阅读说明：本技术 一种艾曲波帕介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法 (Method for verifying anti-angiogenesis effect of eltrombopag-mediated macrophages ) 是由 杨喜燕 张建革 杨柳青 栾朋伟 崔乾飞 周静 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种艾曲波帕(Eltrombopag,ELB)介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法,通过MTT实验、q-PCR和ELISA检测ELB对巨噬细胞增殖、血管生成相关因子(VEGF-A、bFGF、MMP-9)mRNA的表达及VEGF蛋白的影响；再通过MTT实验、细胞划痕实验、Matrigel基质胶成管实验,观察ELB通过巨噬细胞对内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响。本发明证实了ELB能抑制巨噬细胞的增殖,抑制血管生成相关因子mRNA的表达及VEGF蛋白的释放,同时发现ELB作用于巨噬细胞的上清能显著抑制内皮细胞的增殖、迁移和小管形成,说明ELB可以介导巨噬细胞而具有抗血管生成作用。(The invention provides a verification method for the anti-angiogenesis effect of Eltrombopag (ELB) mediated macrophages, which detects the influence of ELB on macrophage proliferation, the expression of angiogenesis related factors (VEGF-A, bFGF and MMP-9) mRNA and VEGF protein through MTT experiment, q-PCR and ELISA; and then the influence of the ELB on the proliferation and migration of endothelial cells and the formation of a lumen through macrophages is observed through an MTT experiment, a cell scratch experiment and a Matrigel tube forming experiment. The invention proves that ELB can inhibit the proliferation of macrophages, inhibit the expression of mRNA (messenger ribonucleic acid) related to angiogenesis and release of VEGF (vascular endothelial growth factor) protein, and simultaneously finds that ELB acts on the supernatant of the macrophages and can obviously inhibit the proliferation, migration and tubule formation of endothelial cells, thereby indicating that the ELB can mediate the macrophages to have the effect of resisting angiogenesis.)

一种艾曲波帕介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法

技术领域

本发明涉及药品检测领域，具体涉及一种艾曲波帕介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法。

背景技术

乳腺癌是女性中常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升，且呈现出年轻化趋势，严重危害着女性的健康。目前，药物疗法(化疗)仍是乳腺癌的主要治疗方法，但化疗药物在治疗时会降低患者的血小板含量。因此，寻找一种既抑制乳腺癌生长又不影响血小板水平的药物至关重要。研究发现肿瘤的生长和转移依赖于新生血管为其提供氧气和营养物质，通过抑制肿瘤的血管生成是***的有效策略。同时在肿瘤微环境中，大量存在的巨噬细胞能释放多种促血管生成因子，进而促进肿瘤的血管生成，故可寻找通过巨噬细胞抑制血管生成的药物。

艾曲波帕(Eltrombopag，ELB)是一种促血小板生成素受体激动剂，用于慢性免疫性血小板减少症的药物。研究表明ELB对乳腺癌细胞具有细胞毒性，但目前关于ELB在抗血管生成治疗药物领域中的应用尚未见相关报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，从而提供一种ELB介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法，具体方案如下：

一种ELB介导巨噬细胞抗血管生成作用验证方法，包括以下步骤：

配制至少包括细胞培养液、细胞冻存液、ELB母液和MTT溶液在内的试剂；对巨噬细胞Raw264.7进行细胞培养，所述细胞培养包括细胞复苏、细胞传代、细胞冻存和细胞计数；

用MTT法检测不同浓度的ELB母液对所述巨噬细胞Raw264.7细胞增殖的影响，包括：

取对数生长期的巨噬细胞Raw264.7，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清；每皿加入3mL PBS反复吹打巨噬细胞Raw264.7，使其脱落成单细胞悬液，将细胞悬液移入15mL离心管中；1000rpm离心5min；

弃上清，加入适量完全培养液，混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数；调整细胞悬液密度，以每孔6000个细胞接种于96孔板中，每孔100μL，96孔板最外圈加一圈PBS；

将铺好细胞的96孔板放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养过夜至贴壁；弃上清，每孔加入200μL含不同浓度药物的细胞培养液，各组浓度均设置6个复孔；

放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育48h；48h后每孔加入20μL MTT溶液，继续孵育4h；弃去上清，每孔加入150μL DMSO，放于摇床上摇10min，使蓝紫色结晶完全溶解；用酶标仪在570nm波长处测吸光度值；

