阅读说明：本技术 一种基于二代测序平台的肺癌多基因联合检测试剂盒质控品 (Lung cancer polygene joint detection kit quality control product based on second-generation sequencing platform ) 是由 吴英松 周其伟 刘志鹏 杨学习 李明 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于二代测序平台的肺癌多基因联合检测试剂盒质控品,本质控品含有肺癌阳性质控品、肺癌阴性质控品、肺癌融合阳性质控品、肺癌融合阴性质控品中的一种或几种；其中,所述肺癌阳性质控品包括已发生目标基因突变的质粒、野生型细胞株DNA以及DNA稳定剂。本发明提供的肺癌质控品中所含DNA/RNA稳定剂可以有效防止游离DNA/RNA的降解,为DNA/RNA提供稳定的环境,延长肺癌质控品的保存时间；本发明提供质控品具有制备成本低、性能稳定和易保存等优点,可有效地监控人员操作、仪器状态以及试剂盒有效性等因素,极大地提高了检测试剂盒的准确性和可靠性。(The invention discloses a lung cancer polygene joint detection kit quality control product based on a second-generation sequencing platform, which comprises one or more of a lung cancer positive quality control product, a lung cancer negative quality control product, a lung cancer fusion positive quality control product and a lung cancer fusion negative quality control product; the positive quality control product for the lung cancer comprises a plasmid with target gene mutation, wild cell strain DNA and a DNA stabilizer. The DNA/RNA stabilizer contained in the lung cancer quality control product provided by the invention can effectively prevent the degradation of free DNA/RNA, provide a stable environment for the DNA/RNA and prolong the storage time of the lung cancer quality control product; the quality control product provided by the invention has the advantages of low preparation cost, stable performance, easiness in storage and the like, can effectively monitor factors such as personnel operation, instrument state, kit effectiveness and the like, and greatly improves the accuracy and reliability of the detection kit.)

一种基于二代测序平台的肺癌多基因联合检测试剂盒质控品

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种基于二代测序平台的肺癌多基因联合检测试剂盒质控品。

背景技术

肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症，其中非小细胞肺癌(Non-Small CellLung Cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80％。临床上部分患者化疗效果欠佳、化疗失败，其主要原因是肿瘤细胞对抗癌药物不敏感或产生耐药。因此，了解患者对化疗药物敏感性的相关因素，对于肺癌患者进行个体化治疗显得尤为重要。

EGFR基因位于7p12，编码酪氨酸激酶型受体。EGFR基因突变的发生率在亚洲人群达到50％，在不吸烟者、女性以及非粘液性肿瘤中发生率更高。迄今为止发现的EGFR基因突变主要位于外显子18～21；KRAS基因位于12p12.1，是常见的致癌基因，KRAS突变在吸烟者以及粘液性肺腺癌中最常见，多达30％的肺腺癌有KRAS突变，其突变以点突变为主，常见12、13和61号密码子的突变；BRAF基因位于7q34，是一种原癌基因。非小细胞肺癌中BRAF突变率约为3％，其中大部分是肺腺癌，其突变有80％～90％是V600E突变；ERBB2基因定位于染色体17q12，能够激活其下游PI3K-AKT和MEK-ERK信号通路，调控细胞增殖，分化等过程，其突变主要位于ERBB2基因第19、20号外显子上。在NSCLC患者中ERBB2突变率为2～4％。

ALK基因位于2号染色体的p23带(2p23)，属于跨膜受体酪氨酸激酶。中国人群腺癌ALK阳性率为5.1％。而我国EGFR和KRAS均为野生型的腺癌患者中ALK融合基因的阳性率高达30％～42％；RET基因位于第10号染色体q11.2区，是一种原癌基因，当RET基因与KIF5B、CCDC6、NCOA4等基因发生融合后，会持续激活RET酪氨酸激酶区及下游RAS/ERK、PI3K/AKT、MAPK/JNK等信号通路，进而引起肿瘤的发生。RET基因重排是新发现的肺腺癌驱动基因，其突变频率约为1％；ROS1基因位于第6号染色体q21区，编码一种受体酪氨酸激酶。当与SLC34A2、CD74等基因发生融合后，会持续激活ROS1酪氨酸激酶区及下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK等信号通路，进而引起肿瘤的发生。ROS1基因融合在非小细胞肺癌中的发生率约2～4％；

