阅读说明：本技术 一种隐孔菌子实体多糖及用于抑制黄嘌呤氧化酶活性治疗痛风的用途 (Cryptoporus volvatus fruiting body polysaccharide and application thereof in inhibiting xanthine oxidase activity to treat gout ) 是由 不公告发明人 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种隐孔菌子实体多糖及用于抑制黄嘌呤氧化酶活性治疗痛风的用途。本发明发现,隐孔菌子实体多糖对黄嘌呤氧化酶具有较强的抑制活性。本领域技术人员知道,高尿酸血症和痛风均是体液中尿酸过高所导致,尿酸主要分为外源性和内源性,外源性尿酸主要通过食物摄入,内源性尿酸主要由XOD催化黄嘌呤及次黄嘌呤所产生,当体内XOD增高时会产生过多尿酸,尿酸浓度过高会导致高尿酸血症从而引发痛风。因此,隐孔菌子实体多糖具有开发成抗痛风药物的前景。(The invention discloses cryptoporus volvatus sporocarp polysaccharide and application thereof in inhibiting xanthine oxidase activity to treat gout. The invention discovers that the cryptoporus volvatus sporocarp polysaccharide has stronger inhibitory activity on xanthine oxidase. As known to those skilled in the art, hyperuricemia and gout are both caused by hyperuricemia in body fluid, uric acid is mainly divided into exogenous uric acid and endogenous uric acid, the exogenous uric acid is mainly taken in by food, the endogenous uric acid is mainly generated by catalyzing xanthine and hypoxanthine through XOD, hyperuricemia is generated when the XOD in a body is increased, and the hyperuricemia is caused by the excessive uric acid concentration, so that the gout is caused. Therefore, the cryptoporus volvatus fruiting body polysaccharide has a prospect of being developed into an anti-gout medicine.)

一种隐孔菌子实体多糖及用于抑制黄嘌呤氧化酶活性治疗痛 风的用途

技术领域

本发明属于化学领域，具体涉及一种隐孔菌子实体多糖及用于抑制黄嘌呤氧化酶活性治疗痛风的用途。

背景技术

黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)在核酸分解代谢中起重要作用，能催化黄嘌呤和次黄嘌呤产生尿酸，同时在代谢过程中产生活性氧和过氧化氢引起氧化应激，尿酸及氧化应激都是导致痛风的重要因素。痛风是一种常见的关节炎症性疾病，由关节及软骨组织中尿酸以盐的形式存在所引起的代谢炎症反应疾病。高尿酸血症和痛风均是体液中尿酸过高所导致，尿酸主要分为外源性和内源性，外源性尿酸主要通过食物摄入，内源性尿酸主要由XOD催化黄嘌呤及次黄嘌呤所产生，当体内XOD增高时会产生过多尿酸，尿酸浓度过高会导致高尿酸血症从而引发痛风。临床治疗高尿酸血症常见方法有减少尿酸生成及促进***等，因此降低XOD活性和促进尿酸***是治疗痛风的良好靶点(黑骨藤总黄酮的提取纯化及体外抗黄嘌呤氧化酶的活性筛选，国际药学研究杂志，2019年7月)。

目前临床上治疗痛风药物主要有别嘌醇、半胱氨酸、白细胞介素(IL)-1β抗体、秋水仙素、非甾体抗炎药及糖皮质激素等。但其毒副作用不可忽视，因此寻找抑制XOD活性且高效低毒的药物是必要的。

隐孔菌为多孔菌科隐孔属真菌Cryptoporus volvatus的干燥子实体，主要分布于中国、朝鲜、日本、欧洲和北美，味微苦，性干，有止咳、平喘、解毒等功效，在我国民间自15世纪起便用于治疗气管炎和哮喘。据文献报道，隐孔菌中含有倍半萜、麦角甾醇、氨基酸、多糖等生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及细胞毒等药理作用。

目前没有公开隐孔菌子实体多糖用于抑制黄嘌呤氧化酶活性治疗痛风的研究。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种隐孔菌子实体多糖及用于抑制黄嘌呤氧化酶活性治疗痛风的用途。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种隐孔菌子实体多糖，通过如下方法制备：取干燥的隐孔菌子实体粉末，用蒸馏水加热提取，提取液过滤、减压浓缩，加入3倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，洗涤，用蒸馏水复溶，Sevag法脱蛋白，冷冻干燥，得到粗多糖；取粗多糖，用蒸馏水复溶，上样于DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱中，依次用蒸馏水和1mol/LNaCl溶液洗脱，收集NaCl溶液洗脱液，减压浓缩，透析，冷冻干燥即得隐孔菌子实体多糖。

进一步地，水提醇沉得到的沉淀依次用75％乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤。

进一步地，DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱洗脱时，蒸馏水洗脱体积是10个柱体积。

进一步地，DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱洗脱时，1mol/LNaCl溶液洗脱体积是12个柱体积。

