β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法
阅读说明：本技术 β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法 (Preparation method of beta-glucosidase immobilized enzyme ) 是由 史楠 王海宾 严文霞 王芳 高莉 李紫玉 郭建峰 杨沛阳 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法,包括以下步骤：将预处理好的大孔树脂置于容器中,向容器中加入PBS缓冲液,平衡后再加入β-葡萄糖苷酶原溶液,然后将容器置于恒温振荡培养箱中振荡吸附,吸附结束后,将大孔树脂与剩余液体分离,用PBS缓冲液将分离后的大孔树脂冲洗至冲洗液中检测不到蛋白,然后再加入PBS缓冲液和戊二醛试剂进行交联,交联结束后,用PBS缓冲液清洗大孔树脂数次,减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶。本发明的有益之处在于：该制备方法不仅工艺简单、成本低廉,而且制备得到的β-葡萄糖苷酶固定化酶在使用过程中稳定性好、催化效率高、可重复和连续利用。(The invention discloses a preparation method of beta-glucosidase immobilized enzyme, which comprises the following steps: placing the pretreated macroporous resin in a container, adding PBS (phosphate buffer solution) into the container, balancing, adding a beta-glucosidase zymogen solution, placing the container in a constant-temperature oscillation incubator for oscillation adsorption, separating the macroporous resin from the rest liquid after adsorption is finished, washing the separated macroporous resin with the PBS buffer solution until no protein can be detected in washing liquid, then adding the PBS buffer solution and a glutaraldehyde reagent for crosslinking, washing the macroporous resin with the PBS buffer solution for a plurality of times after crosslinking is finished, and drying under reduced pressure to obtain the beta-glucosidase immobilized enzyme. The invention has the advantages that: the preparation method has the advantages of simple process and low cost, and the prepared beta-glucosidase immobilized enzyme has good stability and high catalytic efficiency in the using process, and can be repeatedly and continuously utilized.)
技术领域
本发明涉及一种固定化酶的制备方法，具体涉及β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，属于生物化学技术领域。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)又称β-D-葡萄糖苷水解酶，又名纤维二糖酶、龙胆酸酶和杏仁糖酶，其英文名称是β-glucosidase，属于水解酶类。
β-葡萄糖苷酶是一种普遍存在的酶，在苦杏仁汁中最早被发现，这种酶广泛分布于细菌、真菌和植物中，是芳香前体物质水解、结合态糖苷配基释放的有效催化剂，是一类可以催化水解芳香基或烃基与糖基之间糖苷键的酶，其广泛应用于医疗、食品、生物质转化等各个领域，也作为工业食品和生物加工应用的高稳定性和活性催化剂。
β-葡萄糖苷酶虽然具有催化效率高、专一性强、不污染环境等优点，但是其价格昂贵、稳定性差、不易回收，这些问题制约了该酶在工业上的广泛应用。
应用酶的固定化技术，将酶固定于固体载体上，使酶能够进行重复回收利用，由于能够保护酶的催化基团，进而保留酶的催化活性。相对于游离酶，固定化酶具有稳定性好、易与底物和产物分离、催化反应容易控制、可以反复连续使用等优点，可以降低酶催化成本，在工业生产中应用广泛。
发明内容
本发明的目的在于提供一种β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，该制备方法不仅工艺简单、成本低廉，而且制备得到的β-葡萄糖苷酶固定化酶在使用过程中稳定性好、催化效率高、可重复和连续利用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：将预处理好的大孔树脂置于容器中，向容器中加入PBS缓冲液，平衡后再加入β-葡萄糖苷酶原溶液，然后将容器置于恒温振荡培养箱中振荡吸附；
Step2：吸附结束后，将大孔树脂与剩余液体分离，用PBS缓冲液将分离后的大孔树脂冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后再加入PBS缓冲液和戊二醛试剂进行交联；
Step3：交联结束后，用PBS缓冲液清洗大孔树脂数次，减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶，将β-葡萄糖苷酶固定化酶于4℃贮存备用。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step1中，前述大孔树脂选用的是带有伯胺基团的弱碱性阴离子交换树脂。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，前述带有伯胺基团的弱碱性阴离子交换树脂选用的是D315树脂或D914树脂。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在100mL磷酸盐反应体系中，D315树脂或D914树脂的加入量为0.1-0.4g。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step1中，前述恒温振荡培养箱的温度为常温，振荡时间为4-8h。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step2中，前述大孔树脂与戊二醛的用量比为100-500g：1mL。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step2中，交联反应温度为30-40℃，反应时间为0.5-2h。