NCCN临床指南的更新，明确了NSCLC在治疗前应检测EGFR、ALK、ROS1三个基因状态的临床要求。此外，《中国渐变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性非小细胞肺癌诊疗指南》也提出，在患者允许下，推荐ROS1、ALK和EGFR同时检测。

目前检测肺癌突变基因的方法主要有2种：荧光定量PCR法、Sanger测序法。荧光定量PCR法，每对引物只能检测一种突变，检测多突变位点操作繁琐，需要样本量较大，容易出现假阳性；Sanger测序法每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，检测效率低，检测成本高，假阴性率较高。

截止到目前，市面上还没有出现操作简单、用于高通量测序(NGS)肺癌多基因联合检测序剂盒的质控品进行销售，而质控品如果保存不当特别容易出现降解；凑巧质控品又是评价和验证一款试剂盒检测准确性和稳定性等性能的重要方法和质量指标。因此，本领域急需一种稳定保存肺癌多基因联合检测试剂盒质控品。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种基于二代测序平台的肺癌多基因联合检测试剂盒质控品。

本发明的第一个目的是提供一种DNA稳定剂。

本发明的第二个目的是提供一种任一所述DNA稳定剂在DNA保存中的用途。

本发明的第三个目的是提供一种任一所述DNA稳定剂在制备肺癌多基因联合检测试剂盒的质控品中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种RNA稳定剂。

本发明的第五个目的是提供一种任一所述RNA稳定剂在RNA保存中的用途。

本发明的第六个目的是提供一种任一所述RNA稳定剂在制备肺癌多基因联合检测试剂盒的质控品中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种用于肺癌多基因联合检测的质控品。

本发明的第八个目的是提供一种基于DR-Seq 800基因测序平台肺癌多基因联合检剂盒质控品的制备方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明所提到的肺癌多基因联合检测序剂盒采用了高通量测序法(NGS)能同时检测EGFR、KRAS、BRAF、ERBB2、ALK、ROS1和RET基因、大大降低样本的需求量和降低检测成本；同时还能提高检测的灵敏度和准确性。

本发明要求保护一种DNA稳定剂，含有EDTA-3K、金精三羧酸盐、甘氨酸和盐酸甜菜碱。

优选地，所述DNA稳定剂中含有70～100g/L的EDTA-3K、800～1000g/L的金精三羧酸盐、80～100mg/L的甘氨酸和8～11mg/L的盐酸甜菜碱。

更优选地，所述DNA稳定剂中含有80g/L的EDTA-3K、900g/L的金精三羧酸盐、90mg/L的甘氨酸和10mg/L的盐酸甜菜碱。

任一所述DNA稳定剂在DNA保存中的用途，也属于本发明的保护范围。

任一所述DNA稳定剂在制备肺癌多基因联合检测试剂盒的质控品中的应用，也属于本发明的保护范围。

一种RNA稳定剂，含有EDTA-3K、金精三羧酸盐、丝氨酸抑制剂和盐酸甜菜碱。

优选地，其特征在于，所述RNA稳定剂中含有50～80g/L的EDTA-3K、600～900g/L的金精三羧酸盐、30～50mg/L的丝氨酸抑制剂和12～16mg/L的盐酸甜菜碱。

更优选地，所述RNA稳定剂中含有60g/L的EDTA-3K、800g/L的金精三羧酸盐、40mg/L的丝氨酸抑制剂和15mg/L的盐酸甜菜碱。

任一所述RNA稳定剂在RNA保存中的用途，也属于本发明的保护范围。

任一所述RNA稳定剂在制备肺癌多基因联合检测试剂盒的质控品中的应用，也属于本发明的保护范围。

一种用于肺癌多基因联合检测的质控品，含有肺癌阳性质控品、肺癌阴性质控品、肺癌融合阳性质控品、肺癌融合阴性质控品中的一种或几种；

其中，所述肺癌阳性质控品包括已发生目标基因突变的质粒、野生型细胞株DNA以及DNA稳定剂；

所述肺癌阴性质控品包括未发生目标基因突变的DNA以及DNA稳定剂；

所述肺癌融合阳性质控品包括目标基因发生融合的RNA以及RNA稳定剂；

所述肺癌融合阴性质控品包括目标基因未发生融合的RNA以及RNA稳定剂；

所述目标基因为EGFR、KRAS、BRAF、ERBB2、ALK、ROS1和RET基因质控品中的至少一种。

本发明还要求保护一种基于DR-Seq 800基因测序平台肺癌多基因联合检剂盒质控品的制备方法，包含肺癌阳性质控品的制备、肺癌阴性质控品的制备、肺癌融合阳性质控品的制备、和/或肺癌融合阴性质控品的制备；

