一种含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药及其制备方法与应用 (Evodiamine prodrug containing indoloquinone unit and preparation method and application thereof ) 是由 郭惠 马晶晶 王馨怡 杨政 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药及其制备方法与应用。本发明合成了一系列具有吲哚醌单元的强活性的吴茱萸碱衍生物,对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)具有较强的抗增殖活性,且具有剂量和时间依赖性。体外实验评估它们的生物活性,表明合成的化合物对肺癌菌株具有较强的抑制活性。通过分子对接分析,预测了配体与靶蛋白活性位点的结合亲和力,与蛋白质相互作用能力较强。(The invention relates to an evodiamine prodrug containing indoloquinone units, and a preparation method and application thereof. The invention synthesizes a series of evodiamine derivatives with strong activity of indoloquinone units, has strong antiproliferative activity on non-small cell lung cancer (NSCLC), and has dose and time dependence. In vitro experiments evaluate the biological activity of the compounds, and the synthesized compounds have stronger inhibitory activity on lung cancer strains. Through molecular docking analysis, the binding affinity of the ligand and the active site of the target protein is predicted, and the interaction capacity with the protein is strong.)
技术领域
本发明属于药物技术，具体涉及一种含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药及其制备方法与应用。
背景技术
一般认为，中药具有增效减毒的作用。而目前，中医药作为癌症综合治疗的重要组成部分，在肺癌治疗的各个阶段都发挥着不可或缺的作用[Qi, F., L. Zhao, A. Zhou,et al., The advantages of using traditional Chinese medicine as an adjunctivetherapy in the whole course of cancer treatment instead of only terminalstage of cancer. Biosci Trends, 2015. 9(1): p. 16-34]。各种中草药（CHM）包括草药化合物及其提取物被证明通过多种途径和靶点在抗癌治疗中发挥重要作用[Li, Z.Y.,W.C. Huang, R.S. Tu, et al., Sophoraflavanone G Induces Apoptosis in HumanLeukemia Cells and Blocks MAPK Activation. Am J Chin Med, 2016. 44(1): p.165-76.Yang, M.Y., C.H. Hung, C.H. Chang, et al., Solanum nigrum Suppress Angiogenesis-Mediated Tumor Growth Through Inhibition of the AKT/mTOR Pathway. Am J Chin Med, 2016. 44(6): p. 1273-1288.Fu, S., Y. Yang, D. Liu, etal., Flavonoids and Tannins from Smilax china L. Rhizome Induce Apoptosis Via Mitochondrial Pathway and MDM2-p53 Signaling in Human Lung Adenocarcinoma Cells. Am J Chin Med, 2017. 45(2): p. 369-384]。天然活性化合物在非小细胞肺癌治疗的可塑性中也发挥着重要作用，并已被越来越多的人所认识。
中药，包括草药化合物及其提取物，已被证明通过多种途径和靶点在癌症治疗中发挥关键作用。吴茱萸碱 (EVO)是一种从Euodiae Fructus中提取的喹诺酮类生物碱，具有低毒性，长期以来被证明具有抗肺癌活性。然而，它缺乏特异性，并受到不良毒性和副作用的限制。
发明内容