本发明的有益之处在于：
(1)利用先吸附后交联的方法，即先通过静电引力作用将β-葡萄糖苷酶吸附在大孔树脂表面，再通过戊二醛交联形成β-葡萄糖苷酶固定化酶，制备得到的β-葡萄糖苷酶固定化酶在使用过程中稳定性好、催化效率高、可重复和连续利用，从而可以有效地降低工业成本；
(2)利用先吸附后交联的方法，工艺简单、成本低廉。
附图说明
图1是β-葡萄糖苷酶游离酶和固定化酶的温度稳定性曲线；
图2是β-葡萄糖苷酶固定化酶的重复使用性能图；
图3是β-葡萄糖苷酶固定化酶的酶活力曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
称取0.05g预处理好的D315树脂置于锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入49mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液，平衡后再加入1mLβ-葡萄糖苷酶原溶液，然后将锥形瓶置于恒温振荡培养箱中，常温振荡吸附8h。
将吸附完毕的D315树脂与剩余液体分离，将剩余液体于280nm下测OD值，计算其吸附量，将吸附完毕的D315树脂用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后加20mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液和1mL浓度为0.05％(v/v)的戊二醛试剂进行交联，交联反应温度为35℃，反应时间为1h。
交联结束后，用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液清洗D315树脂数次，减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶，将β-葡萄糖苷酶固定化酶贮存于4℃备用。
实施例2
称取0.1g预处理好的D914树脂置于锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入39mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液，平衡后再加入0.5mLβ-葡萄糖苷酶原溶液，然后将锥形瓶置于恒温振荡培养箱中，常温振荡吸附6h。
将吸附完毕的D914树脂与剩余液体分离，将剩余液体于280nm下测OD值，计算其吸附量，将吸附完毕的D914树脂用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后加20mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液和1mL浓度为0.02％(v/v)的戊二醛试剂进行交联，交联反应温度为40℃，反应时间为2h。
交联结束后，用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液清洗树脂数次，减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶，将β-葡萄糖苷酶固定化酶贮存于4℃备用。
实施例3
称取0.2g预处理好的D315树脂置于锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入49mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液，平衡后再加入2mLβ-葡萄糖苷酶原溶液，然后将锥形瓶置于恒温振荡培养箱中，于常温振荡吸附4h。
将吸附完毕的D315树脂与剩余液体分离，将剩余液体于280nm下测OD值，计算其吸附量，将吸附完毕的D315树脂用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后加40mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液和2mL浓度为0.02％(v/v)的戊二醛试剂进行交联，交联反应温度为30℃，反应时间为0.5h。
交联结束后，用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液清洗树脂数次，减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶，将β-葡萄糖苷酶固定化酶贮存于4℃备用。
对β-葡萄糖苷酶固定化酶的热稳定性进行研究
取β-葡萄糖苷酶游离酶和实施例1制得的β-葡萄糖苷酶固定化酶，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下保温30min，然后分别测定酶活力，以最高活力为100％，做β-葡萄糖苷酶固定化酶和游离酶的温度稳定性曲线，得到的曲线如图1所示。
由图1可知，在40℃-50℃温度范围内，β-葡萄糖苷酶游离酶的温度稳定性略高于β-葡萄糖苷酶固定化酶的温度稳定性，但在60℃以后，β-葡萄糖苷酶游离酶的温度稳定性远远低于β-葡萄糖苷酶固定化酶的温度稳定性。这说明：在高温环境中，β-葡萄糖苷酶固定化酶比β-葡萄糖苷酶游离酶更加稳定，更耐受高温环境。
对β-葡萄糖苷酶固定化酶的重复使用性能进行研究
取实施例2制得的β-葡萄糖苷酶固定化酶，测定酶活力，然后按照1:1的质量比向β-葡萄糖苷酶固定化酶中添加底物pNPG，反应10min，反应完毕后，冲洗干净酶，第2次测定酶活力，之后再按照1:1的质量比向β-葡萄糖苷酶固定化酶中添加底物pNPG，再反应10min，反应结束后再测定酶活力，如此重复操作多次，测定10次酶活力，以第1次测得的酶活力值为100％，作β-葡萄糖苷酶固定化酶的重复使用性能图，得到的β-葡萄糖苷酶固定化酶的重复使用性能图如图2所示。
由图2可知，固定后的酶——β-葡萄糖苷酶固定化酶在连续使用6次后，酶活力基本稳定，变化不大，在连续使用10次后，酶活性仍能保持在50％以上。
这说明：固定化载体与酶的结合比较稳定且不容易脱落，且酶活性保持稳定，β-葡萄糖苷酶固定化酶可重复和连续利用。
β-葡萄糖苷酶固定化酶对实际样品——沙棘汁的生物转化效果的研究
将实施例3制得的β-葡萄糖苷酶固定化酶置于填充床反应器中，然后将沙棘汁也置于同一个填充床反应器中，在室温下，使沙棘汁在填充床反应器中进行连续反应，调整沙棘液的流速为2mL/10min，然后每10min收集1次酶解产物，连续操作1000min(相当于重复使用100次β-葡萄糖苷酶固定化酶)，之后测定酶解产物中还原糖的含量，并换算成β-葡萄糖苷酶固定化酶的酶活力，评价β-葡萄糖苷酶固定化酶对实际样品——沙棘汁的生物转化效果，具体的，以第1次测得的酶活力值为100％，以柱体积为横坐标，以相对酶活力为纵坐标，作β-葡萄糖苷酶固定化酶的酶活力曲线图，得到的酶活力曲线图如图3所示。
由图3可知，采用本发明提供的方法制备得到的β-葡萄糖苷酶固定化酶随反应时间的延长，酶活力在一定范围内呈小幅下降，但总体趋于稳定，且酶活较高，催化效率较高。
综上所述，采用本发明提供的方法制备得到的β-葡萄糖固定化酶稳定性好、易与底物分离、催化反应易于控制、可以多次重复利用，从而可以有效地降低工业成本。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。