其中，肺癌阳性质控品的制备：设计目标基因突变质粒；将目标基因突变质粒和野生型细胞株DNA进行按比例进行混合；向混合好的DNA溶液中加入所述DNA稳定剂，即可；

肺癌阴性质控品的制备：选取已鉴定为目标基因未发生突变的肺癌组织样本DNA；向DNA样本中加入所述DNA稳定剂，即可；

肺癌融合阳性质控品的制备：选取已鉴定为目标基因发生融合突变的肺癌组织样本RNA；向RNA样本中加入所述RNA稳定剂，即可；

肺癌融合阴性质控品的制备：选取已鉴定为目标基因未发生融合突变的肺癌组织样本RNA；向RNA样本中加入所述RNA稳定剂，即可。

优选地，DNA样本与DNA稳定剂的用量体积比为25～35：1。

更优选地，DNA样本与DNA稳定剂的用量比为30：1。

优选地，RNA样本与RNA稳定剂的用量体积比为15～25：1。

更优选地，RNA样本与RNA稳定剂的用量比为20：1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的基于二代测序平台，尤其是针对于广州市达瑞生物技术股份有限公司的DR-Seq 800基因测序平台的可稳定保存肺癌多基因联合检测试剂盒质控品用途在于保证肺癌多基因联合检测试剂盒的准确性、稳定性以及可靠性。

对比于现有技术，本发明的优点在于：

(1)本发明提供的肺癌质控品中所含DNA稳定剂可以有效防止游离DNA的降解，为DNA提供稳定的环境，延长肺癌质控品的保存时间；

(2)本发明提供的肺癌融合质控品中所含RNA稳定剂可以有效防止游离RNA的降解，为RNA提供稳定的环境，延长肺癌融合质控品的保存时间；

(3)本发明提供的DNA稳定剂成分以及使用成分的比例是经过大量实验以及统计结果分析得出，具有很好的保护游离DNA的效果；

(4)本发明提供的RNA稳定剂成分以及使用成分的比例是经过大量实验以及统计结果分析得出，具有很好的保护游离RNA的效果；

(5)本发明肺癌质控品中DNA稳定剂的使用比例是发明人经过大量实验和统计结果分析得出，可以使肺癌质控品具有很好的稳定性；

(6)本发明肺癌融合质控品中RNA稳定剂的使用比例是发明人经过大量实验和统计结果分析得出，可以使肺癌融合质控品具有很好的稳定性；

(7)本发明提供的DNA质控品具有制备成本低、性能稳定和易保存等优点，可有效地监控人员操作、仪器状态以及试剂盒有效性等因素，极大地提高了检测试剂盒的准确性和可靠性。