本发明公开了一种含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药及其制备方法与应用。吴茱萸碱（EVO）是一种低毒的天然吲哚类生物碱，广泛存在于中药吴茱萸中。一些研究报道了吴茱萸碱对癌细胞的抗增殖、促凋亡和抗侵袭作用，现有技术以吴茱萸碱为先导化合物，进行了系统的结构优化和构效关系研究，设计并合成了多个化合物，并从中筛选出一些高活性化合物，如10-羟基吴茱萸碱，但是目前公开的吴茱萸碱前药性能还需改善。本发明报道了含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药的设计、合成和初步药物研究。研究所合成的化合物对人NSCLC细胞系细胞活性和凋亡的影响，并进一步探讨其机制。
本发明采用如下技术方案：
一种含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药，其化学结构式如下：
n为2～4。
本发明公开了一种吲哚醌羧酸化合物，其化学结构式如下：
n为2～4。
本发明公开了上述吲哚醌羧酸化合物的制备方法，由羟基吲哚醌与酸酐类化合物反应，制备吲哚醌羧酸化合物。
本发明公开了上述含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药的制备方法，由羟基吲哚醌与酸酐类化合物反应，制备吲哚醌羧酸化合物；再将吲哚醌羧酸化合物与羟基吴茱萸碱反应，得到含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药。
羟基吲哚醌的化学结构式如下：
酸酐类化合物为二酸酐或者二硫代丙二酸酐；优选的，二酸酐的化学结构式如下：
n`为0～4。
羟基吴茱萸碱的化学结构式如下：
本发明中，羟基吲哚醌与酸酐类化合物在有机催化剂存在下、溶剂中室温反应，得到吲哚醌羧酸化合物；优选的，反应时间为12～24小时；有机催化剂为吡啶化合物，比如DMAP，4-二甲氨基吡啶。优选的，羟基吲哚醌、酸酐类化合物、有机催化剂的摩尔用量比为1∶3∶1。
本发明中，吲哚醌羧酸化合物与羟基吴茱萸碱在有机催化剂与胺配体存在下、溶剂中室温反应，得到含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药。优选的，反应时间为24～48小时；有机催化剂为吡啶化合物，比如DMAP，4-二甲氨基吡啶；胺配体为碳二亚胺，比如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)。优选的，吲哚醌化合物、羟基吴茱萸碱、有机催化剂、胺配体的摩尔用量比为1∶1∶1∶5。
本发明公开了上述吲哚醌羧酸化合物在制备上述含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药中的应用；还公开了上述含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，肿瘤为肺癌。
本发明成功设计并合成了一系列含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药，然后在体外实验评估它们的生物活性。合成的化合物对A549和H358菌株具有较强的抑制活性。作为具体的实验：MTT结果显示，本发明的前药能显著抑制细胞活力和增殖，且呈剂量和时间依赖性，说明化合物具有较强的抗增殖作用。凋亡是抗肿瘤治疗的重要靶点，进一步通过AnnexinV/PI染色流式细胞术检测化合物对肿瘤细胞凋亡的影响。A549细胞用不同浓度的化合物处理24 h，收获细胞并用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色。Annexin V是一种与磷脂结合的蛋白，与磷脂酰丝氨酸有很强的亲和力，它作为凋亡的一般指标出现在细胞表面。在本研究中，含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药诱导A549 NSCLC细胞凋亡。在相互作用能方面，结果表明化合物9a、9b、9c和9d与蛋白质发生了很大的相互作用。通常，NQO1的活性残基包括PHE 17、ASN 18、LEU 103、PHE 106、GLY 149、THR 147、GLY 150、TYR 155 和ARG 200可以与化合物 9a、9b、9c和9d 有不同程度的相互作用，分子对接分析预测了配体在靶蛋白活性位点的结合亲和力。
附图说明
图1为采用MTT法测定不同化合物作用于A549细胞与H358细胞的细胞毒性结果；
图2为化合物9b的细胞毒性结果，采用MTT法；使用不同浓度的9b(0.125μM, 0.25μM, 0.5 μM和1μM)作用于H2122, H358, H23和A549细胞；
图3为用DMSO或不同浓度的化合物9b（0.375、0.75、1.5和3μM）处理H358细胞后(A)用annexinv-FITC/PI染色，流式细胞仪分析凋亡结果；(B）Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白；
图4为分子对接模拟分析，化合物9a（A）、9b（B）、9c（C）和9d（D）在活性结合囊中与疏水效应区的受体-配体相互作用的三维对接结果。
具体实施方式
本发明反应过程中涉及到的原料及试剂，除了特殊说明之外，均为分析纯，均从Sigma Aldrich Trading Co. Ltd.购买。终产物采用普通硅胶柱层析、快速硅胶柱层析以及重结晶等常规方法进行纯化。核磁共振波谱仪为德国公司Bruker AVANCE400和 BrukerAVANCE500型，TMS做内标物，溶剂采用DMSO-d 6或者CDCl3，化学位移（d）和耦合常数（J）单位分别为ppm和Hz。ESI质谱由Aglient 7250& JEOL-JMS-T100LP AccuTOF质谱仪完成，TLC分析采用的硅胶GF254(中国青岛海洋化学)，硅胶柱层析采用60G硅胶(中国青岛海洋化学)。
