阅读说明：本技术 一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法 (Method for extracting chondroitin sulfate/dermatan sulfate/hyaluronic acid from oviductus ranae ) 是由 魏峥 黄海月 林江慧 梁群焘 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法。所述方法先将蛤蟆油充分溶胀后加入的胰蛋白酶酶解蛤蟆油,再通过DEAE阴离子交换色谱柱提取蛤蟆油中的糖胺聚糖OR-GAG,然后经透析、冻干、浓缩后,用硫酸软骨素ABC酶特异性酶解OR-GAG,足量的酶可将长链酶解至硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸(CS/DS/HA)二糖单元。CS/DS/HA二糖单元经2-氨基吖啶酮荧光标记后,利用LC/MS-ITTOF进行结构分析,得到蛤蟆油中各二糖组分的结构与摩尔百分比。(The invention provides a method for extracting chondroitin sulfate, dermatan sulfate and hyaluronic acid from oviductus ranae. The method comprises the steps of firstly adding trypsin into fully swelled oviductus ranae to carry out enzymolysis on the oviductus ranae, then extracting glycosaminoglycan OR-GAG in the oviductus ranae through a DEAE anion exchange chromatographic column, then carrying out dialysis, freeze-drying and concentration, carrying out specific enzymolysis on the OR-GAG by using chondroitin sulfate ABC enzyme, wherein a sufficient amount of enzyme can carry out enzymolysis on a long chain to a chondroitin sulfate/dermatan sulfate/hyaluronic acid (CS/DS/HA) disaccharide unit. After the CS/DS/HA disaccharide unit is fluorescently labeled by 2-aminoacridone, the structure analysis is carried out by utilizing LC/MS-ITTOF to obtain the structure and the mole percentage of each disaccharide component in the oviductus ranae.)

一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的 方法

技术领域

本发明属于天然产物制备纯化领域，具体涉及一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法。

背景技术

蛤蟆油，又名雪蛤油、林蛙油、哈什蚂油，为雌蛙输卵管干制品。1g蛤蟆油中约有0.5 g粗蛋白、0.3 g无氮浸出物、0.1 g灰分、0.05 g脂肪以及0.02 g水分。蛤蟆油在《本草图经》和《本草纲目》中均有记载，且在明清时期，医学专家更是推崇蛤蟆油，并将其作为上等贡品敬献宫廷，其营养成分不亚于人参、燕窝等补品。蛤蟆油的传统功效有补肾益精、养阴润肺，主要用于肾虚精髓不足，眩晕耳鸣，病后或产后体虚气弱。现代医学又发现，其具有增强机体免疫力、提高抗氧化能力、降血脂、抗癌辅助作用等。其中，抗氧化、抗癌等功效可能与其含有硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸有关。

硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)以及透明质酸(HA)均属于糖胺聚糖(GAG),其中CS/DS是以乙酰氨基半乳糖(GalNAc)和己糖醛酸(GlcA/IdoA)为二糖单元构成的聚阴离子长链，而HA是由乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和葡萄糖醛酸(GlcA)为二糖单元形成的唯一一种无硫酸化修饰的糖胺聚糖。CS/DS的修饰位点主要有GlcA的2位氧硫酸化，GalNAc的4位氧硫酸化和6位氧硫酸化，不同程度以及不同位点的硫酸化修饰致使其生物功能也有所不同。CS/DS的生物功能主要有促进软骨再生、抗凝血、抗血栓形成、抗衰老以及提高机体免疫力等，HA由于其长链上有大量羟基，具有很强的亲水作用，所以一般用于延缓皮肤衰老、润泽皮肤等保湿型化妆品中。

由于国内外未见有关蛤蟆油中CS/DS/HA的提取与结构分析的相关报道， 本发明开创性的建立了一种提取蛤蟆油中CS/DS/HA的方法，并首次对蛤蟆油中的CS/DS/HA进行结构解析，为深入研究蛤蟆油中CS/DS/HA的结构及其功效提供了原创性的提取途径和结构分析手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法。该方法以蛤蟆油为原料，先用胰蛋白酶特异性酶解蛤蟆油蛋白，再利用阴离子交换色谱法将聚阴离子长链GAG分离出来，GAG中的NaCl通过透析进行除去、再冻干浓缩至无水状态，加入硫酸软骨素ABC酶特异性酶解CS/DS/HA长链至二糖单元，并通过分子排阻色谱法将得到的CS/DS/HA二糖单元进行纯化与分离。最后，CS/DS/HA二糖单元用荧光物质AMAC（2-氨基吖啶酮）进行标记，利用LC/MS-ITTOF对CS/DS/HA二糖单元进行结构分析，得到CS/DS/HA二糖的组分含量和摩尔百分比。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，包括以下步骤：