具体实施方式

下面结合说明书和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种DNA稳定剂

含有：80g/L的EDTA-3K、900g/L的金精三羧酸盐、90mg/L的甘氨酸和10mg/L的盐酸甜菜碱。

实施例2一种DNA稳定剂

含有：70g/L的EDTA-3K、800g/L的金精三羧酸盐、80mg/L的甘氨酸和8mg/L的盐酸甜菜碱。

实施例3一种DNA稳定剂

含有：100g/L的EDTA-3K、1000g/L的金精三羧酸盐、100mg/L的甘氨酸和11mg/L的盐酸甜菜碱。

实施例4一种RNA稳定剂

含有60g/L的EDTA-3K、800g/L的金精三羧酸盐、40mg/L的丝氨酸抑制剂和15mg/L的盐酸甜菜碱。

实施例5一种RNA稳定剂

含有50g/L的EDTA-3K、600g/L的金精三羧酸盐、30mg/L的丝氨酸抑制剂和12mg/L的盐酸甜菜碱。

实施例6一种RNA稳定剂

含有80g/L的EDTA-3K、900g/L的金精三羧酸盐、50mg/L的丝氨酸抑制剂和16mg/L的盐酸甜菜碱。

实施例7 DNA稳定剂对游离DNA保护效果

一、实验方法

经过肺癌多基因联合检测试剂盒验证过为野生型的6例DNA样本进行提取，分别进行浓度测定，各自的浓度为：样本1：23.56ng/μL，样本2：26.78ng/μL，样本3：20.12ng/μL，样本4：18.65ng/μL，样本5：25.72ng/μL，样本6：19.89ng/μL。然后每一个样本分成6等份，按照表1进行实验设计，添加或不添加实施例1中的DNA稳定剂，保存一定时间，期间冻融或不冻融；1个月后，通过Agilent 2100生物分析仪分别测定各组别的样品DNA浓度，从而了解DNA样本降解情况。同时利用以下公式计算降解率：降解率％＝(实验前DNA浓度-实验后DNA浓度)/实验前DNA浓度×100％。

样本与DNA稳定剂的用量体积比为30：1。

表1：

二、实验结果

1个月后，对18个实验组和18个对照组进行浓度检测，具体结果如下表2。

表2：

根据实验结果表明，在同等条件下，加入本发明的DNA稳定剂的DNA样本，DNA降解率明显比没有加入DNA稳定剂的DNA样本低；因此可见，本发明的DNA稳定剂可有效保护DNA不被降解。

实施例8 RNA稳定剂对游离RNA保护效果

一、实验方法

经过肺癌多基因联合检测试剂盒验证过为野生型的6例RNA样本进行提取，分别进行浓度测定，各自的浓度为：样本1：24.45ng/μL，样本2：28.34ng/μL，样本3：23.62ng/μL，样本4：25.77ng/μL，样本5：24.21ng/μL，样本6：23.91ng/μL。然后每一个样本分成6等份，按照表3进行实验设计，添加或不添加实施例4中的RNA稳定剂，保存一定时间，期间冻融或不冻融；2周后，通过Agilent 2100生物分析仪分别测定各组别的样品RNA浓度，从而了解RNA样本降解情况。同时利用以下公式计算降解率：降解率％＝(实验前RNA浓度-实验后RNA浓度)/实验前RNA浓度×100％。

表3：

二、实验结果

2周后，对18个实验组和18个对照组进行浓度检测，具体结果如下表4。

表4：

根据实验结果表明，在同等条件下，加入本发明的RNA稳定剂的RNA样本，RNA降解率明显比没有加入RNA稳定剂的RNA样本低；因此可见，本发明的RNA稳定剂可有效保护RNA不被降解。

实施例9一种基于DR-Seq 800基因测序平台肺癌多基因联合检剂盒质控品

一、组成

含有肺癌阳性质控品、肺癌阴性质控品、肺癌融合阳性质控品、肺癌融合阴性质控品；

其中，所述肺癌阳性质控品包括已发生目标基因突变的质粒、野生型细胞株DNA以及DNA稳定剂；

所述肺癌阴性质控品包括未发生目标基因突变的DNA以及DNA稳定剂；

所述肺癌融合阳性质控品包括目标基因发生融合的RNA以及RNA稳定剂；

所述肺癌融合阴性质控品包括目标基因未发生融合的RNA以及RNA稳定剂；

所述目标基因为EGFR、KRAS、BRAF、ERBB2、ALK、ROS1和RET基因质控品中的至少一种。

所述DNA稳定剂中含有80g/L的EDTA-3K、900g/L的金精三羧酸盐、90mg/L的甘氨酸和10mg/L的盐酸甜菜碱。

所述RNA稳定剂中含有60g/L的EDTA-3K、800g/L的金精三羧酸盐、40mg/L的丝氨酸抑制剂和15mg/L的盐酸甜菜碱。

二、制备方法

肺癌阳性质控品的制备：设计目标基因突变质粒；将目标基因突变质粒和野生型细胞株DNA进行按比例进行混合；向混合好的DNA溶液中加入所述DNA稳定剂，即可；

肺癌阴性质控品的制备：选取已鉴定为目标基因未发生突变的肺癌组织样本DNA；向DNA样本中加入所述DNA稳定剂，即可；

肺癌融合阳性质控品的制备：选取已鉴定为目标基因发生融合突变的肺癌组织样本RNA；向RNA样本中加入所述RNA稳定剂，即可；

肺癌融合阴性质控品的制备：选取已鉴定为目标基因未发生融合突变的肺癌组织样本RNA；向RNA样本中加入所述RNA稳定剂，即可。

其中，DNA样本与DNA稳定剂的用量体积比为30：1；RNA样本与RNA稳定剂的用量体积比为20：1。

三、使用方法

按照肺癌多基因联合检测试剂盒说明书对上述质控品进行操作，然后用DR-Seq800基因测序平台进行上机测序，得到每一个质控品的结果。肺癌阳性质控品检测结果应为发生突变，肺癌阴性质控品应为野生型；肺癌融合阳性质控品应为发生融合，肺癌融合阴性质控品应为不发生融合。

