阅读说明：本技术 一种提高海参补肾壮阳功效的方法 (Method for improving kidney-tonifying and yang-strengthening effects of sea cucumber ) 是由 王群 马迪 于文静 贾盼盼 于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高海参补肾壮阳功效的方法,属于海洋生物技术领域。以海参深加工废弃物海参内脏为原料,集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术,研制开发出显著补肾壮阳功效的海参多肽生物制品,其中混菌好氧发酵菌种主要包括富硒酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。所得海参多肽具有较强的抗氧化能力,提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理,满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。该工艺技术简单高效、所得产品抗氧化能力和补肾壮阳功效强,产品稳定性强,生产成本低,易于工业化规模生产。(The invention discloses a method for improving kidney-tonifying and yang-strengthening effects of sea cucumbers, and belongs to the technical field of marine organisms. The sea cucumber polypeptide biological product with the obvious kidney tonifying and yang strengthening effects is developed by taking sea cucumber deep processing waste sea cucumber viscera as raw materials and integrating the modern biological separation technology, the biological enzymolysis technology and the mixed bacteria microbial fermentation technology, wherein the mixed bacteria aerobic fermentation strain mainly comprises selenium-enriched saccharomyces cerevisiae, bacillus subtilis and bacillus licheniformis. The obtained sea cucumber polypeptide has strong oxidation resistance, and the extract can be subjected to concentration, adsorption drying, alcohol precipitation or resin purification and other treatments according to application approaches, so that the high-efficiency utilization in the fields of health care, food, medicine and the like is met. The process is simple and efficient, the obtained product has strong oxidation resistance, strong kidney-tonifying and yang-strengthening effects, strong product stability and low production cost, and is easy for industrial mass production.)

一种提高海参补肾壮阳功效的方法

技术领域

本发明涉及一种提高海参补肾壮阳功效的方法，尤其是一种利用海参内脏为原料通过微生物协同发酵制备具有显著补肾壮阳功效的海参多肽生物制品，属于海洋生物技术领域。

背景技术

海参是一种重要的海洋无脊椎动物，肉质细嫩、营养丰富，是典型的高蛋白、低脂肪的食物，具有极高的营养价值和药用价值， 对于高血压、冠心病、肝炎等患者以及老年人而言是食疗佳品，它既可以增强机体的免疫力和造血功能，又可抑制多种霉菌及人类癌细胞的生长和转移等。早在一千多年前，我国就有食用海参的习惯，并将海参视为一种珍贵的滋补品，列为“海八珍”之首。《本草从新》中记载海参具有“甘、咸、温、补肾益精、壮阳疗痿”的功效，清朝《本草纲目拾遗》中记载“海参性温补，足敌人参故名海参； 味甘咸、补肾经、益精髓、消痰延、摄小便、壮阳疗痿、杀疮虫”。

目前，海参的主要食用部位为海参体壁,因此对海参的研究也多聚焦在海参体壁活性物质上。海参加工中的副产物海参内脏则多被废弃,利用率低,国内外对其研究也较少,已开发的相关产品更是微乎其微。然而海参内脏除含有与体壁相似的化学成分外,还富含牛磺酸、精氨酸、磷脂、不饱和脂肪酸以及各种高活性微量元素、色素、活性酶和功能菌,海参内脏的食用价值和药用价值在一定范围内高于海参体壁。目前对海参内脏活性物质认识的缺乏和忽视,已造成资源严重浪费和流失。