人非小细胞肺癌细胞系H2122、H358、H23和A549购买自美国模式培养物集存库(ATCC, Manassas, Virginia, USA)。RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素(P/S)购自Gibco (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化铵(MTT)是从北京赛默飞世尔科技有限公司(Thermo FisherScientific, Beijing, China)所购买的。抗GAPDH(#5174)、PARP(#13684)、p-AKT(#4046)、p-ERK(#4376)、t-AKT(#9272)、t-ERK(#9102)、p-mTOR(#2974)和总mTOR(#2983)的一抗由Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)提供。荧光素二级抗体由LI-COR生物科学公司(Lincoln, NE, USA)提供。Annexin V-FITC/PI死亡细胞凋亡试剂盒由BDBiosciences (San Jose, CA, USA)提供。
合成例
5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-氨基醛（2）。在搅拌下将POCl3（0.85mL，9.28mmol）加入到冷却至0℃的DMF（N,N-二甲基甲酰胺，3.0mL，38.9mmol）中。添加后，继续在0℃下搅拌15分钟制备Vilsmeier试剂。将5-甲氧基-2-甲基吲哚（1.04g，6.45mmol）溶于3mL无水DMF中，并冷却至0℃，加入先前制备的Vilsmeier试剂。加入完成后，在0℃下再搅拌反应30分钟，TLC点板检测，待反应结束后，将反应液加到0℃的2M NaOH（50mL）水溶液中，加入DCM（二氯甲烷，100mL）并进行萃取分离。将水层用DCM（50mL）再萃取一次。合并有机层，用饱和食盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。除去溶剂，残余物用冷却的EtOAc洗涤，得到1.05g（86％）的化合物2，为浅棕色固体。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 10.04 (s, 1H), 7.74 (d, J =2.2 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 3.88(s, 3H), 2.72 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 184.47, 162.71,156.40, 147.94, 130.22, 126.91, 113.07, 111.82, 102.88, 55.87, 36.61 ppm。
5-甲氧基-1,2-二甲基-1H-吲哚-3-甲醛（3）。将化合物 2（1.78g，9.40mmol）在氮气保护下加入到NaH悬浮液（0.564g 60％的矿物油中，14.11mmol）中。 将混合物在室温搅拌2小时后，用冰水浴冷却至0℃。再加入溴乙酸乙酯（1.25mL，11.28mmol），使反应升温至室温，并搅拌2小时。将水（50mL）加入混合物中，并用DCM（40mL X 3）萃取。合并有机层，用水（50mL）和饱和食盐水（50mL）洗涤，然后用Na2SO4干燥。除去溶剂后，将残余物在柱层析上纯化，用EtOAc石油醚（1∶2，Rf＝0.25）洗脱，得到1.97g（97.0％）的浅白色固体状的化合物3。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 10.09 (s, 1H), 7.79 (d, J = 2.4 Hz, 1H),7.19 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.91 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.68(s, 3H), 2.66 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 183.86, 162.56,156.60, 147.92, 131.88, 126.31, 112.84, 109.97, 102.97, 55.88, 29.73, 10.42ppm。