上述隐孔菌子实体多糖用于抑制黄嘌呤氧化酶活性的用途。

上述隐孔菌子实体多糖用于制备抗痛风药物的用途。

技术效果：

本发明发现，隐孔菌子实体多糖对黄嘌呤氧化酶具有较强的抑制活性。本领域技术人员知道，高尿酸血症和痛风均是体液中尿酸过高所导致，尿酸主要分为外源性和内源性，外源性尿酸主要通过食物摄入，内源性尿酸主要由XOD催化黄嘌呤及次黄嘌呤所产生，当体内XOD增高时会产生过多尿酸，尿酸浓度过高会导致高尿酸血症从而引发痛风。因此，隐孔菌子实体多糖具有开发成抗痛风药物的前景。

附图说明

图1为隐孔菌子实体多糖SEM图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。

实施例1：隐孔菌子实体多糖的制备

取干燥的隐孔菌子实体粉末1.5kg，加入25L蒸馏水，85℃加热提取(2h×3次)，合并提取液，离心取上清，减压浓缩至3L，加入3倍体积无水乙醇，4℃静置过夜(12h)，离心(12000r/min×15min)，收集沉淀，依次用75％乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，用蒸馏水复溶，Sevag法脱蛋白，冷冻干燥，得到粗多糖。

取粗多糖，用蒸馏水复溶，配制成10mg/mL的粗多糖溶液，上样于DEAE-SepharoseFast Flow层析柱(内径3.5cm，柱床高度30cm)中，依次用蒸馏水(12个柱体积)和1mol/LNaCl溶液(10个柱体积)洗脱，收集NaCl溶液洗脱液，减压浓缩，透析，冷冻干燥即得隐孔菌子实体多糖，苯酚-硫酸法测定显示多糖含量为95.2％，图1为其SEM图。

实施例2：隐孔菌子实体多糖体外抗黄嘌呤氧化酶活性

体外抗黄嘌呤氧化酶活性参照中国药科大学蒋建勤教授公开的方法(黄瑞香中化学成分抑制黄嘌呤氧化酶活性及其机制研究，中国实验方剂学杂志，2014年3月)改良，根据该方法可知，尿酸在0.001～0.1mmol/L与A_290nm具有良好的线性关系。

一、试验材料

隐孔菌子实体多糖按照实施例1方法制备，4℃干燥保存。

KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O和DMSO为分析纯，黄嘌呤购自Sigma，别嘌呤醇购自上海甄准生物科技有限公司，纯度不低于98％。

黄嘌呤氧化酶购自上海源叶生物科技有限公司。

二、试验方法

1、溶液配制

缓冲溶液配制：精密称取KH₂PO₄0.4780g，K₂HPO₄·3H₂O 3.4730g，加入纯净水约240mL，定容至250mL即得含75mmol/L磷酸根离子，pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。

底物配制：精密称取黄嘌呤3.65mg，加入PBS约45mL，定容至50mL，加热溶解，即得0.48mmol/L底物溶液，底物溶液新鲜配制，现配现用。

酶液配制：移液枪取黄嘌呤氧化酶适量，用PBS配成0.04U/mL的黄嘌呤氧化酶溶液。

供试药物的配制：阳性对照药别嘌呤醇临用前用DMSO配制成母液，再用PBS稀释成线性浓度的阳性对照溶液，DMSO含量小于1％；隐孔菌子实体多糖临用前直接用PBS溶解配制成母液，再用PBS稀释成线性浓度的多糖溶液。

2、测试方法

每个样品的测定由4个体系(样品组，空白组，阳性对照组，阴性对照组)组成(表1)，先将不同浓度样品溶液与黄嘌呤氧化酶在pH 7.4的PBS缓冲液中于25℃下共保温10min，然后加入浓度为0.48mmol/L黄嘌呤起始反应，25℃下反应30min后，加入2mLPBS缓冲溶液，以空白组调零，在290nm处测定样品组A，即为AI，再以阴性对照组调零，在290nm处测定阳性对照组A，即为AE。

表1反应体系(μL)

	样品组	空白组	阳性对照组	阴性对照组
					PBS缓冲溶液	800	1300	1000	1500
酶液	500	0	500	0
					底物溶液	500	500	500	500
抑制剂溶液	200	200	0	0

黄嘌呤氧化酶抑制率公式如下：

酶活性抑制率＝(AE－AI)/AE×100％，其中：AE为未加样品的黄嘌呤氧化酶活力，AI为加入样品的黄嘌呤氧化酶活力。实验重复3次取平均值，SPSS19.0计算IC50值。

三、试验结果

阳性对照和隐孔菌子实体多糖对黄嘌呤氧化酶活力抑制作用的IC50值如表2所示。

表2对黄嘌呤氧化酶活力抑制作用的IC50值

	阳性对照(μM)	隐孔菌子实体多糖(μg/mL)
			IC50值	3.85	7.67

结果表明，隐孔菌子实体多糖对黄嘌呤氧化酶具有较强的抑制活性。本领域技术人员知道，高尿酸血症和痛风均是体液中尿酸过高所导致，尿酸主要分为外源性和内源性，外源性尿酸主要通过食物摄入，内源性尿酸主要由XOD催化黄嘌呤及次黄嘌呤所产生，当体内XOD增高时会产生过多尿酸，尿酸浓度过高会导致高尿酸血症从而引发痛风。因此，隐孔菌子实体多糖具有开发成抗痛风药物的前景。

上述实施例用来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。