一种使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶
阅读说明：本技术 一种使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶 (Method for immobilizing lipase by using carboxyl resin and immobilized lipase prepared by method ) 是由 胡云峰 朱衡 张云 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶。该方法使用EDC·HCl作为交联剂,将羧基载体和游离酶通过酰胺键连接,达到固定化的目的。经酶学性质测定发现,与游离脂肪酶比较,本发明制得的固定化脂肪酶IDA-LIPASE在热耐受性、可重复利用性、保存稳定性方面具有极佳的优势,此外,在该方法下,进行模拟10倍扩大化,当载体量扩大为实验条件的10倍时,固定化酶酶活获得提高,因此具备实际扩大化生产的潜力,利用本发明制备的固定化酶可以在实际应用中发挥较好的催化能力,并且可以为生产降低成本,具有方便、实用、经济的特点,具有重要的研究价值和实用价值。(The invention discloses a method for immobilizing lipase by using carboxyl resin and immobilized lipase prepared by the method. The method uses EDC & HCl as a cross-linking agent, and connects a carboxyl carrier and a free enzyme through an amide bond to achieve the purpose of immobilization. The enzyme property determination shows that compared with free LIPASE, the immobilized LIPASE IDA-LIPASE prepared by the invention has excellent advantages in the aspects of heat tolerance, reusability and storage stability, in addition, under the method, 10 times of amplification is simulated, and when the carrier quantity is amplified to 10 times of experimental conditions, the enzyme activity of the immobilized enzyme is improved, so that the immobilized enzyme has the potential of actual amplification production.)
技术领域
本发明属于生物化工与生物催化技术领域，具体涉及一种使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶。
背景技术
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一类能够催化酯水解、酯交换和酯合成等反应的重要工业酶，近些年来，科研人员发现，脂肪酶在生产生物柴油方面有重要的应用潜力，为促进脂肪酶在化工、环保、医药等行业的应用，固定化酶使得游离脂肪酶可以抵抗高温、搅拌等高强度的实际工业化条件。具有可操作易分离、经济方便、重复利用、稳定、机械强度高等优势，常用的固定化方法有包埋法、吸附法、交联法、共价结合法。所涉及的载体类型有天然载体(壳聚糖、甲壳素、硅藻土等)、无机载体(玻璃、金属、氧化铝、膨润土、二氧化硅)、新型载体(石墨烯、磁性粒子)。目前没有使用羧基树脂固定化脂肪酶的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用羧基树脂载体固定化脂肪酶的方法及由该方法制备的固定化脂肪酶，该固定化酶具备较好的耐热性、操作稳定性、保存稳定性，具备实际工业化生产的潜力。
本发明采取的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：
将羧基载体、交联剂和脂肪酶溶液混合，进行固定化反应，反应结束后抽滤去除残余酶液和交联剂，得到固定化酶。
所述的羧基载体为LX-1000IDA，尾部具有两个羧基活性基团。
所述的交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)。该交联剂有两个C＝N双键结构，可以与羧基进行反应。
