具体实施方式

1.酶固定化用载体

本实施方式涉及的酶固定化用载体包含：(A)多孔质材料；以及(B)具有氨基的纤维素(以下，有时也称为氨基化纤维素。)。

(A)多孔质材料

多孔质材料是指具有大量微细的空隙的物质，能够将水不溶性的各种各样的多孔质材料用于载体。多孔质材料可以是纤维质，也可以是非纤维质。作为多孔质材料，优选使用水能够浸入内部的多孔质材料，更优选为具有能够使水透过的贯通气孔。

作为纤维质材料(即多孔质的纤维质材料)，例如可举出：滤纸等纸、无纺布、纺织物、针织物、玻璃纤维滤纸等。作为滤纸，可以是包含植物纤维的纤维素滤纸。作为无纺布、纺织物和针织物的材质，例如可举出：聚丙烯纤维、聚酯纤维、聚酰胺纤维、碳纤维等。

作为非纤维质材料(即，多孔质的非纤维质材料)的材质，例如可以是陶瓷、玻璃、金属等无机材料，也可以是热塑性树脂、热固性树脂等有机材料。

(B)氨基化纤维素

作为氨基化纤维素，在具有葡萄糖被β-1,4键连结成的结构的纤维素(更详细而言，为纤维寡糖)中，可使用在其端基异构体位具有包含氨基的取代基的氨基化纤维素。作为氨基，优选为伯氨基。通过具有氨基，从而能够吸附酶并进行固定化。

作为氨基化纤维素，更具体而言，优选使用由下述通式(1)所表示的化合物。

[化1]

(式中，A表示碳原子数1～20的2价的烃基，n为6～16。)

式中的A可以是2价脂肪族烃基，也可以是2价的芳香族烃基。作为2价的脂肪族烃基，例如可举出烷二基、烯二基等，可以是直链，也可以具有支链。作为2价的芳香族烃基，例如可举出具有芳香环的取代基的2价的脂肪族烃基、芳二基等，这些芳香环也可以加成有烷基等取代基。A的碳原子数优选为1～10，更优选为1～5。A优选为碳原子数1～10的烷二基，更优选为碳原子数1～5的烷二基。

式中的n表示纤维素的聚合度，可以是6～16的整数。n优选为7以上，并且优选为15以下。由式(1)表示的氨基化纤维素通常为聚合度不同的化合物的混合物，平均聚合度没有特别限制，例如优选为7以上，可以是8以上，并且例如优选为14以下，也可以是12以下。

在一个实施方式中，作为氨基化纤维素，优选使用由下述式(2)表示的氨基化纤维素。

[化2]

(式中，n与式(1)的n相同。)

本实施方式涉及的氨基化纤维素可以是具有纤维素II型的结晶结构的纤维素结构体。即，在一个实施方式中，氨基化纤维素是含有由式(1)表示的化合物作为结构成分的、具有纤维素II型的结晶结构的纤维素结构体。该纤维素结构体可以具有片状的结构(纤维素纳米片)。来自天然的纤维素链具有平行排列的纤维素I型的结晶结构，而人工合成的氨基化纤维素形成热力学稳定的纤维素II型的结晶结构。此时，纤维素链末端的含氨基取代基(例如，式(2)中的2-氨乙基)不会影响晶型，具有含氨基取代基的纤维素衍生物在纤维素纳米片的膜厚方向上排列而形成片状晶体，氨基在片表面露出。

本实施方式涉及的氨基化纤维素的合成方法没有特别限制。例如，由式(2)表示的氨基化纤维素能够按照下述反应进行制造。

[化3]

该反应是利用了纤维糊精磷酸化酶(CDP)的逆反应的酶合成反应。通过使α-葡萄糖-1-磷酸(αG1P)和2-氨基乙基-β-D-葡糖苷与CDP进行反应，从而αG1P作为单体而依次聚合于作为引物的2-氨基乙基-β-D-葡糖苷，得到由式(2)表示的氨基化纤维素。此外，通过预先替换引物中的端基异构体位的取代基，从而能够合成由式(1)表示的具有各种各样的取代基的氨基化纤维素。