4-氨基-5-甲氧基-1,2-二甲基-1H-吲哚-3-甲醛（5）。将化合物 3 （1.09g，5.38mmol）溶于乙酸（88.7mL）中，于15℃下加入硝酸溶液（3.2mL硝酸溶于18.8mL醋酸），加入完成后，将混合物升至室温并再继续搅拌2小时。然后将反应混合物倒入冰/水混合液中（200ml），用DCM（150mL x 3）萃取，用水（200ml）和盐水（200ml）洗涤，并用Na2SO4干燥。去除溶剂，得到4-和6-硝基的混合物，直接用于下一步，无需进行纯化。将混合物（1.25g）溶于80mL乙醇中，加入锡粒（1.67g，14.1mmol），然后加入HCl（3.0M，16mL）。加热回流1小时。加水（20mL），用NaHCO3（aq）中和溶液，用DCM（200mL×3）萃取。用水（100mL）和饱和食盐水（50mL）洗涤合并的有机层，并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，柱层析纯化，用EtOAc/石油醚（1:1，Rf=0.17）洗脱，得到0.33g（两步，47%产率）呈黄色固体的5。1H NMR (500 MHz, Chloroform-d)δ9.76 (s, 1H), 6.85 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.91 (s,2H), 3.86 (s, 3H), 3.56 (s, 3H), 2.57 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d)δ 183.08, 149.82, 141.76, 134.63, 132.34, 115.58, 113.24, 110.13, 96.17,57.30, 29.91, 10.66 ppm。
5-甲氧基-1,2-二甲基-4,7-二氧基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-氨醛（6）。将化合物 5（98mg，0.45mmol）溶于10mL丙酮中，加入溶解于磷酸二氢钠缓冲液（10mL，0.3M，pH6.0）的弗氏盐（0.24g，0.9mmol）溶液，并且在室温下搅拌反应3小时。利用旋转蒸发仪除去多余的丙酮。所得残留物用DCM（20mL×2）萃取。合并有机层，用水（20mL x 2）和饱和食盐水（10mL）洗涤，并用Na2SO4干燥，得到6（86mg）（82%产率）红色固体，无需进一步纯化。1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 10.55 (s, 1H), 5.71 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 2.62(s, 3H); 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 188.34, 179.06, 177.87, 159.84,142.71, 124.96,122.80,120.00, 106.75, 56.77, 32.26, 11.33 ppm。
3-(羟甲基)-5-甲氧基-1,2-二甲基-1H-吲哚-4,7-二酮(7)。将化合物 6 (100mg，0.43mmol)溶于无水甲醇(3mL)和无水四氢呋喃(3mL)的混合液中。并用冰水浴冷却到0°C。向其分三批均匀加入NaBH4 (0.812g，2.15mmol)，维持此温度搅拌反应8分钟。反应结束后，用10%的NH4Cl水溶液淬灭反应至不再有气泡产生。除去溶剂，用二氯甲烷(20mL)溶解萃取，合并有机层，饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，残渣通过硅胶柱层析石油醚/乙酸乙酯（1:1,Rf =0.3）纯化得到产物57mg化合物7（56%产率），为鲜红色固体，用于以下反应。1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 5.64 (s, 1H), 4.62 (d, J = 7.1Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 2.23 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz,Chloroform-d) δ 179.69, 179.05, 160.11, 135.05, 129.87, 123.20, 122.49,107.53, 57.00, 56.34, 32.82, 9.97 ppm。
吲哚醌骨架化合物的合成路线如下所示：
以5-甲氧基-2-甲基吲哚（1）为原料，首先用维尔斯迈尔试剂处理得到3-甲酰基中间体2，中间体 2在氢化钠存在下用碘甲烷甲基化得到中间体3。在较低的反应浓度和大量过量的硝酸存在条件下，对所需位置4进行硝化反应，由于中间体4在有机溶剂中的低溶解性，不经纯化直接用于下一步。用Sn/HCl还原硝基生成胺类中间体5，然后使用色谱柱法纯化。
弗氏盐被用来将具有芳香环的胺类中间体5氧化成醌结构，中间体6在NaBH4存在下被还原为羟基中间体7，再利用二元羧酸的酸酐，如丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐和二硫代丙二酸酐，通过缩合反应将中间体7的羟基转化为含有不同链长的脂肪羧酸，得到目标中间体8a-d。
以中间体8a-8d为原料，将其同EDCI、DMAP在二氯甲烷中搅拌，最后所合成的不同链长的脂肪羧酸与高活性吴茱萸碱衍生物经缩合反应得到目标产物9a-9d：
实施例一
化合物8a的合成。将丁二酸酐（51mg，0.51mmol）溶解于DCM（2mL）中，加入DMAP（41.5mg，0.34mmol）作为催化剂，常规搅拌30分钟后，加入化合物7（40mg，0.17mmol），在室温下继续搅拌12小时。然后用10wt%的盐酸（20ml）洗涤，并用DCM（20mL×3）萃取。合并有机层用饱和食盐水（20mL）洗涤并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，柱层析纯化残余物，用EtOAc/石油醚（1:1，Rf=0.21）洗脱，得到红色固体形式的化合物8a(产率73%)。
