马齿苋多糖提取物及制备方法及其应用
阅读说明：本技术 马齿苋多糖提取物及制备方法及其应用 (Purslane polysaccharide extract, preparation method and application thereof ) 是由 王振辉 牛超 张真真 黄梅 *** 杨兰萍 李胜楠 孔继川 周德军 冯思颉 刘志 于 2019-11-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及天然药物领域,具体来说是马齿苋多糖提取物的制备方法及其应用,包括预处理、脱脂、酶解及提纯的过程,本发明制备经由预处理、脱脂、酶解的操作得到了马齿苋多糖提取物粗品,然后本发明通过高压超临界二氧化碳萃取的方式对马齿苋多糖提取物粗品进行了提纯,得到了纯度较高的马齿苋多糖提取物,并将制备得到的马齿苋多糖提取物在抗氧化及抗衰老药物中得到应用。(The invention relates to the field of natural medicines, in particular to a preparation method and application of a purslane polysaccharide extract, and the preparation method comprises the processes of pretreatment, degreasing, enzymolysis and purification.)
技术领域
本发明涉及天然药物领域，具体来说是马齿苋多糖提取物及制备方法及其应用。
背景技术
马齿苋为药食两用马齿苋科植物，属一年生肉质草本植物，马齿苋含有多种化学成分，其中马齿苋多糖是马齿苋主要的成分之一，最高含量可达11％，因此马齿苋多糖是一种极具开发潜力和开发价值的天然功能食品，在预防多种疾病的发生及延缓并发症的发展方面有着广阔的应用前景。
但是现有技术中，从马齿苋天然原料中提取马齿苋多糖提取物，提取得到的马齿苋多糖提取物中含有大量的无机杂质，从而使得马齿苋多糖提取物的纯度较低，在药物中的应用受到了限制。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是马齿苋多糖提取物及制备方法及其应用，本发明制备经由预处理、脱脂、酶解的操作得到了马齿苋多糖提取物粗品，然后本发明通过高压超临界二氧化碳萃取的方式对马齿苋多糖提取物粗品进行了提纯，得到了纯度较高的马齿苋多糖提取物，并将制备得到的马齿苋多糖提取物在药物中得到应用。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
马齿苋多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)预处理：选取新鲜的马齿苋，除去残根及杂质后洗净，然后在沸水中将马齿苋烫30s-1min，晾干后粉碎，得到马齿苋粉末；
(2)脱脂：将步骤(1)制备得到的马齿苋粉末加入至无水***中，并在索式提取器中回流6-8h，取出残渣，水洗后低温干燥，得到脱脂马齿苋粉末；
(3)酶解：在步骤(2)制备得到脱脂肪马齿苋粉末中加入纤维素C1酶，进行第一酶解处理，然后过滤，再加入木瓜蛋白酶，进行第二酶解处理，过滤，将滤渣再次加入木瓜蛋白酶，进行第三酶解处理，过滤、合并滤液、离心分离，保留上清溶液、干燥，得到马齿苋多糖提取物粗品；
(4)提纯：将步骤(3)制备得到的马齿苋多糖提取物粗品进行高压超临界二氧化碳萃取，并在萃取器内充入气化的CO2和乙醇，萃取结束后将CO2与马齿苋多糖提取物及乙醇的混合液进行减压分离得到马齿苋多糖提取物和乙醇的混合液以及杂质，重复上述操作3-5次，并将每次得到的马齿苋多糖提取物和乙醇的混合液合并，真空干燥，得到马齿苋多糖提取物。