具体的，所述的使用羧基树脂固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：将干燥的LX-1000IDA羧基树脂载体与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合，再加入脂肪酶溶液，混匀，所述的羧基树脂载体与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液、脂肪酶溶液的混合比例是2g:100mL:100mL，于25℃摇床振荡进行固定化反应6h，抽滤，去除残留的交联剂和酶液，得到固定化脂肪酶。
优选，所述的羧基树脂载体量/脂肪酶比例为0.2g:800U。
所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液的质量分数为1.2％，利用pH 4.5且质量分数为0.1％的磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液溶解。
所述的游离脂肪酶为海洋假丝酵母脂肪酶(CAS：9001-62-1；Assay≥50000U/g；分子量：67000Da)。利用pH 4.5且质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液配制成浓度为2mg/mL的脂肪酶溶液。
本发明的第二个目的是提供一种使用上述的羧基树脂固定化脂肪酶的方法制得的固定化脂肪酶。
本发明利用羧基载体(LX-1000IDA)共价结合制备得到固定化脂肪酶(海洋假丝酵母脂肪酶)，使用带有两个C＝N双键的交联剂EDC·HCl。羧基载体尾部的羧基与EDC·HCl的C＝N反应，形成复合物，后与脂肪酶的氨基反应，将脂肪酶固定于羧基载体上，制备得到固定化脂肪酶IDA-LIPASE，同时EDC·HCl结构脱落，降低结构复杂性。
进一步地，为了确定游离脂肪酶的酶学性质，提高重复利用性和各方面的稳定性。将得到的固定化脂肪酶IDA-LIPASE进行酶学性质的表征，确定其最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、酸碱稳定性、操作稳定性、保存稳定性。并与游离脂肪酶进行比较，发现其各方面的酶学性质都有提升，同时，模拟实际扩大固定化，载体量扩大十倍后，依据最优条件制备的固定化酶IDA-LIPASE酶活由114U/g提高到210U/g，具有较好的实际工业制备和应用潜力。
其中，IDA-LIPASE的最适反应温度提高了10℃，热稳定性也表现十分出色，在40、50、60、70℃环境中孵育3h后发现固定化酶相比于初始酶活是有不同程度的提高，最高提高40％左右。可以重复水解反应操作7次，其中在重复4次时还有50％的酶活，在重复第7次时还残留40％左右的酶活；在70℃的水浴锅中孵育3h，每隔0.5h取出一部分测残余酶活，发现而固定化酶在3h后还残留60％。而且发现其具备较宽的温度适应范围；保存稳定性表现优异，在4℃保存30天，仍保留84.6％的酶活。
本发明的有益效果为：经酶学性质测定发现，与游离脂肪酶(CRL)比较，使用羧基载体树脂固定化脂肪酶的方法制得的固定化脂肪酶IDA-LIPASE，提高了最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、操作重复性和保存稳定性。IDA-LIPASE在高温环境(40、50、60、70℃)中孵育3h后发现固定化酶相比于初始酶活是有不同程度的提高，最高提高40％左右。可以重复水解反应操作7次，其中在重复4次时还有50％的酶活，在重复第7次时还残留40％左右的酶活；在70℃的水浴锅中孵育3h，每隔0.5h取出一部分测残余酶活，发现，而固定化酶在3h后还残留60％。保存30天后，剩余84.6％酶活。该发明制备的固定化酶IDA-LIPASE在高温搅拌条件下的催化能力表现以及保存优势，使得该固定化酶具有广泛的应用潜力，可以进行实际扩大化生产，具有重要的研究实用价值。
附图说明
图1是固定化酶IDA-LIPASE的制备过程示意图。
图2是固定化酶IDA-LIPASE和游离酶CRL的最适反应pH表征。
图3是固定化酶IDA-LIPASE和游离酶CRL的最适反应温度表征。
图4是固定化酶IDA-LIPASE和游离酶CRL的热稳定性表征，其中(a)为固定化酶IDA-LIPASE和游离酶CRL在70℃的孵育环境中孵育3h，并且每隔30min测定的酶活结果；(b)为固定化酶IDA-LIPASE和游离酶CRL在不同温度(40℃、50℃、60℃、70℃)水浴环境中孵育3h后测定的酶活结果。
图5是固定化酶IDA-LIPASE和游离酶CRL的酸碱稳定性表征。
图6是固定化酶IDA-LIPASE和游离酶CRL的操作稳定性表征。
图7是固定化酶IDA-LIPASE和游离酶CRL的保存稳定性表征。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中使用羧基树脂载体固定化脂肪酶，所述的游离脂肪酶为海洋假丝酵母脂肪酶(CAS：9001-62-1；Assay≥50000U/g；分子量：67000Da)。以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为偶联剂，LX-1000IDA为羧基树脂载体。
实施例1羧基载体共价结合固定化脂肪酶的制备