化合物8b的合成。将戊二酸酐（58.2mg，0.51mmol）溶解于DCM（2mL）中，加入DMAP（41.5mg，0.34mmol）作为催化剂，常规搅拌30分钟后，加入化合物7（40mg，0.17mmol），在室温下继续搅拌12小时。然后用10wt%的盐酸（20ml）洗涤，并用DCM（20mL×3）萃取。合并有机层用饱和食盐水（20mL）洗涤并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，柱层析纯化残余物，用EtOAc/石油醚（1:1，Rf=0.21）洗脱，得到红色固体形式的化合物8b (产率70%)。
化合物8c的合成。将己二酸（2.0 g）溶解于6 mL乙酰氯中并回流，持续1.5小时。除去溶剂后，残余物在冷乙醚（20 mL）中沉淀4 h。将混合物过滤以除去乙醚并真空干燥24小时后获得己二酸酐。将己二酸酐（65mg，0.51mmol）溶解于DCM（2mL）中，加入DMAP（41.5mg，0.34mmol）作为催化剂，常规搅拌30分钟后，加入化合物7（40mg，0.17mmol），在室温下继续搅拌18小时。然后用10wt%的盐酸（20ml）洗涤，并用DCM（20mL×3）萃取。合并有机层用饱和食盐水（20mL）洗涤并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，柱层析纯化残余物，用EtOAc/石油醚（1:1，Rf=0.21）洗脱，得到红色固体形式的化合物8c(产率68%)。
化合物8d的合成。将3,3’-二硫代二丙酸（2.0 g）溶解于6 mL乙酰氯中并回流，持续1.5小时。除去溶剂后，残余物在冷乙醚（20 mL）中沉淀4 h。将混合物过滤以除去乙醚并真空干燥24小时后获得3,3’-二硫代二丙酸酐。将3,3’-二硫代丙二酸酐（98mg，0.51mmol）溶解于DCM（2mL）中，加入DMAP（41.5mg，0.34mmol）作为催化剂，常规搅拌30分钟后，加入化合物7（40mg，0.17mmol），在室温下继续搅拌24小时。然后用10wt%的盐酸（20ml）洗涤，并用DCM（20mlx3）萃取。合并有机层用饱和食盐水（20mL）洗涤并用Na2SO4干燥。去除溶剂后，柱层析纯化残余物，用EtOAc/石油醚（1:1，Rf=0.21）洗脱，得到红色固体形式的化合物8d (产率65%)。
上述产物表征如下：
4-（（5-甲氧基-1,2-二甲基-4,7-二氧基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-基）甲氧基）-4-氧代丁酸（8a）：1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ5.62 (s, 1H), 5.28 (s, 2H), 3.90(s, 3H), 3.80 (s, 3H), 2.69~2.65 (m, 2H), 2.63~2.59 (m, 2H), 2.27 (s, 3H).13CNMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 179.03, 177.74,177.36, 172.20, 159.83, 138.11,129.25, 124.96, 115.75,106.79, 57.06, 56.59, 32.55, 29.01, 28.80, 9.65 ppm.
5-（（5-甲氧基-1,2-二甲基-4,7-二氧基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-基）甲氧基）-5-氧代戊酸（8b）：1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 5.62 (s, 1H), 5.25 (s, 2H), 3.90(s, 3H), 3.80 (s, 3H), 2.42~2.37 (m, 4H), 2.28 (s, 3H), 1.97~1.92 (m, 2H).13CNMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 179.04, 178.31, 177.74, 172.98, 159.85, 137.99,129.32, 121.89, 115.88, 106.79, 56.82, 56.59, 33.24, 33.04, 32.56, 20.02,9.68 ppm.
6-((5-甲氧基-1,2-二甲基-4,7-二氧-4,7-二氢-1H-吲哚-3-基)甲氧基)-6-氧代己酸 (8c)：1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 )δ 5.73 (s, 1H), 4.57 (s, 2H), 3.83 (s, 3H),3.75 (s, 3H), 2.74~2.66 (m, 2H), 2.24 (s, 3H), 2.04~1.93 (m, 1H), 1.23 (s,3H), 1.10 (t, J = 7.5 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6 ) δ 177.99, 177.37,159.19, 137.08, 127.52, 121.67, 120.42, 106.56, 56.37, 53.20, 37.96, 31.87,30.89, 16.33, 13.61, 9.15 ppm.
