阅读说明：本技术 Pedf来源的多肽复合物在制备治疗肺癌药物中的应用 (Application of polypeptide compound derived from PEDF (porcine epididymitis F) in preparation of drugs for treating lung cancer ) 是由 姜力群 董红燕 王云 秦西淳 刘志伟 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了PEDF来源的多肽复合物在制备治疗肺癌药物中的应用,本发明公开的PEDF源多肽混合物,其同PEDF以及单独多肽相比,对肺癌细胞的增殖抑制作用更强,对肺癌治疗具有协同增效作用,同时兼具心脏保护作用,在肺癌治疗中同市售血管内皮抑制素相比具有高效低毒的优势。(Compared with PEDF and single polypeptide, the PEDF source polypeptide mixture disclosed by the invention has a stronger proliferation inhibition effect on lung cancer cells, has a synergistic effect on lung cancer treatment, has a cardioprotective effect, and has the advantages of high efficiency and low toxicity compared with commercially available vascular endothelial inhibin in the lung cancer treatment.)

PEDF来源的多肽复合物在制备治疗肺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及PEDF来源的多肽复合物在制备治疗肺癌药物中的应用。

背景技术

肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。血管内皮抑制素可有效抑制肿瘤血管的生成，阻断肿瘤血液和营养供应，对肺癌具有较好的治疗效果。但是市售血管内皮抑制素具有窦性心动过速、轻度ST2T改变等心脏不良反应，为该药物的临床应用带来了一定风险。

PEDF(色素上皮源性因子)是一种内源性的非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂，然而，临床上应用PEDF作为药物仍然存在诸多困难，PEDF全长约418aa，其中含有的部分无效片段可能会形成空间位阻，减弱有效片段与受体的结合，同时较长的分子链也为PEDF制剂及储存中的稳定性带来较大挑战。因此，制备一种临床可用的PEDF源的多肽药物是有待解决的技术问题。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明提供PEDF来源的多肽复合物在制备治疗肺癌药物中的应用。

作为本发明所述的应用的一种优选方案：所述PEDF来源的多肽复合物，其序列来源于人或大鼠，所述多肽复合物由序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的多肽A和SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的多肽B组成。

作为本发明所述的应用的一种优选方案：所述多肽A和多肽B的摩尔比为(1：10)～(10：1)。

作为本发明所述的应用的一种优选方案：所述多肽A和多肽B的摩尔比为1：1。

作为本发明所述的应用的一种优选方案：所述多肽A，其浓度为5～320mM，所述多肽B，其浓度为5～320mM。

作为本发明所述的应用的一种优选方案：所述多肽A，其浓度为80mM，所述多肽B，其浓度为80mM。

作为本发明所述的应用的一种优选方案：所述肺癌，包括非小细胞肺癌以及鳞癌型肺癌。

作为本发明所述的应用的一种优选方案：所述PEDF来源的多肽复合物在抑制肺癌的同时还具有保护心脏的作用。

本发明的有益效果：本发明公开的PEDF源多肽混合物，其同PEDF以及单独多肽相比，对肺癌细胞的增殖抑制作用更强，对肺癌治疗具有协同增效作用，同时兼具心脏保护作用，在肺癌治疗中同市售血管内皮抑制素相比具有高效低毒的优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为为实施例1对A549细胞的增殖抑制效果(n＝6)。

图2为实施例1对A549细胞的Caspase-3的诱导表达作用。

图3为实施例1对A549细胞迁移的抑制作用。

图4为实施例1对SK-MES-1细胞的Caspase-3的诱导表达作用。

图5为实施例1对SK-MES-1细胞迁移的抑制作用。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：

PEDF源的多肽混合物注射液制备：

选取氨基酸序列VLLSPLSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT为多肽A，氨基酸序列DPFFKVPVNKLAAAVSNFGYDLYRVRSSMSPTTN为多肽B。称量多肽A和多肽B，溶于80mL注射用水中，加入0.9g氯化钠，定容至100mL，配成多肽A和多肽B混合物总浓度为160mM，多肽A与多肽B的摩尔比为1：1，过0.22μm微孔滤膜灭菌，即得多肽混合物注射液。

