阅读说明：本技术 一种固定化菌剂及其制备方法和应用 (Immobilized microbial inoculum and preparation method and application thereof ) 是由 陈惠明 蒋自胜 翟德勤 余艳鸽 郑茂盛 李金波 孙小玲 于 2019-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及菌剂固定化技术领域,具体公开一种固定化菌剂及其制备方法和应用。所述固定化菌剂,包含不动杆菌和固定化载体。所述的固定化菌剂的制备方法,至少包括以下步骤：将所述聚乙烯醇溶于蒸馏水中,得到第一溶液；将所述天然高分子凝胶载体溶于蒸馏水中,得到第二溶液,并将所述第二溶液与所述第一溶液混合、灭菌,得到第三溶液；将灭菌后的活性炭加入到菌悬液中,静置吸附,将吸附后的菌悬液加入到所述第三溶液中,混合均匀,得到第四溶液；将所述第四溶液滴加到CaCl<Sub>2</Sub>的饱和硼酸溶液中,在3-5℃的条件下反应,过滤、洗涤、干燥得到固定化菌剂。本发明以包埋法制备固定化菌剂,方法简便,条件温和,稳定性好。(The invention relates to the technical field of microbial inoculum immobilization, and particularly discloses an immobilized microbial inoculum, and a preparation method and application thereof. The immobilized microbial inoculum comprises acinetobacter and an immobilized carrier. The preparation method of the immobilized microbial inoculum at least comprises the following steps: dissolving the polyvinyl alcohol in distilled water to obtain a first solution; dissolving the natural polymer gel carrier in distilled water to obtain a second solution, mixing the second solution with the first solution, and sterilizing to obtain the natural polymer gel carrierTo a third solution; adding sterilized activated carbon into the bacterial suspension, standing for adsorption, adding the adsorbed bacterial suspension into the third solution, and uniformly mixing to obtain a fourth solution; dropwise adding the fourth solution into CaCl 2 Reacting in saturated boric acid solution at 3-5 deg.C, filtering, washing, and drying to obtain immobilized bacteria agent. The invention prepares the immobilized microbial inoculum by an embedding method, and has the advantages of simple method, mild condition and good stability.)

一种固定化菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及菌剂固定化技术领域，尤其涉及一种固定化菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

工农业的迅速发展和人类的生产活动，给水体环境带来了严重的污染。氮超标是水体污染中最常见的一类污染问题，其会引起水体富营养化，导致藻类大量繁殖，水体溶氧降低，水体黑臭，这不仅危及人类的用水安全，还会严重影响水体的生态平衡；另外，氮排放过量还会导致氮平衡被破坏，从而造成水体失去自净功能。因此，富含氮的污水需要经过脱氮处理达标后才能排放到自然环境中。

生物脱氮是目前应用广泛的脱氮方法，有处理效果好、处理过程稳定可靠和操作管理方便等优点。传统的生物脱氮是利用硝化菌的好氧自养硝化作用和反硝化菌的厌氧异养反硝化作用共同完成，这样的生物脱氮需要分别提供有氧和无氧的两个反应器以分别进行硝化作用和反硝化作用，以达到脱氮的目的。故这样的反应器所占空间较大，运行成本较高，工艺较为繁琐。

同时由于生物脱氮菌容易退化、失活，如何解决生物脱氮菌的保藏是生产中面临的首要问题。随着20世70年代兴起的固定化微生物细胞技术的发展，为细胞浓缩和发酵剂保藏开辟了新的途径。但是固定化并不适用于所有微生物，有些菌株固定化后活性甚至会降低。

发明内容

针对现有生物脱氮成本高、工艺繁琐、固定化工艺降低菌种活性等问题，本发明提供一种固定化菌剂。

以及，所述固定化菌剂的制备方法。

以及，所述固定化菌剂的应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种固定化菌剂，包含不动杆菌和固定化载体，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16620。