按以下公式计算细胞存活率，绘制不同浓度下的生存曲线，计算ELB作用于巨噬细胞Raw264.748h后的IC50值；细胞存活率(％)＝(实验组OD–空白组OD/对照组OD–空白组OD)×100％。

基于上述，q-PCR法检测巨噬细胞Raw264.7血管生成相关因子mRNA的表达，包括细胞给药实验、细胞中RNA的提取、RNA浓度的测定、RNA的逆转录和q-PCR扩增反应；所述细胞给药实验包括：

取对数生长期的巨噬细胞Raw264.7，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清；每皿加入3mL PBS反复吹打巨噬细胞，使其脱落成单细胞悬液；将细胞悬液移入15mL离心管中；1000rpm离心5min；

弃上清，加入适量PBS，混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数；调整细胞悬液密度，以每1.5×106个细胞接种于60mm的细胞培养皿中，每皿2mL；将培养皿置于细胞培养箱中培养3h使其贴壁；

3h后取出细胞培养皿，弃上清，每皿加入2mL含不同浓度药物的RPMI培养基，药物浓度分别为5μM、10μM，置于培养箱中孵育24h；

取出培养皿，弃上清，每皿加入500μLTrizol试剂，在冰上反复吹打细胞使其完全裂解，将裂解液转入1.5mL EP管中，编号，快速置于-80℃冰箱中保存过夜用于后续实验。

基于上述，分析ELB母液对所述巨噬细胞Raw264.7细胞VEGF蛋白释放的影响，包括：

取对数生长期的巨噬细胞Raw264.7，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清；每皿加入3mL PBS反复吹打细胞，使其脱落成单细胞悬液；将细胞悬液移入15mL离心管中，1000rpm离心5min；

弃上清，加入适量RPMI 1640混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸取60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数；调整细胞悬液密度，以每12×10⁶个细胞接种于100mm的细胞培养皿中，后用RPMI 1640补至6mL，将培养皿放入37℃、5％CO2培养箱中平衡12h；

12h后取出培养皿，弃上清，对照组每皿加入4mL RPMI 1640培养基，实验组每皿加入4mL含10μM ELB的RPMI 1640培养基，将其置于培养箱中培养24h；

24h后取出培养皿，收集上清置于15mL离心管中，1000rpm离心3min，吸取上清至5mL离心管中，写上标记；利用ELISA检测VEGF蛋白的含量。

基于上述，分析ELB母液通过所述巨噬细胞Raw264.7对内皮细胞增殖的影响，包括巨噬细胞上清液的制备和内皮细胞的增殖实验，所述巨噬细胞上清液的制备包括：

取对数生长期的巨噬细胞Raw264.7，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清；每皿加入3mL PBS反复吹打细胞，使其脱落成单细胞悬液；将细胞悬液移入15mL离心管中，1000rpm离心5min；

弃上清，加入适量RPMI 1640混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸取60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数；

调整细胞悬液密度，以每12×10⁶个细胞接种于100mm的细胞培养皿中，后用RPMI1640补至6mL，将培养皿放入37℃、5％CO2培养箱中平衡12h；

12h后取出培养皿，弃上清，对照组每皿加入4mL RPMI 1640培养基，实验组每皿加入4mL含10μM ELB的RPMI 1640培养基，将其置于培养箱中培养24h；

24h后取出培养皿，收集上清置于15mL离心管中，1000rpm离心3min，吸取上清至5mL离心管中，写上标记，对照组为条件培养基S-Control，实验组为含药条件培养基组S-ELB(10μM)，放于-20℃冰箱保存备用；

所述内皮细胞的增殖实验包括：

取对数生长期的HUVEC细胞，0.25％胰蛋白酶消化，重悬细胞计数，调整细胞悬液密度，以每孔5000个细胞接种于96孔板中，每孔100μL；将铺好细胞的96孔板放入37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜至贴壁；

弃上清，每孔加入200μL相应的培养液；实验分为四组，第一组为单纯条件培养基组S-Control；第二组为含药条件培养基组S-ELB；第三组为空白对照组Control；第四组为单纯加药组ELB；

放于培养箱中孵育24h、48h，各时间点取出，每孔加入20μL MTT溶液，继续孵育4h；弃去上清，每孔加入150μL DMSO，放于摇床上摇10min，使蓝紫色结晶完全溶解；用酶标仪在570nm波长处测吸光度值。