优选的，所述步骤(2)中的纤维素C1酶为内切葡萄糖酶，且所述***的体积与所述马齿苋的质量比为1mL：2-4g。
优选的，所述步骤(3)中马齿苋与纤维素C1酶及木瓜蛋白酶的质量比为100：0.1-0.3：0.2-0.3。
优选的，所述步骤(3)中第一酶解处理的方法为：调节pH为4-5，置于50-70℃的5倍体积的温水中浸泡1-2h；第一酶解处理的方法为：调节pH为6-7，置于45-55℃的5倍体积的温水中浸泡1-2h；第三酶解处理的方法为：调节pH为6-7，置于45-55℃的10倍体积的温水中浸泡12-24h。
优选的，所述步骤(3)的离心过程为：在12000-20000rpm/min下离心10-15min。
优选的，所述步骤(4)的超临界萃取的萃取釜内压力为15-25MPa，萃取温度为25-40℃，以15-25L/h的流速通入二氧化碳流量，二氧化碳充入的压力为6-15Mpa，萃取时间为2-3h，萃取结束后将二氧化碳流体依次进入一级分离器和二级分离器进行分离，二氧化碳的流量为10-20L/h，一级分离器内压力为8MPa-10MPa，温度为10-25℃，二级分离器内压力为6MPa-8MPa，温度为35-45℃，从一级分离器中排出杂质，从二级分离器中排出马齿苋多糖提取物。
本发明还保护了一种上述方法制备获得的马齿苋多糖提取物。
优选的，所述的马齿苋多糖提取物在制备抗衰老药物中的应用。
优选的，所述的马齿苋多糖提取物在制备抗氧化药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
1、本发明在预处理阶段先将新鲜的马齿苋进行去残根及杂质，然后在沸水中将马齿苋烫30s-1min，使得在沸水中将马齿苋的细胞壁进行破坏，使得叶表面的细胞发生老化，易于马齿苋多糖由细胞壁内析出，然后进行脱脂，将马齿苋中的脂肪在无水***的作用下脱除，避免马齿苋中的脂肪对下面的酶解操作造成影响，然后进行了酶解的过程，在酶解的过程中，先经由纤维素C1酶破坏纤维素链的结晶结构，然后使用木瓜蛋白酶进行酶解，使得马齿苋中的蛋白进行水解，产生大量的马齿苋多糖，然后再进行第三次酶解，使得酶解更加彻底，得到足量的马齿苋多糖，然后离心分离并保留上清溶液，得到了马齿苋多糖提取物粗品，本发明又通过高压超临界二氧化碳萃取的方式对马齿苋多糖提取物粗品进行了提纯，得到了纯度较高的马齿苋多糖提取物。
2、本发明制备得到的马齿苋多糖提取物纯度较高，马齿苋多糖提取物具有抗氧化性、抗肿瘤活性及抗衰老作用，因此本发明制备得到的纯度较高的马齿苋多糖提取物能够制备抗衰老药物中及抗氧化药物中得到广泛应用。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
马齿苋多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)预处理：选取500g新鲜的马齿苋，除去残根及杂质后洗净，然后在沸水中将马齿苋烫30s，晾干后粉碎，得到470g马齿苋粉末；
(2)脱脂：将步骤(1)制备得到的马齿苋粉末加入至235mL无水***中，并在索式提取器中回流8h，取出残渣，水洗后低温干燥，得到450g脱脂马齿苋粉末；
(3)酶解：在步骤(2)制备得到脱脂肪马齿苋粉末中加入内切葡萄糖酶，置于50℃的2250mL的温水中浸泡2h，调节pH为4，进行第一酶解处理，然后过滤，再加入木瓜蛋白酶，置于45℃的2250mL的温水中浸泡2h，调节pH为6，进行第二酶解处理，过滤，将滤渣再次加入木瓜蛋白酶，置于45℃的4500mL的温水中浸泡24h，调节pH为6，进行第三酶解处理，过滤、合并滤液、在12000rpm/min下离心15min，保留上清溶液、干燥，得到马齿苋多糖提取物粗品；