本发明提供的固定化菌剂，具有以下优势：

本发明将不动杆菌以固定化菌剂的形式保存，解决不动杆菌的难以保藏的问题，使得不动杆菌具有更高的生理活性和稳定性，有利于在使用时保持高活菌浓度、提高降解含氮污水的速率，并且固定化菌剂还具有便于施用、分离和可重复使用的优点。

本发明提供的不动杆菌是一种好氧反硝化菌，该不动杆菌通过生物培养手段富集筛选得到，该不动杆菌具有在有氧条件下能发挥反硝化作用的特点，采用该好氧反硝化菌株代替了常规的厌氧反硝化菌，进行污水的生物脱氮处理时，可以使硝化作用和反硝化作用在一个反应中进行，因此具有简化污水处理流程，降低基建运行成本，提高生物脱氮的效果，该不动杆菌在含氮污水处理方面具有很好的应用前景。

具体地，该新发现的不动杆菌命名为Acinetobacter sp.A3，该菌株具有优异的好氧反硝化功能，可利用硝态氮作为唯一氮源进行新陈代谢，在有氧条件下通过反硝化作用将硝态氮转化为气态产物而达到脱氮目的。本发明实施例发现的不动杆菌从城市黑臭水体筛选到，是一种可应用于城市黑臭水体治理中的具有高效好氧反硝化能力的脱氮菌株；将该不动杆菌进行污水处理的过程中，可将分别置有硝化菌和反硝化菌的好氧反应器和厌氧反应器合并为一个同时置有硝化菌和不动杆菌的一步式好氧反应器，从而简化污水处理流程，降低基建运行成本，提高生物脱氮的效果。

优选地，所述不动杆菌的16S rDNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明提供的不动杆菌的16S rDNA基因序列如下所示：

SEQ ID NO.1：

GGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGATTAGCATCCTATCGCTAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGACATTACTCGCTGGCAAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATGTAAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTTACTATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTGTTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCACACTCTAGCTAACCAGTATCGAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATTTGACTTAATTAGCCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCTCTAGGTATTAACTAAAGTAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTACAACCATAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTAGCGCAAGGTCCGAAGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCATTCCTTTCGAAATGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTAA。

该序列长度为1282bp，在GenBank中基因序列的登录号为MK163532。将该菌的基因序列上传至GenBank中进行比对，比对结果表明：该菌的基因序列与Acinetobacter的序列相似性最高。因此，结合细菌的形态特征判断该菌株属于不动杆菌(Acinetobacter)，并将其命名为Acinetobacter sp.A3。

具体地，本实施例的菌株Acinetobacter sp.A3已于2018年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路，其保藏编号为CGMCC NO.16620。

优选地，所述固定化菌剂采用包埋法将所述不动杆菌的菌悬液负载到所述固定化载体上。

本申请采用包埋法直接利用不动杆菌进行负载，免去了复杂的不动杆菌的提取步骤，制作方便，成本低廉。

优选地，所述固定化载体与所述菌悬液的质量比为0.8-1.2:0.8-2，所述固定化载体包括质量比为8-10:1-2的聚乙烯醇和天然高分子凝胶载体，所述天然高分子凝胶载体为海藻酸钠或琼脂。

优选地，以海藻酸钠或琼脂中的一种与聚乙烯醇复配对不动杆菌进行固定，海藻酸钠或琼脂能让固定化菌剂成球容易，并且传质性能好，聚乙烯醇能增加固定化菌的机械强度，若是聚乙烯醇与天然高分子凝胶载体的比例过高，固定化菌剂内部结构紧密，基质传递受到影响，不动杆菌活性有所降低；若是聚乙烯醇与天然高分子凝胶载体的比例过小，成球容易，但是其机械强度会有所降低。