现有技术中，海参内脏活性多肽的制备工艺主要集中于复合酶解法或复合发酵法，如专利CN201811098258.4公开了一种海参内脏多肽的制备方法，步骤包括：将海参内脏冷冻品依次进行解冻、酶解、离心、浓缩、干燥步骤，所述酶解步骤中使用复合酶，所述复合酶为脂肪酶与蛋白酶组合。所述复合酶为胶原蛋白酶、木瓜蛋白酶和脂肪酶的组合；专利CN201810512423.X公开了一种利用海参内脏制作的调味品及其制备方法，按重量份，包括干净的海参内脏20-30份，大豆粉20-40份，盐10-15份，复合发酵菌种1-2份；将通常丢弃的海参内脏充分利用，将原料经过匀浆、杀菌、发酵等过程，能够在微生物的作用下使大的蛋白质分子分解为水溶小肽、多糖、皂苷等风味物质。但关于如何提高海参内脏活性多肽的抗氧化性及营养功效的研究相对较少，尤其是对于提高海参内脏多肽补肾壮阳功效是本领域的关键技术弊端。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，满足海参加工废弃物高效提取及高值化利用，本申请提供一种提高海参补肾壮阳功效的方法，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，研制开发出显著补肾壮阳功效的海参多肽生物制品，满足保健、医疗、食品等领域对海参多肽的应用需求，该工艺技术发酵工艺简单高效、所得产品具有显著的补肾壮阳保健功效，生产成本低，易于工业化规模生产。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种提高海参补肾壮阳功效的方法，其特征在于制备方法包括如下步骤：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以3000r/min速率离心分离，上清液即为海参多肽提取液。

优选的，在海参内脏匀浆过程中加入海参内脏质量比5%的褐藻寡糖。

进一步优选的，所述褐藻寡糖的分子量为3000-5000Da。

上述步骤（4）中所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1。

上述步骤（5）中所述复合微生物菌剂为富硒酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1。

上述步骤（5）中好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.2～0.3m³/m³.min。

上述富硒酿酒酵母种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种酿酒酵母活化培养基，培养基葡萄糖浓度5%、酵母膏浓度1%；在28～32℃条件下培养24h，在培养6h、12h、18h时分别向培养基中添加10g/L的***钠，制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

上述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

本发明提供一种提高海参补肾壮阳功效的方法，所得海参多肽具有较强的补肾壮阳功效，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。

本发明提供一种提高海参补肾壮阳功效的方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：

（1）本申请以海参内脏蛋白为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，显著提升了海参内脏蛋白抗氧化能力；尤为重要的是，本申请创造性的发现，在海参内脏溶解液中加入一定比例的褐藻寡糖可以显著提高酶解发酵法制备的海参多肽的补肾壮阳功效；

（2）本申请利用好氧菌（富硒酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）共同发酵海参内脏蛋白提取海参多肽，充分利用微生物间的协同作用，提升海参多肽的提取率和补肾壮阳保健功效，其中：富硒酿酒酵母在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的多肽等功能活性物质从细胞壁中释放出来，且酵母是产生能够释放结合态酚酸的酶类，有利于提升海参多肽的补肾壮阳功效；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产淀粉酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用，从而提高活性肽的抗氧化能力和营养保健功效；地衣芽孢杆菌的加入则可以显著提升海参多肽的稳定性和补肾壮阳保健功效；

（3），本发明采用两岐双歧杆菌进行厌氧发酵，提升了海参多肽的稳定性，试验结果表明，在20～80℃范围内，温度和时间对海参内脏水解肽抗氧化性影响不大，当温度超过100℃时抗氧化性随着温度和时间的增加开始降低，稳定性高于目前报道的技术水平；

（4）采用液体发酵，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率发酵工艺条件温和，生产成本低，且易于规模化生产，对提升行业经济效益及规模化推广应用具有重要作用。

具体实施方式

在本申请中，富硒酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活化方法如下：

（1）富硒酿酒酵母种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种酿酒酵母活化培养基，培养基葡萄糖浓度5%、酵母膏浓度1%；在28～32℃条件下培养24h，在培养6h、12h、18h时分别向培养基中添加10g/L的***钠，制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL；

（2）上述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL。

实施例1

一种提高海参补肾壮阳功效的方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为富硒酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1；好氧发酵过程中通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以3000r/min速率离心分离，上清液即为海参多肽提取液。

实施例2

一种提高海参补肾壮阳功效的方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；加入海参内脏质量比5%的褐藻寡糖，所述褐藻寡糖的分子量为3000Da；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为富硒酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1；好氧发酵过程中通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以3000r/min速率离心分离，上清液即为海参多肽提取液。