(4)提纯：将步骤(3)制备得到的马齿苋多糖提取物粗品进行高压超临界二氧化碳萃取，萃取器内充入气化的CO2和乙醇，调节超临界萃取的萃取釜内压力为15MPa，萃取温度为40℃，以15L/h的流速通入二氧化碳流量，二氧化碳充入的压力为6Mpa，萃取时间为3h，萃取结束后将二氧化碳流体依次进入一级分离器和二级分离器进行分离，二氧化碳的流量为10L/h，一级分离器内压力为10MPa，温度为10℃，二级分离器内压力为6MPa，温度为45℃，从一级分离器中排出杂质，从二级分离器中排出马齿苋多糖提取物，萃取结束后将CO2与马齿苋多糖提取物及乙醇的混合液进行减压分离得到马齿苋多糖提取物和乙醇的混合液以及杂质，重复上述操作3次，并将每次得到的马齿苋多糖提取物和乙醇的混合液合并，真空干燥，得到马齿苋多糖提取物。
实施例2
马齿苋多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)预处理：选取500g新鲜的马齿苋，除去残根及杂质后洗净，然后在沸水中将马齿苋烫30s，晾干后粉碎，得到470g马齿苋粉末；
(2)脱脂：将步骤(1)制备得到的马齿苋粉末加入至300mL无水***中，并在索式提取器中回流7h，取出残渣，水洗后低温干燥，得到450g脱脂马齿苋粉末；
(3)酶解：在步骤(2)制备得到脱脂肪马齿苋粉末中加入内切葡萄糖酶，置于60℃的2250mL的温水中浸泡1.5h，调节pH为4，进行第一酶解处理，然后过滤，再加入木瓜蛋白酶，置于50℃的2250mL的温水中浸泡1.5h，调节pH为6，进行第二酶解处理，过滤，将滤渣再次加入木瓜蛋白酶，置于50℃的4500mL的温水中浸泡18h，调节pH为6，进行第三酶解处理，过滤、合并滤液、在18000rpm/min下离心12min，保留上清溶液、干燥，得到马齿苋多糖提取物粗品；
(4)提纯：将步骤(3)制备得到的马齿苋多糖提取物粗品进行高压超临界二氧化碳萃取，萃取器内充入气化的CO2和乙醇，调节超临界萃取的萃取釜内压力为20MPa，萃取温度为30℃，以20L/h的流速通入二氧化碳流量，二氧化碳充入的压力为10Mpa，萃取时间为2.5h，萃取结束后将二氧化碳流体依次进入一级分离器和二级分离器进行分离，二氧化碳的流量为15L/h，一级分离器内压力为9MPa，温度为15℃，二级分离器内压力为7MPa，温度为40℃，从一级分离器中排出杂质，从二级分离器中排出马齿苋多糖提取物，萃取结束后将CO2与马齿苋多糖提取物及乙醇的混合液进行减压分离得到马齿苋多糖提取物和乙醇的混合液以及杂质，重复上述操作4次，并将每次得到的马齿苋多糖提取物和乙醇的混合液合并，真空干燥，得到马齿苋多糖提取物。
实施例3
马齿苋多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)预处理：选取500g新鲜的马齿苋，除去残根及杂质后洗净，然后在沸水中将马齿苋烫1min，晾干后粉碎，得到470g马齿苋粉末；
(2)脱脂：将步骤(1)制备得到的马齿苋粉末加入至470mL无水***中，并在索式提取器中回流6h，取出残渣，水洗后低温干燥，得到450g脱脂马齿苋粉末；
