阅读说明：本技术 一种固定化菌剂及其制备方法和应用 (Immobilized microbial inoculum and preparation method and application thereof ) 是由 陈惠明 蒋自胜 翟德勤 余艳鸽 郑茂盛 商放泽 俞静雯 于 2019-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及菌剂固定化技术领域,具体公开一种固定化菌剂及其制备方法和应用。所述固定化菌剂,包含不动杆菌和固定化载体,所述固定化载体为谷糠。所述的固定化菌剂的制备方法,至少包括以下步骤：培养所述不动杆菌得到菌悬液；将所述谷糠进行灭菌处理,然后与所述菌悬液在无菌条件下混合均匀,烘干得到所述固定化菌剂。本发明通过制备固定化菌剂,将不动杆菌负载到固定化载体中,保证微生物的生理活性和稳定性不受影响,同时为微生物提供好氧缺氧的微环境,既利于菌剂的生长又利于菌剂反硝化脱氮性能的发挥。(The invention relates to the technical field of microbial inoculum immobilization, and particularly discloses an immobilized microbial inoculum, and a preparation method and application thereof. The immobilized microbial inoculum comprises acinetobacter and an immobilized carrier, wherein the immobilized carrier is rice bran. The preparation method of the immobilized microbial inoculum at least comprises the following steps: culturing the acinetobacter to obtain a bacterial suspension; and sterilizing the bran coat, uniformly mixing the bran coat and the bacterial suspension under the aseptic condition, and drying to obtain the immobilized microbial inoculum. According to the invention, the immobilized microbial inoculum is prepared, and the acinetobacter is loaded into the immobilized carrier, so that the physiological activity and stability of the microorganism are not affected, and an aerobic and anoxic microenvironment is provided for the microorganism, thereby being beneficial to the growth of the microbial inoculum and the performance of denitrification and denitrification of the microbial inoculum.)

一种固定化菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及菌剂固定化技术领域，尤其涉及一种固定化菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

工农业的迅速发展和人类的生产活动，给水体环境带来了严重的污染。氮超标是水体污染中最常见的一类污染问题，其会引起水体富营养化，导致藻类大量繁殖，水体溶氧降低，水体黑臭，这不仅危及人类的用水安全，还会严重影响水体的生态平衡；另外，氮排放过量还会导致氮平衡被破坏，从而造成水体失去自净功能。因此，富含氮的污水需要经过脱氮处理达标后才能排放到自然环境中。

生物脱氮是目前应用广泛的脱氮方法，有处理效果好、处理过程稳定可靠和操作管理方便等优点。传统的生物脱氮是利用硝化菌的好氧自养硝化作用和反硝化菌的厌氧异养反硝化作用共同完成，这样的生物脱氮需要分别提供有氧和无氧的两个反应器以分别进行硝化作用和反硝化作用，以达到脱氮的目的。故这样的反应器所占空间较大，运行成本较高，工艺较为繁琐。

固定化技术是指通过物理或者化学的手段，将游离的微生物或者酶限定在一个特定的空间区域内，使其得到更广泛而有效的利用。在流动态的污水中，由于水体的流动，固定化载体材料的选择直接影响到微生物的生理活性和稳定性，甚至微生物的流失，因此选择一种既能保证单位体积内的足够的微生物量的同时，又能对微生物具有保护作用使其处于高活性状态的固定化载体，成为研究的热点。

发明内容

针对现有生物脱氮成本高、工艺繁琐、固定化工艺降低菌种活性等问题，本发明提供一种固定化菌剂。

以及，上述固定化菌剂的制备方法。

以及，上述固定化菌剂在含氮污水处理中的应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种固定化菌剂，包含不动杆菌和固定化载体，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16620；所述固定化载体为谷糠。