3-((3-((5-甲氧基-1,2-二甲基-4,7-二氧-4,7-二氢-1H-吲哚-3-基)甲氧基)-3-氧代丙基)二硫烷基)丙酸( 8d)：1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)δ5.73 (s, 1H), 4.56 (s,2H), 3.83 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 2.75~2.65 (m, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.23 (s,2H), 1.10 (t, J = 7.5 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6) δ177.98, 177.38,159.20, 142.28, 137.09, 127.53, 121.66, 120.42, 106.55, 56.37, 53.21, 31.88,16.34, 13.61, 9.15 ppm。
实施例二
10-OH-EVO的化学结构式如下：
化合物9a的合成。将10-OH-EVO（15.95mg，0.05mmol）溶解在DCM（2mL）中，并将DMAP（6.1mg，0.05mmol）作为催化剂加入混合物中。加完后，0℃搅拌，加入化合物8a(12mg，0.05mmol)和EDCI(0.25mmol)，再于室温搅拌24小时。然后用10%的盐酸(20ml)洗涤反应混合物并用DCM(20mL×3)萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠(20ml)和饱和食盐水(20mL)洗涤并用Na2SO 4干燥。除去溶剂后，残余物在硅胶上纯化，用DCM/CH3OH(4%，Rf = 0.32)洗脱，得到化合物9a(58%产率)，为浅红棕色固体。
化合物9b的合成。将10-OH-EVO（15.95mg，0.05mmol）溶解在DCM（2mL）中，并将DMAP（6.1mg，0.05mmol）作为催化剂加入混合物中。加完后，0℃搅拌，加入化合物8b(17.47mg，0.05mmol)和EDCI(0.25mmol)，再于室温搅拌24小时。然后用10%的盐酸(20ml)洗涤反应混合物并用DCM(20mL×3)萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠(20ml)和饱和食盐水(20mL)洗涤并用Na2SO 4干燥。除去溶剂后，残余物在硅胶上纯化，用DCM/CH3OH(4%，Rf = 0.32)洗脱，得到化合物9b(51%产率)，为浅红棕色固体。
化合物9c的合成。将10-OH-EVO（15.95mg，0.05mmol）溶解在DCM（2mL）中，并将DMAP（6.1mg，0.05mmol）作为催化剂加入混合物中。加完后，0℃搅拌，加入化合物8c(18.17mg，0.05mmol)和EDCI(0.25mmol)，再于室温搅拌24小时。然后用10%的盐酸(20ml)洗涤反应混合物并用DCM(20mL×3)萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠(20ml)和饱和食盐水(20mL)洗涤并用Na2SO 4干燥。除去溶剂后，残余物在硅胶上纯化，用DCM/CH3OH(4%，Rf = 0.32)洗脱，得到化合物9c(49%产率)，为浅红棕色固体。
化合物9d的合成。将10-OH-EVO（15.95mg，0.05mmol）溶解在DCM（2mL）中，并将DMAP（6.1mg，0.05mmol）作为催化剂加入混合物中。加完后，0℃搅拌，加入化合物8d(21.37mg，0.05mmol)和EDCI(0.25mmol)，再于室温搅拌24小时。然后用10%的盐酸(20mL)洗涤反应混合物并用DCM(20mL×3)萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠(20mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤并用Na2SO 4干燥。除去溶剂后，残余物在硅胶上纯化，用DCM/CH3OH(4%，Rf = 0.32)洗脱，得到化合物9d(59%产率)，为浅红棕色固体。
上述产物表征如下：
（5-甲氧基-1,2-二甲基-4,7-二氧基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-基）甲基（14-甲基-5-氧基-5,7,8,13,13b，14-六氢吲哚[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-10-基）琥珀酸（9a）：1HNMR (400 MHz, Chloroform-d) δ8.26 (s, 1H), 8.11 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.49 (t,J = 7.4 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.22 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.14 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.90 (s, 1H), 5.61 (s, 1H), 5.32(s, 2H), 4.85 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 4.12 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H),3.80 (s, 3H), 2.91 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.76 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.49 (s,3H), 2.27 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6 ) δ178.17, 177.08, 171.73, 171.36,164.15, 159.22, 148.68, 146.62,143.58, 138.62, 134.15, 133.44, 132.17,128.17, 127.96, 125.94, 120.82, 120.29, 119.19, 117.45, 116.00, 111.91,111.68, 110.27, 106.67, 69.68, 56.41, 36.51, 32.09, 28.91, 28.72, 19.37, 9.09ppm.MS (ESI, positive) found (M+Na) 659.21, calc (C35H32N4O8 m/z) 636.66.
（5-甲氧基-1,2-二甲基-4,7-二氧基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-基）甲基（14-甲基-5-氧基-5,7,8,13,13b，14-六氢吲哚[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-10-基）戊二酸（9b）：1HNMR (400 MHz, Chloroform-d)δ 8.24 (s, 1H), 8.11 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.52 –7.46 (m, 1H), 7.35 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.14 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.90 (s, 1H), 5.61 (s, 1H), 5.29 (s,2H), 4.85 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 4.12 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.79(s, 3H), 2.91 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 2.65 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.49 (s, 3H),2.47 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 2.29 (s, 3H), 2.12 – 2.06 (m, 2H).13C NMR (101MHz,DMSO-d6) 177.06, 174.65, 172.33, 171.93, 159.64, 159.23, 153.76, 148.70,143.56, 138.55, 134.15,133.42,131.18,128.24,127.96,125.97,122.87,120.31,119.22,117.49,116.16,114.75,111.90,110.43, 106.68, 99.44,69.66, 56.49, 56.21,40.80,36.50, 32.44, 32.11, 19.94,19.39, 9.07.MS (ESI, positive) found (M+Na)673.26, calc (C36H34N4O8 m/z) 650.69.