实施例10质控品稳定性和准确性

一、实验方法

实验组：生产三批实施例9的质控品，每一批中随机抽取1盒，分别标记为实验组1、实验组2、实验组3。

对照组：生产三批没有添加实施例1、实施例2所述的稳定剂的肺癌多基因联合检测试剂盒质控品，每一批中随机抽取1盒，分别标记为对照组1、对照组2、对照组3。

然后，按照肺癌多基因联合检测试剂盒说明书操作，分别对3组实验组和3组对照组用DR-Seq 800基因测序平台进行测序，记录第一次测序结果；最后按照3个月后、6个月后、9个月后分别按照上述操作进行测序，记录测序结果。具体实验方案如下表5。

表5：

实验组1	0个月测序结果	3个月测序结果	6个月测序结果	9个月测序结果
					实验组2	0个月测序结果	3个月测序结果	6个月测序结果	9个月测序结果
实验组3	0个月测序结果	3个月测序结果	6个月测序结果	9个月测序结果
					对照组1	0个月测序结果	3个月测序结果	6个月测序结果	9个月测序结果
对照组2	0个月测序结果	3个月测序结果	6个月测序结果	9个月测序结果
					对照组3	0个月测序结果	3个月测序结果	6个月测序结果	9个月测序结果

二、实验结果

按照实验方案设计，0个月、3个月、6个月、9个月的实验结果如下表6。

表6：

根据实验结果表明，添加了实施例1、实施例2所述的稳定剂的肺癌多基因联合检测试剂盒质控品在0个月、3个月、6个月、9个月用DR-Seq 800基因测序平台进行测序的结果都是一致，并且都符合肺癌多基因联合检测试剂盒说明书要求；而没有添加实施例1、实施例2所述的稳定剂的肺癌多基因联合检测试剂盒质控品在6个月就开始测序失败，9个月后3批全部失败；因此可见，本发明的DNA稳定剂以及RNA稳定剂可应用于肺癌多基因联合检测试剂盒的质控品，同时提高了肺癌多基因联合检测试剂盒的质控品的稳定性以及准确性。

实施例11 DNA稳定剂组份对游离DNA保护效果

一、实验方法

经过肺癌多基因联合检测试剂盒验证过为野生型的DNA样本进行大量提取，然后进行浓度测定，浓度为：25.16ng/μL。对该样本分成18等份，按照表7配制不同组成的DNA稳定剂，样本与各组DNA稳定剂分别按照用量体积比为30：1进行混合，之后分别放到-20℃保存，1个月后，通过Agilent 2100生物分析仪分别测定各组别的样品DNA浓度，从而了解DNA样本降解情况。同时利用以下公式计算降解率：降解率％＝(实验前DNA浓度-实验后DNA浓度)/实验前DNA浓度×100％。

表7：

二、实验结果

1个月后，对1个实验组和17个对照组进行浓度检测，具体结果如下表8。

表8：

根据实验结果表明，在同等条件下，本发明提供的DNA稳定剂组分同时包含EDTA-3K、金精三羧酸盐、甘氨酸和盐酸甜菜碱时(实验组1)才能显著提高DNA的稳定性，有效防止其在保存过程中的降解。本发明DNA稳定剂的组分是发明人经过大量研究和统计分析得出的，缺少其中任何一种、两种或三组分(对照组1～14)，或者将EDTA-3K换成其他的EDTA(对照组15)、甘氨酸替换为其他类型的氨基酸(对照组16)都不能实现本发明的效果。

实施例12 DNA稳定剂组份浓度对游离DNA保护效果

一、实验方法

经过肺癌多基因联合检测试剂盒验证过为野生型的DNA样本进行大量提取，然后进行浓度测定，浓度为：24.67ng/μL。对该样本分成20等份，按照表9进行实验设计，分别放到-20℃保存，1个月后，通过Agilent 2100生物分析仪分别测定各组别的样品DNA浓度，从而了解DNA样本降解情况。同时利用以下公式计算降解率：降解率％＝(实验前DNA浓度-实验后DNA浓度)/实验前DNA浓度×100％。