本发明提供的固定化菌剂，具有以下优势：

本发明将不动杆菌以固定化菌剂的形式保存，将不动杆菌负载到谷糠中，解决不动杆菌的难以保藏的问题，保证微生物的生理活性和稳定性不受影响，同时为微生物提供好氧缺氧的微环境，既利于菌剂的生长又利于菌剂反硝化脱氮性能的发挥，也有利于在使用时保持高活菌浓度、提高降解含氮污水的速率，并且固定化菌剂还具有便于施用、分离和可重复使用的优点。

本发明以质量小的谷糠为固定化载体，撒向水体时易受风影响，使得固定化菌剂能均匀分散到污水中，并且漂浮在水面上，不容易沉降入水中对水体造成二次污染；同时谷糠多孔特征明显，比表面积较大，吸附能力较强，以它为载体的固定化菌剂投加到污水中后，会促进含氮类污染物向谷糠载体迁移，使谷糠同时富集不动杆菌和污染物，增加了微生物和污染物的接触；谷糠还可以为不动杆菌提供的独立微环境，屏蔽外界不利因素对不动杆菌的直接侵害，提高不动杆菌对污染环境中含氮类污染物的去除效率；且谷糠作为一种有机物，可以为不动杆菌的繁殖提供营养物质，为不动杆菌保持高活菌浓度提供营养基础，所以谷糠固定化菌剂可实现污染物的富集-降解一体化，有助于促进污水中含氮类污染物的降解。

本发明提供的不动杆菌是一种好氧反硝化菌，该不动杆菌通过生物培养手段富集筛选得到，该不动杆菌具有在有氧条件下能发挥反硝化作用的特点，采用该好氧反硝化菌株代替了常规的厌氧反硝化菌，进行污水的生物脱氮处理时，可以使硝化作用和反硝化作用在一个反应中进行，因此具有简化污水处理流程，降低基建运行成本，提高生物脱氮的效果，该不动杆菌在含氮污水处理方面具有很好的应用前景。

优选地，所述不动杆菌的16S rDNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明提供的不动杆菌的16S rDNA基因序列如下所示：

SEQ ID NO.1：

GGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGATTAGCATCCTATCGCTAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGACATTACTCGCTGGCAAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATGTAAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTTACTATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTGTTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCACACTCTAGCTAACCAGTATCGAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATTTGACTTAATTAGCCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCTCTAGGTATTAACTAAAGTAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTACAACCATAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTAGCGCAAGGTCCGAAGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCATTCCTTTCGAAATGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTAA。

该序列长度为1282bp，在GenBank中基因序列的登录号为MK163532。将该菌的基因序列上传至GenBank中进行比对，比对结果表明：该菌的基因序列与Acinetobacter的序列相似性最高。因此，结合细菌的形态特征判断该菌株属于不动杆菌菌(Acinetobacter)，并将其命名为Acinetobacter sp.A3。

具体地，本发明的菌株Acinetobacter sp.A3已于2018年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路，其保藏编号为CGMCC NO.16620。

优选地，所述固定化菌剂采用吸附法将所述不动杆菌的菌悬液中的菌体负载到所述固定化载体上。

本申请采用吸附法直接利用不动杆菌进行负载，免去了复杂的不动杆菌的提取步骤，制作方便，成本低廉。

优选地，所述固定化载体与所述不动杆菌的菌悬液的质量比为4.5-5.5:1.5-2.5。

优选地固定化载体与菌悬液的比例，使得固定化菌剂中不动杆菌的数量适中，若是不动杆菌数太少，影响降解速率；若是不动杆菌数过多，固定化载体对微生物的吸附过饱和，在降解污染物过程中微生物也会脱附进入水体中，然而水体中的微生物生理活性低、稳定性差，因此优选控制固定化载体与菌悬液的比例。

优选地，所述谷糠的吸水率为35-45％。

在质量相同的情况下，吸水率越大的载体能吸附较多的菌悬液；但是若是谷糠的吸水率过高，微生物吸附量过高，固定化菌剂进入水体中也会脱附，造成不动杆菌的浪费，且谷糠与菌悬液难以混合均匀，难以保证谷糠中微生物的分布是否均匀，所以优选谷糠的比例，使得固定化载体对微生物的吸附量适中。