实施例2：

PEDF源的多肽混合物注射液对非小细胞肺癌的体外增殖抑制：

选取A549细胞为非小细胞肺癌体外模型。将A549细胞接种于96孔板中，1640培养基(含10％胎牛血清)培养至80％密度。采用含实施例1制备的多肽混合物注射液的培养基(含2％胎牛血清)替换原培养基，蛋白/多肽与细胞孵育24h后，以CCK-8试剂盒测定蛋白/多肽对A549细胞增殖的抑制率。多肽A和多肽B混合物总浓度为80mM，并采用PEDF整蛋白(80mM)、多肽A(80mM)、多肽B(80mM)和生理盐水(空白)为对照组。结果如图1所示，多肽A和多肽B的混合物组，A549细胞的存活率为56.0％，单独应用多肽A，A549细胞的存活率为77.4％，单独应用多肽B，A549细胞的存活率为67.1％，PEDF整蛋白组，A549细胞的存活率为63％。表明实施例1所制备的多肽A和多肽B的混合物注射液对A549细胞的抑制率显著高于PEDF或单独多肽。

本发明研究发现，采用本发明多肽A和多肽B的混合物对A549细胞的抑制率不仅高于单独应用多肽A或多肽B，还显著高于PEDF整蛋白对A549细胞的抑制率，这可能是由于PEDF全蛋白中含有某些片段，其可抑制多肽A/多肽B起效，或者PEDF全蛋白的空间构象不利于多肽A/多肽B与相应受体结合。

实施例3：

PEDF源的多肽混合物注射液对非小细胞肺癌的促凋亡作用：

选取A549细胞为非小细胞肺癌体外模型。将A549细胞接种于6孔板中，1640培养基(含10％胎牛血清)培养至80％密度。采用含实施例1制备的多肽混合物注射液的培养基(含2％胎牛血清)替换原培养基，蛋白/多肽与细胞孵育24h后，提取细胞蛋白，蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测蛋白中Caspase-3含量。多肽混合物总浓度为80mM。采用PEDF(80mM)、多肽A(80mM)、多肽B(80mM)和生理盐水(空白)为对照组。结果如图2所示空白组、混合肽组、多肽A组、多肽B组和PEDF组的Caspase-3/β-Actin的相对灰度值分别为0.36、0.95、0.79、0.94和0.57，可见实施例1所制备的多肽混合物注射液可显著提高A549细胞中Caspase-3表达，且其作用显著高于PEDF或单独多肽，表明混合多肽对A549细胞的凋亡具有协同促进作用。

实施例4：

PEDF源的多肽混合物注射液对非小细胞肺癌迁移的抑制作用：

选取A549细胞为非小细胞肺癌体外模型。将A549细胞接种于6孔板中，1640培养基(含10％胎牛血清)培养至80％密度。以10μL枪头于板底划线，显微镜观察细胞划痕。采用含实施例1制备的多肽混合物注射液的培养基(含2％胎牛血清)替换原培养基，蛋白/多肽与细胞孵育24h后，观察细胞向划痕的迁移。采用PEDF(80mM)、多肽A(80mM)、多肽B(80mM)和生理盐水(空白)为对照组。结果如图3所示，24h后生理盐水(空白)组细胞迁移已将划痕完全修复，而其余组别尚可见明显划痕，混合肽组、多肽A组、多肽B组和PEDF组24h后的划痕间距与0h间距的比值分别为0.81、0.47、0.69和0.50，可见施例1制备的多肽混合物注射液组划痕宽于PEDF、多肽A和多肽B组，表明混合多肽对A549细胞的迁移抑制作用强于PEDF和单独多肽。

