米蛋白加工产物，其自身可以直接作为食品增味调味液；或是与食品领域中常用的制备调味液的其它组分结合来制备调味液。