优选地，所述菌悬液为将所述不动杆菌培养至对数生长期的菌悬液，且所述菌悬液的OD600为0.60-0.63。采用紫外分光光度计测定所述菌悬液在600nm波长下的吸光度数值记为OD600。

对数生长期的微生物生长速度最大，细胞数量呈指数递增，选择对数生长期的菌悬液能保证制备的固定化菌剂生长速度高，并具有高的生物活性。

以OD600的数值验证菌悬液中不动杆菌的含量，进而控制菌悬液是否处于对数生长期。

进一步地，本发明还提供所述固定化菌剂的制备方法。该制备方法，至少包括以下步骤：

步骤a、培养所述不动杆菌得到菌悬液；

步骤b、将所述谷糠进行灭菌处理，然后与所述菌悬液在无菌条件下混合均匀，烘干得到所述固定化菌剂。

相对于现有技术，本发明提供的固定化菌剂的制备方法，具有以下优势：

本发明以吸附法将不动杆菌负载到谷糠上，制备方法简单、条件温和，有利于工业发范围推广，且将微生物固定在谷糠内，并利用谷糠的特性，提高固定化菌剂的生物活性和稳定性。

优选地，步骤b中，所述灭菌处理的条件为：灭菌温度为120-125℃，灭菌时间为25-35min。

对所述谷糠进行灭菌，保证后期过程中不引入其他的细菌，进而影响不动杆菌的活性，甚至影响菌剂处理含氮污水的效果。

优选地，步骤b中，所述烘干温度为在30-40℃。

优选的烘干温度能够将固定化菌剂中多余的水分出去，并且不影响不动杆菌的活性。

优选地，步骤b中，所述混合条件为在100-300rpm的条件下搅拌8-12min。

优选的混合条件使得菌悬液和载体充分混匀，直到载体材料湿润、疏松且不结块、不粘壁。

优选地，本发明还提供所述固定化菌剂含氮污水处理领域中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的固定化菌剂的脱氮性能图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

本发明实施例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和谷糠，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16620；所述谷糠的吸水率为40％。

所述谷糠与所述不动杆菌的菌悬液的质量比为5:2，且所述菌悬液中所述不动杆菌处于对数生长期；所述菌悬液的OD600为0.613。

上述固定化菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤a、将所述不动杆菌的菌悬液培养至对数生长期；

步骤b、将所述谷糠在121℃的条件下进行灭菌处理30min，然后与所述菌悬液在无菌条件下以200rpm的速度搅拌10min混合均匀，至谷糠湿润、疏松且不结块、不粘壁，然后在35℃条件下烘干得到所述固定化菌剂。

实施例2

本发明实施例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和谷糠，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16620；所述谷糠的吸水率为45％。

所述谷糠与所述不动杆菌的菌悬液的质量比为4.5:2.5，且所述菌悬液中所述不动杆菌处于对数生长期；所述菌悬液的OD600为0.63。

上述固定化菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤a、将所述不动杆菌的菌悬液培养至对数生长期；

步骤b、将所述谷糠在125℃的条件下进行灭菌处理25min，然后与所述菌悬液在无菌条件下以300rpm的速度搅拌8min混合均匀，至谷糠湿润、疏松且不结块、不粘壁，然后在40℃条件下烘干得到所述固定化菌剂。

实施例3

本发明实施例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和谷糠，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16620；所述谷糠的吸水率为35％。

所述谷糠与所述不动杆菌的菌悬液的质量比为5.5:1.5，且所述菌悬液中所述不动杆菌处于对数生长期；所述菌悬液的OD600为0.605。

上述固定化菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤a、将所述不动杆菌的菌悬液培养至对数生长期；

步骤b、将所述谷糠在120℃的条件下进行灭菌处理35min，然后与所述菌悬液在无菌条件下以100rpm的速度搅拌12min混合均匀，至谷糠湿润、疏松且不结块、不粘壁，然后在30℃条件下烘干得到所述固定化菌剂。