实施例5：

PEDF源的多肽混合物注射液对鳞癌细胞的促凋亡作用：

选取SK-MES-1细胞为鳞癌型肺癌体外模型。将SK-MES-1细胞接种于6孔板中，DMEM培养基(含10％胎牛血清)培养至80％密度。采用含实施例1制备的多肽混合物注射液的培养基(含2％胎牛血清)替换原培养基，蛋白/多肽与细胞孵育24h后，提取细胞蛋白，蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测蛋白中Caspase-3含量。多肽混合物总浓度为80mM。采用PEDF(80mM)、多肽A(80mM)、多肽B(80mM)和生理盐水(空白)为对照组。结果如图4所示，空白组、混合肽组、多肽A组、多肽B组和PEDF组的Caspase-3/β-Actin的相对灰度值分别为0.70、1.08、0.81、0.91和0.80，可见实施例1所制备的多肽混合物注射液组中Caspase-3的表达量高于PEDF、多肽A组和多肽B组，表明混合多肽对SK-MES-1细胞的凋亡具有协同诱导作用。

实施例6：

PEDF源的多肽混合物注射液对鳞癌型肺癌细胞迁移的抑制作用：

选取SK-MES-1细胞为鳞癌型肺癌体外模型。将SK-MES-1细胞接种于6孔板中，1640培养基(含10％胎牛血清)培养至80％密度。以10μL枪头于板底划线，显微镜观察细胞划痕。采用含实施例1制备的多肽混合物注射液的培养基(含2％胎牛血清)替换原培养基，蛋白/多肽与细胞孵育24h后，观察细胞向划痕的迁移。采用PEDF(80mM)、多肽A(80mM)、多肽B(80mM)和生理盐水(空白)为对照组。结果如图5所示，空白组、混合肽组、多肽A组、多肽B组和PEDF组24h后的划痕间距与0h间距的比值分别为0、0.47、0.34、0.43和0.35，可见混合多肽对SK-MES-1细胞的迁移抑制作用强于PEDF、多肽A组和多肽B，表明混合多肽对SK-MES-1细胞迁移的抑制具有协同增效作用。

以上实施例以大鼠多肽A、大鼠多肽B为例，人源多肽A及多肽B与大鼠多肽A和大鼠多肽B表现出一致的结论，混合多肽具有协同作用，混合多肽与PEDF以及应用单独多肽相比，对肺癌细胞的增殖抑制作用更强，对肺癌治疗具有协同增效作用。

人源多肽A氨基酸序列(SEQ ID NO：1)为：

VLLSPLSVATALSALSLGADERTESIIHRALYYDLISSPDIHGT或者

人源多肽A氨基酸序列(SEQ ID NO：5)：

VLLSPLSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT

人源多肽B氨基酸序列(SEQ ID NO：2)为：

DPFFKVPVNKLAAAVSNFGYDLYRVRSSMSPTTN。

人源PEDF全长氨基酸序列为：

MQALVLLLCIGALLGHSSCQNPASPPEEGSPDPDSTGALVEEEDPFFKVPVNKLAAAVSNFGYDLYRVRSSMSPTTNVLLSPLSVATALSALSLGADERTESIIHRALYYDLISSPDIHGTYKELLDTVTAPQKNLKSASRIVFEKKLRIKSSFVAPLEKSYGTRPRVLTGNPRLDLQEINNWVQAQMKGKLARSTKEIPDEISILLLGVAHFKGQWVTKFDSRKTSLEDFYLDEERTVRVPMMSDPKAVLRYGLDSDLSCKIAQLPLTGSMSIIFFLPLKVTQNLTLIEESLTSEFIHDIDRELKTVQAVLTVPKLKLSYEGEVTKSLQEMKLQSLFDSPDFSKITGKPIKLTQVEHRAGFEWNEDGAGTTPSPGLQPAHLTFPLDYHLNQPFIFVLRDTDTGALLFIGKILDPRGP或