基于上述，确定ELB母液通过所述巨噬细胞Raw264.7对内皮细胞迁移的影响，包括巨噬细胞上清液的制备和内皮细胞的划痕实验，所述内皮细胞的划痕实验包括：实验前将所有实验用具灭菌，直尺和记号笔在操作前放超净台里紫外照射30min；

取6孔板，用直尺在背面平均每隔0.5～1cm画一条线，横穿过孔，每孔至少画5条线；

取对数生长期的HUVEC细胞，0.25％胰蛋白酶消化，重悬细胞计数，调整细胞悬液密度，以每孔8×105个细胞接种于6孔板中，每孔2mL，放于37℃、5％CO2的培养箱中孵育过夜；

次日取出6孔板，用10μL枪头垂直于背面的横线划线，弃上清，用PBS洗掉划下的细胞；

每孔加入2mL相应的培养液；实验分为四组：第一组为单纯条件培养基组S-Control；第二组为含药条件培养基组S-ELB；第三组为空白对照组Control；第四组为单纯加药组ELB；

置于培养箱中培养，在24h时取出，拍照；测量划痕的宽度，并计算迁移率。

基于上述，确定ELB母液通过所述小鼠单核巨噬细胞Raw264.7对内皮细胞小管形成的影响，包括巨噬细胞上清液的制备和内皮细胞的成管实验，所述内皮细胞的成管实验包括：

实验前一天将Matrigel基质胶置于4℃冰箱，使其过夜融化，同时将200μL枪头和96孔板放于-20℃预冷；

第二天待Matrigel基质胶融化后，离心数分钟；将基质胶加入提前预冷的96孔板中，每孔加60μL，然后置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育1h；

孵育的同时，取对数生长期的HUVEC细胞，0.25％胰蛋白酶消化，重悬细胞计数，用RPMI 1640培养基和条件培养基来调整细胞悬液密度；

待基质胶凝固后取出，以每孔2.5×10⁴个细胞接种于96孔板中，每孔200μL，每组3个副孔，然后置于培养箱中继续孵育，6h后可见血管形成，取出细胞培养板，观察并拍照，每孔随机拍3个视野；采用Image-J angiogenesis软件处理图片，GraphPad Prism 5.01作图。

本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体地说，本发明具有以下优点：

本发明首先通过MTT实验、q-PCR和ELISA检测ELB对巨噬细胞增殖、血管生成相关因子(VEGF-A、bFGF、MMP-9)mRNA的表达及VEGF蛋白的影响；再通过MTT实验、细胞划痕实验、Matrigel基质胶细胞成管实验，观察ELB通过巨噬细胞对内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响。

本发明通过在体外水平上，发现ELB能抑制巨噬细胞的增殖，抑制血管生成相关因子(VEGF-A、bFGF、MMP-9)mRNA的表达及VEGF蛋白的释放，同时发现ELB作用于巨噬细胞的上清能显著抑制内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，说明ELB可以通过作用于巨噬细胞进而抑制内皮细胞的功能。

附图说明

图1是本发明的流程图；

图2是MTT法检测ELB对Raw264.7细胞增殖的影响；

图3是ELB作用于Raw264.7细胞24h后对VEGF-A mRNA水平的定量分析示意图；

图4是ELB作用于Raw264.7细胞24h后对bFGF mRNA水平的定量分析示意图；

图5是ELB作用于Raw264.7细胞24h后对MMP-9mRNA水平的定量分析示意图；

图6是ELB抑制Raw264.7细胞VEGF蛋白的释放示意图；

图7是MTT法检测ELB作用巨噬细胞的上清作用于内皮细胞24h后的细胞增殖示意图；

图8是MTT法检测ELB作用巨噬细胞的上清作用于内皮细胞48h后的细胞增殖示意图；

图9是MTT法检测ELB直接作用于内皮细胞24h后的细胞增殖示意图；

图10是MTT法检测ELB直接作用于内皮细胞48h后的细胞增殖示意图；

图11是ELB药物作用0h和24h后划痕的示意图；

图12是ELB作用巨噬细胞的上清作用于内皮细胞24h后的相对迁移率示意图；

图13是ELB直接作用于内皮细胞24h后的相对迁移率示意图；

图14是ELB作用巨噬细胞的上清抑制内皮细胞6h的小管形成图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