（5-甲氧基-1,2-二甲基-4,7-二氧基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-基）甲基（14-甲基-5-氧基-5,7,8,13,13b，14-六氢吲哚[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-10-基）己二酸（9c）：1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.70 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.77 (d, J = 9.0 Hz,1H), 7.46 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 8.2 Hz,1H), 6.94 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.61 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.08 (s, 1H),5.73 (s, 1H), 4.57 (s, 2H), 3.84 (s, 5H), 3.75 (s, 5H), 2.73 (s, 3H), 2.69 –2.63 (m, 2H), 2.03 – 1.97 (m, 2H), 0.85 (t, J = 6.6 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz,DMSO-d6) δ 178.03, 177.42, 164.22, 162.28, 159.22, 150.68, 148.62, 137.15,133.40, 131.10, 130.90, 127.94, 127.54, 126.68, 121.69, 120.43, 119.95,118.95, 117.01, 110.59, 106.59, 102.10, 69.95, 56.40, 53.21, 41.00, 36.36,35.76, 31.91, 19.51, 9.20.MS (ESI, positive) found (M+) 664.24, calc(C36H34N4O8 m/z) 664.72.
（5-甲氧基-1,2-二甲基-4,7-二氧基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-基）甲基3-（（3-（（14-甲基-5-氧代-5,7,8,13,13b，14-六氢吲哚[2',3':3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-10-基）氧基）-3-氧丙基）二磺酰基）丙酸（9d）：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.70 (s, 1H), 7.95 (s,1H), 7.78 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.47 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.6 Hz,1H), 7.02 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.94 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 10.9Hz, 1H), 6.08 (s, 1H), 5.74 (s, 1H), 4.58 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.75 (s,3H), 3.18 (dd, J = 11.9, 8.0 Hz, 2H), 2.89 (d, J = 1.2 Hz, 4H), 2.87 – 2.79(m, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.66 (dd, J = 15.2, 4.5 Hz, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.24(s, 2H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 178.03, 177.42, 164.21, 162.28, 159.22,150.67, 148.62, 137.15, 133.39, 131.10, 130.89, 127.94, 127.54, 126.67,121.69, 120.43, 119.96, 118.96, 117.02, 112.07, 112.00, 110.59, 106.59,102.09, 69.94, 64.90, 56.41, 53.20, 40.99, 36.35, 35.75, 31.91, 30.75, 19.50,9.20。
实施例三 细胞毒性实验
人NSCLC细胞系H2122、H358、H23和A549在含有10% (v/v)胎牛血清和1%青霉素/链霉素(P/S)的RPMI-1640培养基中孵育，温度为37℃，湿度为5% CO2。当细胞密度达到70～80%时，继代培养完成。培养基每3天更换一次。
采用了常规的MTT法测定了目标化合物体外抗肿瘤细胞增殖活性。