优选地，所述菌悬液为将所述不动杆菌培养至对数生长期的菌悬液，且所述菌悬液的OD600为0.60-0.63。

对数生长期的微生物生长速度最大，细胞数量呈指数递增，选择对数生长期的菌悬液能保证制备的固定化菌剂生长速度高，并具有高的生物活性。

采用紫外分光光度计测定所述菌液在600nm波长下的吸光度数值记为OD600，OD600的数值验证菌液中不动杆菌的含量，进而控制菌液是否处于对数生长期。

进一步地，本发明还提供上述固定化菌剂的制备方法。该制备方法，至少包括以下步骤：

步骤a、将所述聚乙烯醇溶于蒸馏水中，得到第一溶液；

步骤b、将所述天然高分子凝胶载体溶于蒸馏水中，得到第二溶液，并将所述第二溶液与所述第一溶液混合、灭菌，得到第三溶液；

步骤c、将灭菌后的活性炭加入到菌悬液中，静置吸附，将吸附后的菌悬液加入到所述第三溶液中，混合均匀，得到第四溶液；

步骤d、将所述第四溶液滴加到CaCl₂饱和硼酸溶液中，在3-5℃的条件下反应，过滤、洗涤、干燥得到固定化菌剂。

相对于现有技术，本发明提供的固定化菌剂的制备方法具有以下优势：

本发明以包埋法制备固定化菌剂，方法简便，条件温和，稳定性好；天然高分子凝胶载体首先与聚乙烯醇进行交联，提高成球性和机械强度，再利用天然高分子凝胶载体与CaCl₂饱和硼酸溶液中的钙离子形成不溶于水的螯合物凝胶，从而将微生物固定在凝胶内，并利用天然高分子凝胶载体的特性，减轻在固定化过程中凝胶化剂硼酸对微生物的生物毒性，提高固定化颗粒的生物活性。

优选地，步骤a中，将所述聚乙烯醇加入到蒸馏水中，在85-95℃的温度下加热50-70min，得到浓度为8-10wt％的所述第一溶液。

优选地聚乙烯醇的溶解条件使得聚乙烯醇溶解更加充分，并提高溶解速度。

优选地，步骤b中，将所述天然高分子凝胶载体加入到蒸馏水中，在75-85℃的温度下加热15-25min，得到浓度为1-2wt％的第二溶液。

优选地天然高分子凝胶载体的溶解条件使得天然高分子凝胶载体的溶解更加充分，并提高溶剂溶解速度。

优选地，步骤b中，所述的灭菌条件为：灭菌温度120-125℃，灭菌时间：15-25min。

对所述的第三溶液进行灭菌，保证后期过程中不引入其他的细菌，进而影响不动杆菌的活性，甚至影响菌剂处理含氮污水的效果。

优选地，步骤c中，所述活性炭与所述菌悬液的固液比为1:5-6。

优选地，步骤c中，所述静置吸附的时间为15-25min。

利用活性炭具有多孔，比表面积较大，吸附能力较强的特性，将活性炭加入到菌悬液中后，促进不动杆菌向活性炭移动，使活性炭表面富集微生物，为制备固定化菌剂提供基础。

优选地，步骤d中，所述CaCl₂饱和硼酸溶液的中CaCl₂浓度为3-5wt％。

CaCl₂饱和硼酸溶液作为交联剂，和天然高分子凝胶载体进行反应，若是浓度低，CaCl₂含量不足，固定化菌剂容易破裂导致不能重复使用，而浓度高，CaCl₂含量过多，会影响固定化菌剂的传质。

优选地，步骤d中，反应时间为22-26h。

优选地，步骤d中，所述干燥温度为25-35℃。

进一步地，本发明还提供所述固定化菌剂含氮污水处理领域中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的固定化菌剂的脱氮性能图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明实施例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和固定化载体，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16620。

上述固定化菌剂的该制备方法，包括以下步骤：

步骤a、将所述聚乙烯醇8g加入到100mL蒸馏水中，在90℃的温度下加热60min，得到浓度为8wt％的所述第一溶液；

步骤b、将所述海藻酸钠1g加入到100mL蒸馏水中，在80℃的温度下加热20min，得到浓度为1wt％的第二溶液，并将所述第二溶液与所述第一溶液混合均匀，在121℃的条件下灭菌20min，得到第三溶液；

步骤c、将灭菌后的活性炭2g加入到对数生长期的10mL菌悬液中，菌悬液的OD600为0.613，静置吸附20min，将吸附后的菌悬液加入到所述第三溶液中，混合均匀，得到第四溶液；