ELB通过巨噬细胞介导的体外抗血管生成作用研究，巨噬细胞是肿瘤微环境中首要的炎症细胞，能够分泌多种血管生长因子，如VEGF-A、bFGF、MMPs、TGF-α和IL-1β，促进肿瘤的血管生成。ELB能够显著抑制乳腺癌细胞4T1的生长及血管生成相关因子的表达，因此进一步探讨ELB对巨噬细胞血管生成相关因子表达的影响，及通过巨噬细胞介导对下游血管内皮细胞功能的影响。先通过MTT实验、q-PCR法和ELISA检测ELB对巨噬细胞增殖、血管生成相关因子表达及VEGF蛋白的影响；再通过采用ELB处理的巨噬细胞上清作用于血管内皮细胞，对内皮细胞增殖、迁移及小管形成功能的影响进行检测，探究ELB对巨噬细胞介导的血管生成功能的影响。如图1所示是本发明的流程图。

实施例1：MTT法检测ELB对Raw264.7细胞增殖的影响

取对数生长期的Raw264.7细胞，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清。每皿加入3mL PBS反复吹打细胞，使其脱落成单细胞悬液。将细胞悬液移入15mL离心管中，1000rpm离心5min。

弃上清，加入适量完全培养液，混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数。调整细胞悬液密度，以每孔6000个细胞接种于96孔板中，每孔100μL，96孔板最外圈加一圈PBS。将铺好细胞的96孔板放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养过夜至贴壁。(空白对照组不铺细胞)

弃上清，每孔加入200μL含不同浓度药物(1μM、2μM、4μM、16μM、32μM、64μM、128μM)的细胞培养液，各组浓度均设置6个复孔。(阴性对照组和空白对照组加入不含药的完全培养液)。放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育48h。48h后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4h。轻轻弃去上清，每孔加入150μL DMSO，放于摇床上摇10min，使蓝紫色结晶完全溶解。

用酶标仪在570nm波长处测吸光度值，按以下公式计算细胞存活率，绘制不同浓度下的生存曲线，计算ELB作用于Raw264.7细胞48h后的IC50值，细胞存活率(％)＝(实验组OD–空白组OD/对照组OD–空白组OD)×100％。

实验结果：将不同浓度的ELB(1μM、2μM、4μM、16μM、32μM、64μM、128μM)作用于Raw264.7细胞48h后，MTT法检测其对Raw264.7细胞增殖的影响。结果如图2所示，ELB以剂量依赖性的方式抑制炎症细胞Raw264.7的增殖，且IC₅₀为22.42μM。结果表明ELB能抑制炎症细胞Raw264.7的增殖。为了避免药物作用后细胞大量死亡，选用5μM、10μM浓度的ELB进行后续细胞实验。

实施例2：q-PCR法检测Raw264.7细胞血管生成相关因子mRNA的表达

取对数生长期的Raw264.7细胞，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清。每皿加入3mL PBS反复吹打细胞，使其脱落成单细胞悬液。将细胞悬液移入15mL离心管中。1000rpm离心5min。

弃上清，加入适量PBS，混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数。调整细胞悬液密度，以每1.5×10⁶个细胞接种于60mm的细胞培养皿中，每皿2mL。将培养皿置于细胞培养箱中培养3h使其贴壁。

3h后取出细胞培养皿，弃上清，每皿加入2mL含不同浓度药物的RPMI培养基，药物终浓度为5μM、10μM，置于培养箱中孵育24h。取出培养皿，弃上清，每皿加入500μLTrizol试剂，在冰上反复吹打细胞使其完全裂解，将裂解液转入1.5mL EP管中，编号，快速置于-80℃冰箱中保存过夜用于后续实验。然后进行细胞中RNA的提取、RNA浓度的测定、RNA的逆转录(cDNA的合成)和q-PCR扩增反应。

实验结果：结果如图3至图5所示，与Control组相比较，10μM的ELB均能显著抑制Raw264.7细胞内VEGF-A、bFGF、MMP-9mRNA的表达。所以选用10μM浓度的ELB进行后续实验。

实施例3：ELISA检测巨噬细胞VEGF蛋白的释放

取对数生长期的Raw264.7细胞，弃去旧的培养基，3mL PBS洗一遍，弃上清。每皿加入3mL PBS反复吹打细胞，使其脱落成单细胞悬液。将细胞悬液移入15mL离心管中。1000rpm离心5min。