选择了20μM的药物浓度（化合物溶在DMSO中）分别处理A549和H358细胞72h：收集对数生长期的细胞，使用培养液调整细胞悬液浓度，以每孔3×103个细胞的密度接种于96孔板中，在CO2培养箱中培养12h，至细胞稳定单层铺满孔底，加入200μL浓度梯度的化合物，每组设置三个复孔。CO2培养箱中孵育72h后，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h，弃去孔内培养液（悬浮细胞2000Rrpm平板离心12 min后弃去孔内培养液），向每孔中加入100μLDMSO，37℃下在摇床上缓慢震荡以充分溶解甲瓒结晶。使用酶标仪测定溶液在490nm处的吸光度。结果如图1所示。从图中可以看出，化合物9a、9b显现出更好的细胞毒性，并显著抑制NSCLC细胞的增殖。
将化合物9b加入DMSO中溶解，配制不同浓度梯度的化合物溶液，选取4种肿瘤株研究化合物9b的体外抗肿瘤活性：H2122、H358、H23和A549。收集对数生长期的细胞，使用培养液调整细胞悬液浓度，以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中，在CO2培养箱中培养12h，至细胞稳定单层铺满孔底，加入200μL不同浓度梯度的化合物（对照组不加化合物只加等量DMSO），每组设置三个复孔。CO2培养箱中孵育后，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h，弃去孔内培养液（悬浮细胞2000Rrpm平板离心12 min后弃去孔内培养液），向每孔中加入100μLDMSO，37℃下在摇床上缓慢震荡以充分溶解甲瓒结晶。使用酶标仪测定溶液在490nm处的吸光度，常规计算细胞存活率：
存活率（%）=(OD实验组- OD空白对照)/ (OD对照组- OD空白对照) ×100%
然后用Grahpad Prism8软件处理，计算出化合物的IC50值。每次实验平行重复进行三次，IC50值取其平均值±标准偏差（SD）。
观察化合物9b对H2122、H358、H23和A549细胞的增殖抑制作用，图2为分别用不同浓度的化合物9b分别处理细胞24、48和72 h，化合物9b能显著抑制4种NSCLC细胞的增殖，图中给出了其半数抑制浓度(IC50)数据。
实施例四 细胞凋亡分析
使用不同浓度9b (0.375, 0.75, 1.5以及3 μM）DMSO溶液对 A549细胞处理48h并用含3‰ DMSO无药物RPMI 1640培养基作为对照组，处理细胞用于凋亡分析以及蛋白质印迹分析。按照细胞凋亡检测试剂盒的说明方法对细胞进行处理，并用AnnexinV-FITC和PI双染色剂对其染色。带有绿色荧光探针FITC的AnnexinV能够特异性的结合细胞表面的磷脂酰丝氨酸PS，而PI可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞。处理后的样品可通过流式细胞仪定量检测细胞的凋亡程度。采用Annexin V-FITC和PI双染色试剂盒对NSCLC细胞凋亡进行定量分析。不同凋亡阶段特定细胞群的百分比如图3A所示，化合物9b以浓度依赖性方式诱导H358细胞凋亡。如图3A所示，暴露于不同浓度（0.375、0.75、1.5和3μM）化合物9b作用48h后，细胞凋亡率分别为12.43%、16.83%、21.1%和48%。对照组凋亡细胞百分率为4.28%。
实施例五 蛋白质印迹分析
为了确定细胞中的蛋白质水平，进行了western-blotting。用各种一级抗体（包括GAPDH、PARP、PARP、p-AKT、p-ERK、t-AKT、t-ERK、p-mTOR和总mTOR抗体）在4℃下以1:800稀释过夜培养细胞膜。然后，用二级抗体在37℃孵育2小时。将增强化学发光反应混合物滴到膜上，在暗室中反应2分钟。使用LI-COR Odyssey扫描仪（Belfast，ME，USA）检测蛋白质表达，不同浓度的化合物9b处理48 h后，Western blot检测蛋白表达水平，如图3B所示。
实施例六 分子模拟
NAD(P)H：醌氧化还原酶-1 (NQO1) 的3DX射线晶体结构与基于香豆素的抑制剂AS1（PDB 代码：3JSX）结合，来自蛋白质数据库 (PDB)。对活性化合物9a、9b、9c和9d进行了对接实验。通过Autodock vina产生的受体-配体相互作用。为了进行对接实验，从PDB坐标中识别并记录了原始配体活性位点残基。使用Discovery Studio Visualization 4.5（Accelrys, Inc., San Diego, CA 92121, CA, USA）将绑定结果可视化为3D图。进一步评估DOCKER相互作用能 (Kcal/mol)值以评估能量匹配程度。通过分子的构建和对接分析，研究活性化合物9a、9b、9c和9d之间的潜在结合模式和相互作用。计算预测的最低能化合物是稳定的分子间氢键和堆叠相互作用。化合物的结合值分别为-6.91、-6.52、-7.23和-6.98kcal/mol。可以看到(图4)，对接的结果表明，化合物可以与选定的目标发生不同程度的相互作用。
以上所有结果均以三个独立实验的平均标准差（SD）表示。Student t检验用于分析药物暴露细胞与对照细胞之间的统计学显著性差异，其中统计学显著性定义为p值小于0.05（p<0.05）。
结论
本发明的研究表明，这些具有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药代表了一类有潜力的具有潜在新治疗价值的细胞毒性药物。因此，本发明首次报道了含有吲哚醌单元的吴茱萸碱前药的合成方法及抑制人NSCLC细胞增殖和诱导凋亡作用，发现化合物可以改变凋亡相关蛋白的表达，抑制AKT-mTOR和(MAPK)/ER通路的活性。总的来说，这项研究可能为开发新的抗癌药物提供一个策略。
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