(3)酶解：在步骤(2)制备得到脱脂肪马齿苋粉末中加入内切葡萄糖酶，置于70℃的2250mL的温水中浸泡1h，调节pH为5，进行第一酶解处理，然后过滤，再加入木瓜蛋白酶，置于55℃的2250mL的温水中浸泡1h，调节pH为7，进行第二酶解处理，过滤，将滤渣再次加入木瓜蛋白酶，置于55℃的4500mL的温水中浸泡12h，调节pH为7，进行第三酶解处理，过滤、合并滤液、在20000rpm/min下离心10min，保留上清溶液、干燥，得到马齿苋多糖提取物粗品；
(4)提纯：将步骤(3)制备得到的马齿苋多糖提取物粗品进行高压超临界二氧化碳萃取，萃取器内充入气化的CO2和乙醇，调节超临界萃取的萃取釜内压力为25MPa，萃取温度为25℃，以25L/h的流速通入二氧化碳流量，二氧化碳充入的压力为8Mpa，萃取时间为2h，萃取结束后将二氧化碳流体依次进入一级分离器和二级分离器进行分离，二氧化碳的流量为20L/h，一级分离器内压力为8MPa，温度为25℃，二级分离器内压力为8MPa，温度为35℃，从一级分离器中排出杂质，从二级分离器中排出马齿苋多糖提取物，萃取结束后将CO2与马齿苋多糖提取物及乙醇的混合液进行减压分离得到马齿苋多糖提取物和乙醇的混合液以及杂质，重复上述操作5次，并将每次得到的马齿苋多糖提取物和乙醇的混合液合并，真空干燥，得到马齿苋多糖提取物。
本发明实施例1-实施例3均制备得到了纯度高的马齿苋多糖提取物，下面对马齿苋多糖提取物中多糖的重量进行测定，通过果蝇的平均寿命、最高寿命及半数死亡时间来研究马齿苋多糖提取物的抗衰老作用，通过吸光度检测DPPH自由基清除率来进行抗氧化作用的实验分析，且通过实施例2与对比例1进行抗氧化活性及抗衰老活性的对比，对比例1具体如下：
对比例1
与实施例2的制备过程相同，不同之处进在于，不含有步骤(4)的提纯过程。
下面对马齿苋多糖提取物中多糖的重量进行测定，通过果蝇的平均寿命、最高寿命及半数死亡时间来研究马齿苋多糖提取物的抗衰老作用，通过吸光度检测DPPH自由基清除率来进行抗氧化作用的实验分析：
1、样品中多糖的重量进行测定：
分别称取干燥后的实施例1-实施例3中的马齿苋多糖提取物粗品及马齿苋多糖提取物各50.0mg并定容至50g/L，精密吸取该溶液2mL于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，各取1mL置于10mL比色管中，分别加入5％苯酚溶液1mL，摇匀，匀速加入5mL浓硫酸，立即摇匀后冷却至室温，多糖浓度经吸光度在485nm下进行检测，多糖含量经紫外检测，然后得到马齿苋多糖提取物和马齿苋多糖提取物粗品的重量，具体如下：
多糖浓度C(mg/ml)＝(A485-0.0743)/12.025
待测多糖提取物中多糖重量＝多糖浓度C×稀释倍数
多糖占多糖提取物的百分比＝多糖重量/多糖提取物重量×100％
下面对实施例1-实施例3级对比例1的马齿苋多糖提取物的多糖含量进行计算，结果如下所示：
每100g马齿苋鲜品中所得多糖含量
2、下面进行马齿苋多糖提取物的抗氧化活性的测定：
将DPPH溶于乙醇中，配制成0.5mg/ml的DPPH溶液，备用；分别将实施例1-实施例3的马齿苋多糖提取物及对比例1的马齿苋多糖提取物粗品用乙醇溶解，并用乙醇将每一种产品均稀释至浓度为200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml及800μg/ml浓度梯度的样品溶液，备用；取105mL的不同浓度梯度的样品溶液与195mL的DPPH溶液混合均匀，并避光放置在30℃恒温水浴中30min，用紫外分光光度计测定其在517nm处的吸光度(A)，计算样品溶液对DPPH的清除率，见表2：
表2实施例1-实施例3的马齿苋多糖提取物及对比例1的马齿苋多糖提取物粗品对DPPH的清除率