弃上清，加入适量RPMI 1640混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸取60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数。调整细胞悬液密度，以每12×106个细胞接种于100mm的细胞培养皿中，后用RPMI 1640补至6mL，将培养皿放入37℃、5％CO2培养箱中平衡12h。

12h后取出培养皿，弃上清，对照组每皿加入4mL RPMI 1640培养基，实验组每皿加入4mL含10μM ELB的RPMI 1640培养基，将其置于培养箱中培养24h。24h后取出培养皿，收集上清置于15mL离心管中，1000rpm离心3min，吸取上清至5mL离心管中，写上标记。根据ELISA说明书的步骤进行检测VEGF蛋白的含量。

实验结果：结果如图6所示，与Control组相比，ELB(10μM)组能显著抑制VEGF蛋白的含量，说明ELB能抑制VEGF蛋白的释放。

实施例4：ELB作用巨噬细胞的上清对内皮细胞增殖的影响

巨噬细胞上清液的制备，取对数生长期的Raw264.7细胞，弃去旧的培养基，3mLPBS洗一遍，弃上清。每皿加入3mL PBS反复吹打细胞，使其脱落成单细胞悬液。将细胞悬液移入15mL离心管中，1000rpm离心5min。

弃上清，加入适量RPMI 1640混匀，取少量细胞悬液进行稀释，吸取60μL稀释后的液体加入细胞计数板中进行细胞计数。调整细胞悬液密度，以每12×106个细胞接种于100mm的细胞培养皿中，后用RPMI 1640补至6mL，将培养皿放入37℃、5％CO2培养箱中平衡12h。

12h后取出培养皿，弃上清，对照组每皿加入4mL RPMI 1640培养基，实验组每皿加入4mL含10μM ELB的RPMI 1640培养基，将其置于培养箱中培养24h。24h后取出培养皿，收集上清置于15mL离心管中，1000rpm离心3min，吸取上清至5mL离心管中，写上标记，对照组为条件培养基S-Control，实验组为含药条件培养基组S-ELB(10μM)，放于-20℃冰箱保存备用。

内皮细胞的增殖实验，取对数生长期的HUVEC细胞，0.25％胰蛋白酶消化，重悬细胞计数，调整细胞悬液密度，以每孔5000个细胞接种于96孔板中，每孔100μL。将铺好细胞的96孔板放入37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜至贴壁。

弃上清，每孔加入200μL相应的培养液。实验分为四组，一组为单纯条件培养基组S-Control；一组为含药条件培养基组S-ELB(10μM)；一组为空白对照组Control；一组为单纯加药组ELB(10μM)。(药物的配置：单纯条件培养基组为S-Control与RPMI 1640完全培养液等体积混合；含药条件培养基组为S-ELB(10μM)与RPMI 1640完全培养液等体积混合；空白对照组为含DMSO的RPMI 1640培养基与RPMI 1640完全培养液等体积混合；单纯加药组为含10μM ELB的RPMI 1640培养基与RPMI 1640完全培养液等体积混合)。

放于培养箱中孵育24h、48h，各时间点取出，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4h，轻轻弃去上清，每孔加入150μL DMSO，放于摇床上摇10min，使蓝紫色结晶完全溶解。用酶标仪在570nm波长处测吸光度值。

实验结果：本发明通过MTT法检测不同给药组作用于内皮细胞24h和48h后的细胞增殖。实验结果如图7和图8所示，与S-Control组相比，S-ELB(10μM)组能显著抑制内皮细胞的增殖，但ELB直接作用对内皮细胞的增殖无影响，如图9和10所示。以上结果表明ELB作用于巨噬细胞的上清后能抑制内皮细胞的增殖。

实施例5：ELB作用巨噬细胞的上清对内皮细胞迁移的影响

巨噬细胞上清液的制备；内皮细胞的划痕实验，实验前将所有实验用具灭菌，直尺和记号笔在操作前放超净台里紫外照射30min，取6孔板，用直尺比着在背面平均每隔0.5～1cm画一条线，横穿过孔，每孔至少画5条线。