（1）胰蛋白酶酶解蛤蟆油：蛤蟆油经充分浸泡后用胰蛋白酶特异性酶解，酶解后离心取上清液。

（2）阴离子交换色谱法提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：利用DEAE纤维素树脂的阴离子交换作用，通过不同高盐浓度洗脱液置换出步骤（1）所得蛤蟆油上清液中的糖胺聚糖，洗脱液中的NaCl用透析除去，再冻干浓缩得到蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG。

（3）硫酸软骨素ABC酶酶解蛤蟆油糖胺聚糖获取二糖组分：取步骤(2)中的蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG，加入硫酸软骨素ABC酶，将蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG长链特异性酶解至CS/DS/HA二糖单元。

（4）分子排阻色谱法纯化二糖组分：利用液相分子排阻色谱柱peptide柱分离纯化CS/DS/HA二糖。

（5）LC/MS-ITTOF分析蛤蟆油中CS/DS/HA二糖的结构：酶解得到的CS/DS/HA二糖经AMAC（2-氨基吖啶酮）和NaBH₃CN荧光标记后，通过LC/MS-ITTOF分析得到二糖结构及其组分摩尔百分比。

一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

（1）胰蛋白酶酶解蛤蟆油：将蛤蟆油研磨成粉末状并在超纯水中充分浸泡，加入胰蛋白酶酶解蛤蟆油蛋白，酶解结束后离心取上清液。

（2）阴离子交换色谱法提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：水洗DEAE柱除去树脂中的乙醇，再加入平衡液使色谱柱达到稳定状态，加入步骤(1)所得上清液，再加入平衡液除去蛋白质杂质，然后用不同高盐浓度洗脱液将蛤蟆油糖胺聚糖(OR-GAG)洗脱出来，收集到的样品进行紫外检测，最后，利用透析除去糖胺聚糖中大量的盐并冻干。

（3）硫酸软骨素ABC酶酶解蛤蟆油糖胺聚糖获取二糖组分：取步骤(2)中的蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG1-100 ng，加入10 μL 30-50 mIU/μL硫酸软骨素ABC，进行酶解，将将蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG长链特异性酶解至CS/DS/HA二糖单元，再用沸水灭活，高速离心取上清液。

（4）分子排阻色谱法纯化二糖组分：取步骤(3)中的上清液，通过分子排阻色谱柱peptide柱对样品进行分离、纯化，从而获得纯净的蛤蟆油CS/DS/HA二糖组分。

（5）LC/MS-ITTOF分析蛤蟆油中CS/DS/HA二糖的结构：用AMAC（2-氨基吖啶酮）和氰基硼氢化钠对蛤蟆油中CS/DS/HA二糖进行荧光标记，标记后的CS/DS/HA二糖用LC/MS-ITTOF分析结构，并根据建立好的标准曲线，得到蛤蟆油中CS/DS/HA的组分含量及摩尔百分比。

上述步骤(1)的具体步骤为：将蛤蟆油在研钵中研磨至粉末状，取100-200 mg粉末状蛤蟆油于20 mL超纯水中常温浸泡24-48 h使其充分溶胀，制成蛤蟆油样品，然后加入100μL 10 μg/uL胰蛋白酶溶液进行酶解，反应条件为36-40℃，24-48 h；酶解结束后，10000rpm离心10-20 min取上清液。

上述步骤(2)的具体步骤为先取5-20 mL水洗过的DEAE树脂装柱，再用十至二十倍柱体积0.2 M NaCl，10-50 mM磷酸平衡缓冲液平衡DEAE柱，待柱稳定后上样，并加入平衡缓冲液除去蛋白杂质，随后利用分段洗脱的方法提取蛤蟆油中的糖胺聚糖，分段洗脱的高盐浓度洗脱液分别为0.5 M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液；1.0 M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液；1.5M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液；2.0 M NaCl，10-50 mM磷酸缓冲液；以3 mL/管收集各馏分，并进行紫外检测，波长为212 nm；DEAE收集到的馏分用1000-5000 Da的透析膜透析除去洗脱液中的NaCl，每两小时换一次去离子水，透析2-4天，最后，冻干2-4天除去水分，得到纯净的蛤蟆油糖胺聚糖(OR-GAG)。