表9：

二、实验结果

1个月后，对11个实验组和9个对照组进行浓度检测，具体结果如下表10。

表10：

根据实验结果表明，在同等条件下，本发明提供的DNA稳定剂中EDTA-3K、金精三羧酸盐、甘氨酸和盐酸甜菜碱的浓度比(70～100g/L)：(800～1000g/L)：(80～100mg/L)：(8～11mg/L)(实验组1～11)可有效防止游离DNA在保存过程中的降解，同时EDTA-3K、金精三羧酸盐、甘氨酸和盐酸甜菜碱的浓度比为80g/L：900g/L：90mg/L：10mg/L(实验组1)效果最优。本发明DNA稳定剂组分中所用比例是发明人经过大量研究和统计分析得出的，只有在本发明范围内的使用比例才能使DNA稳定剂对游离DNA保存效果最大化，不在本发明范围内组分使用比例的增加或减少均会显著降低本发明DNA稳定剂对游离DNA保存效果(对照组1～9)。其他不在本发明比例范围内组分使用量对DNA稳定剂保存效果的影响实验结果与本实施例类似，具体数据省略。

实施例13 RNA稳定剂组份对游离RNA保护效果

一、实验方法

经过肺癌多基因联合检测试剂盒验证过为野生型的RNA样本进行大量提取，然后进行浓度测定，浓度为：23.43ng/μL。对该样本分成18等份，按照表11配制不同组成的RNA稳定剂，样本与各组RNA稳定剂分别按照用量体积比为20：1进行混合，分别放到-20℃保存，1个月后，通过Agilent 2100生物分析仪分别测定各组别的样品RNA浓度，从而了解RNA样本降解情况。同时利用以下公式计算降解率：降解率％＝(实验前RNA浓度-实验后RNA浓度)/实验前RNA浓度×100％。

表11

二、实验结果

1个月后，对1个实验组和17个对照组进行浓度检测，具体结果如下表12。

表12

根据实验结果表明，在同等条件下，本发明提供的RNA稳定剂组分同时包含EDTA-3K、金精三羧酸盐、甘氨酸和盐酸甜菜碱时(实验组1)才能显著提高DNA的稳定性，有效防止其在保存过程中的降解。本发明RNA稳定剂的组分是发明人经过大量研究和统计分析得出的，缺少其中任何一种、两种或三组分(对照组1～14)，或者将EDTA-3K换成其他的EDTA(对照组15)、甘氨酸替换为其他类型的氨基酸(对照组16)都不能实现本发明的效果。

实施例14 RNA稳定剂组份浓度对游离RNA保护效果

一、实验方法

经过肺癌多基因联合检测试剂盒验证过为野生型的RNA样本进行大量提取，然后进行浓度测定，浓度为：23.56ng/μL。对该样本分成22等份，按照表13进行实验设计，分别放到-20℃保存，1个月后，通过Agilent 2100生物分析仪分别测定各组别的样品RNA浓度，从而了解RNA样本降解情况。同时利用以下公式计算降解率：降解率％＝(实验前RNA浓度-实验后RNA浓度)/实验前RNA浓度×100％。

表13

二、实验结果

1个月后，对13个实验组和9个对照组进行浓度检测，具体结果如下表14。

表14

根据实验结果表明，在同等条件下，本发明提供的RNA稳定剂中EDTA-3K、金精三羧酸盐、甘氨酸和盐酸甜菜碱的浓度比(50～80g/L)：(600～900g/L)：(30～50mg/L)：(12～16mg/L)(实验组1～13)可有效防止游离RNA在保存过程中的降解，同时EDTA-3K、金精三羧酸盐、甘氨酸和盐酸甜菜碱的浓度比为60g/L：800g/L：40mg/L：15mg/L(实验组1)效果最优。本发明RNA稳定剂组分中所用比例是发明人经过大量研究和统计分析得出的，只有在本发明范围内的使用比例才能使RNA稳定剂对游离RNA保存效果最大化，不在本发明范围内组分使用比例的增加或减少均会显著降低本发明RNA稳定剂对游离RNA保存效果(对照组1～9)。其他不在本发明比例范围内组分使用量对RNA稳定剂保存效果的影响实验结果与本实施例类似，具体数据省略。