(1)材料准备：羧基树脂载体LX-1000IDA提前一天于30℃干燥水分；配置2mg/mL游离酶液：将海洋假丝酵母脂肪酶(CRL)溶于pH 4.5且质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液配制成浓度为2mg/mL的脂肪酶溶液，离心留取上清液，现配现用；配置质量分数为1.2％EDC·HCl溶液：将EDC·HCl溶于pH 4.5且质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液配制成质量分数为1.2％的EDC·HCl溶液，现配现用。
(2)脂肪酶固定化：称取0.2g干燥的羧基树脂载体LX-1000IDA置50mL离心管，加入10mL质量分数为1.2％的EDC·HCl溶液，再加入10mL浓度为2mg/mL的游离酶液，所述的羧基树脂载体量/脂肪酶比例为0.2g:800U，于25℃摇床200rpm振荡固定化反应6h后，抽滤去除多余的酶液和EDC·HCl，28℃恒温箱干燥，得到固定化酶IDA-LIPASE，备用。固定化酶IDA-LIPASE的制备原理见图1。
实施例2固定化脂肪酶IDA-LIPASE与游离酶CRL最适反应条件的表征
(1)酶活测定方法：采用改进的铜皂分光光度法测定酶活(具体步骤见参考文献：侯爱军,徐冰斌,梁亮,等.改进铜皂-分光光度法测定脂肪酶活力[J].皮革科学与工程,2011,21(1):22-27.)。脂肪酶酶活定义为：在测定条件下(40℃，pH 7.0)，1min内催化底物水解产生1μmoL脂肪酸所需的酶量为1个酶活单位(U)。游离酶测定每mL含有的酶活单位数(U/mL)，固定化酶测定每g固定化酶含有的酶活单位数(U/g)。
(2)最适反应pH：将实施例1制得的固定化酶IDA-LIPASE与pH 7.0的游离酶CRL，在40℃反应温度下，采用pH为5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8的磷酸缓冲液环境中进行酶活测定，重复三次并进行比较。结果见图2，由图2可知，固定化酶IDA-LIPASE最适反应pH为8，相比于游离酶向碱性方向移动。
(3)最适反应温度：将实施例1制得的固定化酶IDA-LIPASE与pH 7.0的游离酶CRL，在以上确定出的最适反应pH下，采用不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)环境中进行酶活测定，重复三次并进行比较。结果见图3，由图3可知，固定化酶IDA-LIPASE最适反应温度为50℃，相比于游离酶提高10℃。
实施例3固定化脂肪酶IDA-LIPASE与游离酶CRL热稳定性的表征
参考实施例2的方法进行酶活检测。
热稳定性：将实施例1制得的固定化酶IDA-LIPASE与pH 7.0的游离酶CRL，①采用不同温度(40℃、50℃、60℃、70℃)水浴环境中孵育3h后，在以上确定出的最适反应pH和最适反应温度下进行酶活测定；②分别在70℃的孵育环境中孵育3h，并且每隔30min取出一部分测定酶活。利用以上两种方法探究固定化酶IDA-LIPASE与pH 7.0的游离酶CRL热稳定性的表现，重复三次并进行比较。结果见图4(a)和(b)，由图4可知，固定化酶IDA-LIPASE相比于游离酶CRL更能耐受高温的袭击，并且具备在更高温度(＞70℃)下催化的潜力。
实施例4固定化脂肪酶IDA-LIPASE与游离酶CRL酸碱稳定性的表征
参考实施例2的方法进行酶活检测。
酸碱稳定性：将实施例1制得的固定化酶IDA-LIPASE：在不同pH(pH5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5)磷酸缓冲液环境中孵育3h；游离酶CRL：利用不同pH磷酸缓冲液配置酶液，静置3h，在以上确定出的最适反应pH和最适反应温度下进行酶活测定；重复三次并进行比较。结果见图5。
实施例5固定化脂肪酶IDA-LIPASE与游离酶CRL操作稳定性的表征
参考实施例2的方法进行酶活检测。
操作稳定性：将实施例1制得的固定化酶IDA-LIPASE在相同的底物环境中重复进行催化底物水解反应，以第一次的酶活为100％，重复使用7次观察固定化酶重复使用性。结果见图6，由图6可知，固定化酶IDA-LIPASE在重复使用性方面表现优异，在操作7次后剩余40％酶活。
实施例6固定化脂肪酶IDA-LIPASE与游离酶CRL储存稳定性的表征
参考实施例2的方法进行酶活检测。
储存稳定性：将实施例1制得的固定化酶IDA-LIPASE分装成0.1g/1.5mL EP管，与pH 7.0的游离酶CRL，同时在4℃冰箱环境中保存一个月，每隔5天测定当天(上午9点)的酶活，并进行比较。结果见图7，由图7可知，固定化酶IDA-LIPASE相比于游离酶CRL方便储藏，酶活损失小，在30d后剩余84.6％酶活。
实施例7固定化脂肪酶IDA-LIPASE的模拟实际扩大生产
参照实施例1的固定化脂肪酶的制备方法，模拟实际扩大固定化，载体量扩大十倍后，依据最优条件(pH 4.5、羧基树脂载体量/脂肪酶比例为0.2g:800U、固定反应时间6h，温度25℃、EDC·HCl在反应体系的终质量分数为0.6％)制备的固定化酶IDA-LIPASE酶活由114U/g提高到210U/g，具有较好的实际工业制备和应用潜力。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。