取对数生长期的HUVEC细胞，0.25％胰蛋白酶消化，重悬细胞计数，调整细胞悬液密度，以每孔8×105个细胞接种于6孔板中，每孔2mL，放于37℃、5％CO2的培养箱中孵育过夜(保证过夜能铺满整个底)。次日，取出6孔板，用10μL枪头比着直尺，垂直于背面的横线划线，枪头要垂直，不能倾斜。弃上清，用PBS洗掉划下的细胞。

每孔加入2mL相应的培养液。实验分为四组：一组为单纯条件培养基组S-Control；一组为含药条件培养基组S-ELB(10μM)；一组为空白对照组Control；一组为单纯加药组ELB(10μM)。(药物的配置：单纯条件培养基组为S-Control；含药条件培养基组为S-ELB(10μM)；空白对照组为含DMSO的RPMI 1640培养基；单纯加药组为含10μM ELB的RPMI 1640培养基)置于培养箱中培养。在0h，24h时取出，拍照。测量划痕的宽度，并计算迁移率。

实验结果：本发明通过划痕实验测定不同给药组作用于内皮细胞24h后的迁移情况，在药物作用前(0h)和作用24h时进行拍照，如图11所示。并计算内皮细胞的相对迁移率，相对迁移率＝(0h划痕宽度-24h划痕宽度)/0h划痕宽度100％。结果如图12所示，与S-Control组相比，S-ELB(10μM)组能显著抑制内皮细胞的迁移，但ELB直接作用对内皮细胞的迁移无影响，如图13所示。以上结果表明ELB作用于巨噬细胞的上清后能抑制内皮细胞的迁移。

实施例6：ELB作用巨噬细胞的上清对内皮细胞小管形成的影响，巨噬细胞上清液的制备，然后内皮细胞的成管实验，实验前一天将Matrigel基质胶置于4℃冰箱，使其过夜缓慢融化，同时将200μL枪头和96孔板放于-20℃预冷，第二天待Matrigel基质胶融化后，离心数分钟。将基质胶加入提前预冷的96孔板中，每孔加60μL，然后置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育1h。孵育的同时，取对数生长期的HUVEC细胞，0.25％胰蛋白酶消化，重悬细胞计数，用RPMI 1640培养基和条件培养基来调整细胞悬液密度。待基质胶凝固后取出，以每孔2.5×10⁴个细胞接种于96孔板中，每孔200μL，每组3个副孔。然后置于培养箱中继续孵育，6h后可见血管形成。取出细胞培养板，观察并拍照，每孔随机拍3个视野。采用Image-Jangiogenesis软件处理图片，GraphPad Prism 5.01作图，进行统计学分析

实验结果：本发明通过Matrigel基质胶细胞成管实验探讨ELB通过巨噬细胞介导对内皮细胞小管形成的影响。发现药物作用6h后，内皮细胞有明显的管腔形成，如图14所示。

血管生成是一个复杂的过程，包括内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成等，此过程受到机体的促血管生长因子和抑血管生长因子的调节。1971年Folkman教授提出实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的理论，为抗血管生成药物的研究提供了理论基础。

肿瘤微环境中存在大量巨噬细胞，同时巨噬细胞作为首要的炎症细胞，能分泌VEGF-A、bFGF、MMP-9等多种促血管生长因子，促进肿瘤的血管生成，因此本发明进一步探究了ELB对巨噬细胞的影响。结果表明ELB以剂量依赖的方式抑制巨噬细胞的增殖，并且能抑制巨噬细胞中血管生成相关因子(VEGF-A、bFGF、MMP-9)mRNA的表达及抑制VEGF蛋白的释放。为了进一步研究ELB能否通过介导巨噬细胞影响内皮细胞功能而起到抗血管生成作用。我们将ELB作用于巨噬细胞24h后的上清液作用于内皮细胞，通过MTT实验、细胞划痕实验、成管实验检测其对内皮细胞增殖、迁移、小管形成的影响。发现ELB作用于巨噬细胞的上清液能显著抑制内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，而ELB不能直接影响内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，说明ELB可以通过作用于巨噬细胞发挥抗血管生成作用。

本发明通过在体外水平上，发现ELB能抑制巨噬细胞的增殖，抑制血管生成相关因子(VEGF-A、bFGF、MMP-9)mRNA的表达及VEGF蛋白的释放，同时发现ELB作用于巨噬细胞的上清能显著抑制内皮细胞的增殖、迁移和小管形成。说明ELB可以通过作用于巨噬细胞进而抑制内皮细胞的功能。