通过表2的数据能够得出：实施例2及对比例1的样品均能够对DPPH的自由基进行清除，且清除率较高，说明实施例2及对比例1的样品均具有抗氧化性，而实施例2的提纯后的马齿苋多糖提取物样品的DPPH自由基清除率均高于相同浓度的对比例1的马齿苋多糖提取物粗品，说明在提纯后，提升了马齿苋多糖提取物的抗氧化性能。
3、下面进行马齿苋多糖提取物的抗衰老活性的测定：
采用果蝇寿命实验研究马齿苋多糖提取物的抗衰老效果，取120只果蝇，分为实验一组、实验二组、对照组和空白组，每组30只，且每组的雌雄各半，以实施例2的马齿苋多糖提取物为实验一组，以对比例1的马齿苋多糖提取物粗品为实验二组，以黄芪多糖为对照组，以清水为空白组，计算平均寿命(每组果蝇全部寿命的算术平均数)和最高寿命(每组最后死亡的10只果蝇的寿命的算术平均数)以及半数死亡时间(前半数果蝇寿命的算术平均数)为评价指标。
实验方法：
所有的果蝇均日补饲市售的果蝇培养基，并在实验一组的果蝇培养基中加入质量分数为1％的实施例2制备的马齿苋多糖提取物，在实验二组的果蝇培养基中加入质量分数为1％的对比例1制备的马齿苋多糖提取物粗品，在对照组的果蝇培养基中加入质量分数为1％的黄芪多糖提取物，在空白组的果蝇培养基中不添加任何物质，然后将果蝇的卵、幼虫、蛹及成虫均培养在25-30℃，60-70％相对湿度的暗箱中进行培育，并在成虫期把多糖提取液加入到基础饲料中，并保持各组pH一致。
果蝇的处理和衰老指标统计：
每天定时3次统计果蝇存活数、死亡数，直到全部死亡；每组最后死亡的10只果蝇成虫存活天数的平均数为该组的最高寿命；实验结束，计算平均寿命(每组果蝇全部寿命的算术平均数)和最高寿命(每组最后死亡的10只果蝇的寿命的算术平均数)以及半数死亡时间(前半数果蝇寿命的算术平均数)。
实验结果：
表3多糖对果蝇半数死亡时间结果对比
由表3可以看出，实验一组、实验二组及对照组的半数死亡时间均优于空白组，说明实验一组、实验二组及对照组均具有抗衰老的活性，且实验一组的半数死亡期的延长幅度与对照组的相近，说明实验一组的抗衰老活性与对照组的抗衰老活性相差不多，且实验一组的延长幅度明显优于实验二组的延长幅度，说明在对马齿苋多糖提取物粗品进行提纯后，得到的马齿苋多糖提取物具有更加优异的抗衰老活性。
表4多糖对果蝇平均寿命结果对比
由表4可以看出，实验一组、实验二组及对照组的平均寿命均优于空白组，说明实验一组、实验二组及对照组均具有抗衰老的活性，且实验一组的平均寿命的延长幅度与对照组的相近，说明实验一组的抗衰老活性与对照组的抗衰老活性相差不多，且实验一组的延长幅度明显优于实验二组的延长幅度，说明在对马齿苋多糖提取物粗品进行提纯后，得到的马齿苋多糖提取物具有更加优异的抗衰老活性。
表5多糖对果蝇最高寿命结果对比
由表5可以看出，实验一组、实验二组及对照组的最高寿命均优于空白组，说明实验一组、实验二组及对照组均具有抗衰老的活性，且实验一组的最高寿命的延长幅度与对照组的相近，说明实验一组的抗衰老活性与对照组的抗衰老活性相差不多，且实验一组的延长幅度明显优于实验二组的延长幅度，说明在对马齿苋多糖提取物粗品进行提纯后，得到的马齿苋多糖提取物具有更加优异的抗衰老活性。
表3-表5的结果表明，本发明制备的马齿苋多糖提取物对果蝇的寿命具有显著的延长作用，制备得到的马齿苋多糖提取物具有抗衰老的活性，且通过果蝇的动物实验证明，马齿苋多糖提取物不具有毒性，因此可用做抗衰老药物的活性成分。
综上所述，本发明制备得到的马齿苋多糖提取物不仅具有抗氧化活性，而且具有抗衰老活性，能够应用于药物中，且经过提纯后的马齿苋多糖提取物的抗氧化活性及抗衰老活性均优于马齿苋多糖提取物粗品。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。