MQALVLLLCIGALLGHSSCQNPASPPEEGSPDPDSTGALVEEEDPFFKVPVNKLAAAVSNFGYDLYRVRSSMSPTTNVLLSPLSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGTYKELLDTVTAPQKNLKSASRIVFEKKLRIKSSFVAPLEKSYGTRPRVLTGNPRLDLQEINNWVQAQMKGKLARSTKEIPDEISILLLGVAHFKGQWVTKFDSRKTSLEDFYLDEERTVRVPMMSDPKAVLRYGLDSDLSCKIAQLPLTGSMSIIFFLPLKVTQNLTLIEESLTSEFIHDIDRELKTVQAVLTVPKLKLSYEGEVTKSLQEMKLQSLFDSPDFSKITGKPIKLTQVEHRAGFEWNEDGAGTTPSPGLQPAHLTFPLDYHLNQPFIFVLRDTDTGALLFIGKILDPRGP

大鼠PEDF氨基酸序列：

MQTLVLLLWTGALLGHGSSQNVPDSSQDSPAPDSTGEPVVEEDDPFFKAPVNKLAAAVSNFGYDLYRLRSGAVSTGNILLSPLSVATALSALSLGAEQRTESVIHRALYYDLINNPDIHSTYKELLASVTAPEKNFKSASRIVFERKLRVKSSFVAPLEKSYGTRPRILTGNPRIDLQEINNWVQAQMKGKIARSTREMPSALSILLLGVAYFKGQWATKFDSRKTTLQDFHLDEDRTVRVPMMSDPKAILRYGLDSDLNCKIAQLPLTGSMSIIFFLPLTVTQNLTMIEESLTSEFVHDIDRELKTIQAVLTVPKLKLSYEGDVTNSLQDMKLQSLFESPDFSKITGKPVKLTQVEHRAAFEWNEEGAGTSSNPDLQPVRLTFPLDYHLNRPFIFVLRDTDTGALLFIGRILDPSST。

大鼠多肽A序列(SEQ ID NO：3)：

ILLSPLSVATALSALSLGAEQRTESVIHRALYYDLINNPDIHST。

大鼠多肽B序列(SEQ ID NO：4)：

DPFFKAPVNKLAAAVSNFGYDLYRLRSGAVSTGN。

为了描述本发明的方便，使用各种氨基酸残基的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员熟悉的，但是为了清楚在下面列出：

Asp＝D＝天冬氨酸；Ala＝A＝丙氨酸；Arg＝R＝精氨酸；

Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘氨酸；Glu＝E＝谷氨酸；

Gln＝Q＝谷氨酰胺；His＝H＝组氨酸；Ile＝I＝异亮氨酸；

Leu＝L＝亮氨酸；Lys＝K＝赖氨酸；Met＝M＝甲硫氨酸；

Phe＝F＝苯丙氨酸；Pro＝P＝脯氨酸；Ser＝S＝丝氨酸；

Thr＝T＝苏氨酸；Trp＝W＝色氨酸；Tyr＝Y＝酪氨酸；

Val＝V＝缬氨酸；Cys＝C＝半胱氨酸。

本发明公开的PEDF源多肽混合物，其同PEDF以及单独多肽相比，对肺癌细胞的增殖抑制作用更强，对肺癌治疗具有协同增效作用，同时兼具心脏保护作用，在肺癌治疗中同市售血管内皮抑制素相比具有高效低毒的优势。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> PEDF来源的多肽复合物在制备治疗肺癌药物中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Leu Leu Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser

1 5 10 15

Leu Gly Ala Asp Glu Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr

20 25 30

Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr

35 40

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Pro Phe Phe Lys Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser

1 5 10 15

Asn Phe Gly Tyr Asp Leu Tyr Arg Val Arg Ser Ser Met Ser Pro Thr

20 25 30

Thr Asn

<210> 3

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Leu Leu Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser

1 5 10 15

Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Val Ile His Arg Ala Leu Tyr

20 25 30

Tyr Asp Leu Ile Asn Asn Pro Asp Ile His Ser Thr

35 40

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Pro Phe Phe Lys Ala Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser

1 5 10 15

Asn Phe Gly Tyr Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Ser Gly Ala Val Ser Thr

20 25 30

Gly Asn

<210> 5

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Val Leu Leu Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser

1 5 10 15

Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr

20 25 30

Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr

35 40