实施例4

本发明实施例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和谷糠，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16620；所述谷糠的吸水率为40％。

所述谷糠与所述不动杆菌的菌悬液的质量比为5:2，且所述菌悬液中所述不动杆菌处于对数生长期；所述菌悬液的OD600为0.153，即将实施例1中的菌悬液稀释至原有OD600的1/4倍。

上述固定化菌剂的制备方法也与实施例1相同，不再赘述。

实施例5

本对比例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和谷糠，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16620；所述谷糠的吸水率为40％。

所述谷糠与所述不动杆菌的菌悬液的质量比为5:2，所述菌悬液的OD600为1.226，即将实施例1中的菌悬液浓缩至原有OD600的2倍。

上述固定化菌剂的制备方法也与实施例1相同，不再赘述。

为了更好的说明本发明的技术方案，下面还通过对比例和本发明的实施例做进一步的对比。

对比例1

本对比例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和沸石，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16620；所述沸石的吸水率为40％。

所述沸石与所述不动杆菌的菌悬液的质量比为5:2，所述菌悬液的OD600为2.453，即将实施例1中的菌悬液浓缩至原有OD600的4倍。

上述固定化菌剂的制备方法也与实施例1相同，不再赘述。

对比例2

本对比例提供一种固定化菌剂，包含不动杆菌和活性炭，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16620；所述活性炭的吸水率为75％。

所述活性炭与所述不动杆菌的菌悬液的质量比为5:2，所述菌悬液的OD600为2.453，即将实施例1中的菌悬液浓缩至原有OD600的4倍。

上述固定化菌剂的制备方法也与实施例1相同，不再赘述。

为了更好的说明本发明实施例提供的固定化菌剂的特性，下面将实施例1-5以及对比例1-2制备的固定化菌剂进行性能测试。

试验例1

采用与菌种培养相同的培养基，分别在7个锥形瓶中分别加入150mL的培养基，在120℃下灭菌30min。然后向锥形瓶中分别加入实施例1-5以及对比例1-2制备的固定化菌剂，菌剂加入量均为干重0.5g，测试对硝氮的降解效果，降解效率如下表1所示，实施例1的降解图如图1所示。

表1降解效率

	硝氮初始浓度	脱氮时间	硝氮去除率
				实施例1	100mg/L	16h	100％
实施例2	100mg/L	16.1h	100％
				实施例3	100mg/L	16.1h	100％
实施例4	100mg/L	18h	100％
				实施例5	100mg/L	14h	100％
对比例1	100mg/L	20h	35％
				对比例2	100mg/L	20h	5％

从表1中可以看出，本发明实施例1-5提供的固定化菌剂能在18h内将浓度为100mg/L的硝氮全部降解，其中，实施例1-3的降解速率较好，16h左右即可全部降解，实施例5的更优，14h即可全部降解。对比例1-2制备的固定化菌剂的降解效果很差，20h内对硝氮去除率仅仅为35％和5％。

从图1中可以看出，实施例1制备的固定化菌剂在好氧条件下在16h内将100mg/L的硝氮全部降解，同时将积累的亚硝氮降解完全，展示出良好的反硝化效果。不同于游离细菌，吸附法制得的固定化菌剂可为微生物提供好氧缺氧的微环境，既利于菌剂的生长又利于菌剂反硝化脱氮性能的发挥，实施例2-5制备的固定化细菌也能在相应时间内完全降解硝氮和亚硝氮。

结合实施例1、实施例4-5可以看出，随着固定化菌剂中不动杆菌的浓度的增加，达到硝氮去除率为100％的脱氮时间缩短。

对比例1-2中，虽然采用的菌悬液的浓度为实施例1中菌悬液浓度的4倍，但是对硝氮去除率远远低于实施例1的，甚至低于实施例4的，即对比例1-2采用4倍的菌悬液浓度的固定化菌剂的降解效果远远低于实施例5采用1/4倍的菌悬液浓度的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。