上述步骤(3)的具体步骤为：取步骤（2）获得的蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG1-100 ng，加入10 μL 30-50 mIU/μL硫酸软骨素ABC进行酶解，将蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG酶解至CS/DS/HA二糖单元，酶解条件为36-40℃，酶解24-48 h，，酶解结束后，沸水灭活，10000 r离心10-20min取上清液。

上述步骤(4)的具体步骤为：取步骤3中的上清液，以≤200 μL的上样体积过分子排阻色谱柱peptide柱；CS/DS/HA二糖经peptide柱分离纯化，流动相为0.1-0.3 M NH₄HCO₃，流速0.4 mL/min，CS/DS/HA二糖在35-44 min出峰并进行收集。流动相中的NH₄HCO₃通过55-65℃挥发除去。

上述步骤(5)的具体步骤为：用5-10 μL AMAC（2-氨基吖啶酮）荧光标记纯化后的蛤蟆油CS/DS/HA二糖，以上样量<20 μL过反相色谱柱ODS柱，流动相A相为20-80 mM 醋酸铵，pH=5-7，流动相B相为100%甲醇，流速为0.3 mL/ min，CDL为100-200℃，Heat Block为100-200℃，N₂流速为1.5 mL/min，检测电压为1.6-1.8 kV。根据建立好的标准曲线，得到二糖组分含量和摩尔百分比。

本发明的优点在于：本发明以蛤蟆油为原料，通过胰蛋白酶酶解蛤蟆油蛋白，阴离子交换色谱法将聚阴离子长链GAG分离出来，再加入硫酸软骨素ABC酶特异性酶解CS/DS/HA长链至二糖单元，用分子排阻色谱法将得到的CS/DS/HA二糖单元进行纯化与分离，最后，CS/DS/HA二糖单元用荧光物质AMAC（2-氨基吖啶酮）进行标记，利用LC/MS-ITTOF对CS/DS/HA二糖单元进行结构分析，得到CS/DS/HA二糖的组分含量和摩尔百分比。本发明的方法为研究蛤蟆油的药用价值提供了化学成分基础，有助于开发蛤蟆油新的保健和药用功能。

附图说明：

图1 DEAE柱分段洗脱所得组分的紫外检测图：C1所对应的的洗脱液浓度为0.5M NaCl，C2所对应的的洗脱液浓度为1.0M NaCl，C3所对应的的洗脱液浓度为1.5M NaCl，C4所对应的的洗脱液浓度为2.0M NaCl。

图2 Peptide柱-HPLC法分离与纯化CS/DS/HA二糖组分图。其中的短横线代表二糖组分的收集时间范围。

图3 CS/DS标准二糖结构。

图4 HA标准二糖结构。

图5 ODS-MS法建立CS/DS/HA二糖标准曲线。

图6蛤蟆油中CS/DS/HA二糖的EIC图：A为8个标准二糖各40 ng的EIC图，B为C1中所含二糖的EIC图，C为C2中所含二糖的EIC图，D为C3中所含二糖的EIC图，E为C4中所含二糖的EIC图。1为2S4S6S，2为2S4S，3为2S6S，4为4S6S，5为2S，6为4S，7为6S，8为0S。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法：

1.胰蛋白酶(Tripsin)酶解蛤蟆油

取0.1 g粉末状蛤蟆油于20 mL超纯水中常温浸泡24 h，充分溶胀后，加入100 μL 10 μg/uL胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶缓冲为0.2 M NaCl,10 mM NaH2PO4/Na2HPO4，pH=7.5）反应条件为37℃，48 h。酶解结束后，10000 rpm高速离心10 min取上清液。

阴离子交换色谱法提取蛤蟆油中糖胺聚糖

取10 mL水洗过的DEAE树脂装柱，再用10倍柱体积的平衡液将柱子平衡至稳定状态。取步骤1中的上清液上样，用平衡液除去蛋白质等电荷密度低的杂质，再用不同高盐浓度洗脱液提取糖胺聚糖，最后将收集到的样品进行紫外检测，波长为212 nm。紫外检测图见图1。

DEAE提取糖胺聚糖的具体参数如下：

DEAE柱柱体积：10 mL

上样量: 10 mL

收集：3 mL/管

平衡液：0.2 M NaCl,10 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH=7.5)

洗脱液：0.5 M NaCl,10 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH=7.5)，收集样品C₁；