实施例3

一种提高海参补肾壮阳功效的方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；加入海参内脏质量比5%的褐藻寡糖，所述褐藻寡糖的分子量为5000Da；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为富硒酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1；好氧发酵过程中通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以3000r/min速率离心分离，上清液即为海参多肽提取液。

实施例4

一种提高海参补肾壮阳功效的方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1；好氧发酵过程中通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以3000r/min速率离心分离，上清液即为海参多肽提取液。

实施例5

一种提高海参补肾壮阳功效的方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；加入海参内脏质量比5%的褐藻寡糖，所述褐藻寡糖的分子量为3000Da；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂硒酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1；好氧发酵过程中通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以3000r/min速率离心分离，上清液即为海参多肽提取液。

实施例6

一种提高海参补肾壮阳功效的方法，具体工艺步骤包括：

（1）清洗：将加工的新鲜海参内脏用自来水清洗干净，再用天然矿泉水或纯化水洗净沥干待用；

（2）匀浆：将步骤(1)所得海参内脏加入高速匀浆机，加入天然矿泉水或纯化水，进行高速匀浆，直至全部能够通过2mm孔径圆筛；加入海参内脏质量比5%的褐藻寡糖，所述褐藻寡糖的分子量为6000Da；

（3）灭菌：将匀浆后的海参内脏通过高压蒸锅灭菌，冷却后待用；

（4）复合酶解：向灭菌后的浆液中加入质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃条件下搅拌酶解30min；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合，其质量比为2:2:1；

（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵8h；所述复合微生物菌剂为富硒酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为2:3：1；好氧发酵过程中通风量为0.2～0.3m³/m³.min；

（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的两岐双歧杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；

（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；

（8）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；

（9）离心：以3000r/min速率离心分离，上清液即为海参多肽提取液。

实施例7

试验动物：雄性ICR小鼠，体质量（20±2）g；

分组与给药：110只ICR雄性小鼠，在实验条件下适应5天后，分为7个试验组，每组10只。其中实施例1-6试验组给予本发明海参多肽提取液，空白对照组ig小鼠灌胃等体积生理盐水，灌胃剂量均为2g.Kg^-1。30天后测定各项指标；

负重游泳实验：参照《保健食品检验与评价技术规范》要求对雄性小鼠进行负重游泳实验和常压耐缺氧实验。将小鼠末次灌胃给药30min后，在小鼠尾根部1/3～2/3处负荷体重的5%铅皮，在水深30cm水温（30±2）℃的水中游泳，同时准备多个60cm×40cm×50cm水槽，并用秒表记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，小鼠头部沉入水中7s不起为计时终止时间；

常压耐缺氧实验:参照《保健食品检验与评价技术规范》要求对雄性小鼠进行常压耐缺氧实验。将小鼠末次灌胃给药1h后，5g钠石灰用纱布包裹放入250mL的广口瓶中，将小鼠放入瓶中（每瓶1只），瓶口立即涂抹凡士林盖严，用秒表记录小鼠自放入瓶中开始至出现全身痉挛症状的时间，并迅速将小鼠取出；

血清NO和睾酮（T）值测定:将小鼠经常压耐缺氧实验后休息60min，摘眼球取血存于1.5mL离心管中，4000r/min离心5min后取上层血清，按照NO和睾酮试剂盒说明书操作处理样品并用酶标仪测定含量；

试验结果如下表所示：

试验结果表明本申请海参多肽生物制品具有显著的补肾壮阳功效，以实施例3为本发明最佳实施例。试验结果还表明添加褐藻寡糖可以显著提升生物制品的补肾壮阳保健功效，但当酿酒酵母替换富硒酿酒酵母时褐藻寡糖并不能够显著提升生物制品的补肾壮阳保健功效，说明了褐藻寡糖和富硒酿酒酵母间具有显著的协同增效作用。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。