步骤d、用灭菌后的注射器将所述第四溶液滴加到4wt％CaCl₂饱和硼酸溶液中，在4℃的条件下反应24h，过滤，生理盐水洗涤3次，在30℃条件下干燥得到固定化菌剂。

实施例2

本发明实施例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和固定化载体，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16620。

上述固定化菌剂的该制备方法，包括以下步骤：

步骤a、将所述聚乙烯醇10g加入到100mL蒸馏水中，在95℃的温度下加热50min，得到浓度为10wt％的所述第一溶液；

步骤b、将所述海藻酸钠2g加入到100mL蒸馏水中，在85℃的温度下加热15min，得到浓度为2wt％的第二溶液，并将所述第二溶液与所述第一溶液混合均匀，在125℃的条件下灭菌15min，得到第三溶液；

步骤c、将灭菌后的活性炭1.7g加入到10mL菌悬液中，菌悬液的OD600为0.63，静置吸附25min，将吸附后的菌悬液加入到所述第三溶液中，混合均匀，得到第四溶液；

步骤d、用灭菌后的注射器将所述第四溶液滴加到5wt％CaCl₂饱和硼酸溶液中，在5℃的条件下反应22h，过滤，生理盐水洗涤3次，在25℃条件下干燥得到固定化菌剂。

实施例3

本发明实施例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和固定化载体，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16620。

上述固定化菌剂的该制备方法，包括以下步骤：

步骤a、将所述聚乙烯醇9g加入到100mL蒸馏水中，在85℃的温度下加热70min，得到浓度为9wt％的所述第一溶液；

步骤b、将所述琼脂1.5g加入到100mL蒸馏水中，在75℃的温度下加热25min，得到浓度为1.5wt％的第二溶液，并将所述第二溶液与所述第一溶液混合均匀，在120℃的条件下灭菌25min，得到第三溶液；

步骤c、将灭菌后的活性炭1.8g加入到10mL菌悬液中，菌悬液的OD600为0.605，静置吸附15min，将吸附后的菌悬液加入到所述第三溶液中，混合均匀，得到第四溶液；

步骤d、用灭菌后的注射器将所述第四溶液滴加到3wt％CaCl₂饱和硼酸溶液中，在3℃的条件下反应26h，过滤，生理盐水洗涤3次，在35℃条件下干燥得到固定化菌剂。

实施例4

本对比例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和固定化载体，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16620。

所述固定化载体为聚乙烯醇和明胶，且所述聚乙烯醇和明胶的质量比为8:1。其余条件与实施例1相同，不再赘述。

上述固定化菌剂的制备方法如实施例1所述，不再赘述。

实施例5

本对比例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和固定化载体，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16620。

所述固定化载体为聚丙烯酰胺和海藻酸钠，且所述聚丙烯酰胺和海藻酸钠的质量比为8:1。其余条件与实施例1相同，不再赘述。

上述固定化菌剂的制备方法如实施例1所述，不再赘述。

为了更好的说明本发明实施例提供的固定化菌剂的特性，下面将实施例1-5制备的固定化菌剂进行性能测试，测试结果下表1所示，实施例1的对硝氮和亚硝氮的脱氮降解图如图1所示。

表1测试结果

	硝氮初始浓度	脱氮时间
			实施例1	100mg/L	16h
实施例2	100mg/L	16.2h
			实施例3	100mg/L	16.1h
实施例4	100mg/L	28h
			实施例5	100mg/L	28h

从表1中可以看出，本发明提供的的固定化菌剂能在28h内将浓度为100mg/L的硝氮全部降解，其中，实施例1-3的降解速率更优，16h左右即可全部降解。实施例4和5的载体传质效果稍差，28h左右可将硝氮降解完全。从图1可以看出，实施例1制备的固定化菌剂在好氧条件下在16h内将100mg/L的硝氮全部降解，同时将积累的亚硝氮降解完全，展示出良好的反硝化效果。实施例2-5制备的固定化细菌也能在相应时间内完全降解硝氮和亚硝氮。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。