1.0 M NaCl,10 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH=7.5)，收集样品C₂；

1.5 M NaCl,10 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH=7.5)，收集样品C₃；

2.0 M NaCl,10 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH=7.5)，收集样品C₄。

柱温：室温

检测器：UV检测器

检测波长：212 nm

3.分子排阻色谱法CS/DS/HA二糖的制备与分离

将C₁、C₂、C₃以及C₄四种样品先用3000 Da的透析膜透析三天，将样品中NaCl完全除去，再利用冻干与浓缩除去水分。分别取浓缩干的C₁、C₂、C₃以及C₄50 ng、25 ng、3 ng、1.5 ng分别用硫酸软骨素酶特异性酶解，酶的体积均为10 μL，酶的浓度均为30 mIU/μL，酶缓冲液液为0.1 M NaAc，0.1 mM Ca(Ac)₂，pH=7.0（醋酸调pH），反应条件为37℃，24 h。待反应结束后，用100℃沸水灭活并于常温下静置一段时间后，10000 rpm 离心10 min取上清液，上清液以≤200 μL过分子排阻色谱柱peptide柱分离得到CS/DS/HA二糖。

Peptide-HPLC方法具体参数如下：

色谱柱：Superdex™ Peptide 10/300 GL(10 × 300–310 mm)

流速：0.4 mL/min

上样量：200 μL

流动相：0.2 M NH₄HCO₃

柱温：室温

检测器：UV检测器

检测波长：232 nm

收集时间：35-44 min；

通过上述方法分离CS/DS/HA二糖，得到的液相图见图2。

实施例 2

1.ODS-MS法建立CS/DS/HA二糖标准曲线

取浓度为1 μg/10 μl的8种CS/DS标准二糖各1.3 μg混合均匀并浓缩至无水状态，加入5 μL 0.1 M 2-氨基吖啶酮AMAC （AMAC溶于DMSO:CH₃COOH=17:3的溶液中）常温避光涡旋20min，再加入5 μL 1.0 M NaBH₃CN（NaBH₃CN溶于超纯水中）水浴45℃反应4 h。反应结束后，用50% DMSO将溶液稀释为80ng/10μL、60ng/10μL、40ng/10μL、20ng/10μL和5ng/10μL，分别进行质谱分析。CS/DS结构见图3，其m/z值见表一，CS/DS标准曲线图见图4。

取10 μg HA二糖浓缩干，加入5 μL 0.1 M AMAC进行荧光标记，反应过程中需用锡箔纸包裹并涡旋20 min，再加入5 μL 1.0 M NaBH₃CN发生还原胺化反应，反应条件为45℃，4 h。反应结束后，用50% DMSO将溶液稀释为90ng/10μL、70ng/10μL、50ng/10μL、30ng/10μL和10ng/10μL，进行质谱检测。以二糖质量为横坐标，以峰面积/100000为纵坐标，得到HA二糖的标准曲线为y=2.1052x - 6.1058，R² = 0.9946。HA结构见图4，其m/z值见表一。

ODS-MS方法具体参数如下：

色谱柱：ODS-2 HYPERSIL(4.6×250 mm，5 μm)

流速: 0.3 mL/min

上样量：10 μl

流动相: A相为40 mM 醋酸铵，pH=5.6；B相为100%甲醇

柱温：45℃

CDL和Heat Block温度：150℃

Nebulizing Gas：1.5 mL/min

检测电压：1.8 kV

线性梯度：

0~5 min(15%B)，5~40 min(15%B~60%B)，40~45 min(60%B~100%B)；

通过上述方法得到的标准曲线见图5。

表一 CS/DS/HA标准二糖m/z值

2.LC/MS-ITTOF分析蛤蟆油CS/DS/HA二糖结构

将液相纯化收集的C₁、C₂、C₃和C₄组分，55℃挥发NH₄HCO₃，浓缩干后进行荧光标记，首先加入5 μL 0.1 M AMAC常温避光涡旋20 min，其中，AMAC溶于DMSO:CH₃COOH=17:3的溶液中。然后，加入5 μL 1.0 M NaBH₃CN（溶于超纯水）水浴45℃，反应4h。最后用50%DMSO稀释后进行质谱分析。得到的质谱图见图6。

根据步骤1所建立的标准曲线，以峰面积/100000为纵坐标，代入曲线得到蛤蟆油中硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸二糖的质量。蛤蟆油C₁、C₂、C₃和C₄组分中CS/DS二糖摩尔百分比见表二，蛤蟆油CS/DS/HA总含量见表三。

表二 蛤蟆油中CS/DS/HA二糖组分摩尔百分比

表三 蛤蟆油中CS/DS/HA二糖组分总含量

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。