在此，作为2-氨基乙基-β-D-葡糖苷，例如能够参考B.Rao等,Chem.Commun.,2013年,49,10808-10810所记载的方法来进行合成。具体而言，由O-五乙酰基-β-D-葡糖苷和2-溴乙醇合成O-四乙酰基-2-溴乙基-β-D-葡糖苷，由O-五乙酰基-2-溴乙基-β-D-葡糖苷和叠氮化钠合成O-五乙酰基-2-叠氮基乙基-β-D-葡糖苷，利用甲醇钠进行脱乙酰基化，然后将叠氮基还原，由此能够得到2-氨基乙基-β-D-葡糖苷。

对于CDP，已知热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、纤维菌(Cellulomonas)属等微生物所生产，能够利用这些微生物通过公知方法获得。例如，能够按照M.Krishnareddy等,J.Appl.Glycosci.,2002年,49,1-8所记载的方法，通过大肠杆菌表达系统制备来自热纤梭菌YM4的CDP，但不限于此。

CDP的浓度没有特别限制，例如可以是0.1U/ml以上，也可以是0.2U/ml以上。在此，CDP的酶量例如能够基于酶活性来决定。在该情况下，例如，能够对αG1P与D-(+)-纤维二糖和CDP进行培养，对利用CDP生成的磷酸进行定量，能够将每1分钟使1μmol的磷酸游离的酶量作为1U。

例如，将10～1000mM的αG1P、10～200mM的2-氨基乙基-β-D-葡糖苷以及0.1U/mL以上的CDP在100～1000mM的2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)缓冲液(pH 7.0～8.0)中混合，在10～80℃进行30分钟～30天的培养，使其反应，从而能够合成由式(2)的氨基化纤维素。

在本实施方式涉及的酶固定化用载体中，氨基化纤维素被固定化于多孔质材料。详细而言，氨基化纤维素被保持在多孔质材料内，即使用水清洗也不会脱落。如上所述，氨基化纤维素具有氨基从而能够将酶固定化，因此能够经由氨基化纤维素将酶固定化于多孔质材料。

已固定化的氨基化纤维素相对于多孔质材料的比率没有特别限制，例如，相对于多孔质材料100质量份，氨基化纤维素的附着量可以是0.1～30质量份，也可以是1～20质量份。

2.固定化酶

本实施方式涉及的固定化酶包含上述酶固定化用载体和被固定化于氨基化纤维素的酶。即，固定化酶包含：多孔质材料、固定化于上述多孔质材料的氨基化纤维素、以及固定化于上述氨基化纤维素的酶。

上述氨基化纤维素能够将作为蛋白质的酶以维持其活性的方式吸附。详细而言，酶单层吸附于包含氨基化纤维素的纤维素结构体的表面。静电相互作用有助于该吸附。

作为酶，没有特别限制，例如能够使用氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构化酶、连接酶等各种各样的酶。从对氨基化纤维素的吸附性的观点出发，作为酶，优选在比氨基化纤维素具有正电荷的pH更低的pH具有等电点。更纤细而言，作为酶，优选为在中性范围(例如pH 6.5～7.5)带负电的酶，更优选使用等电点为pH 7.0以下的酶。在此，等电点通过等电点电泳进行测定，其中，使用具有pH梯度的凝胶使该酶电泳，将不游动的凝胶部位的pH作为等电点。

已固定化的酶相对于氨基化纤维素的比率没有特别限制，例如，相对于氨基化纤维素100质量份，酶的附着量可以是0.1～20质量份，也可以是1～10质量份。

3.酶固定化用载体的制造方法

本实施方式涉及的酶固定化用载体能够通过如下方式制造：在使上述氨基化纤维素溶解于碱性水溶液而得到的水溶液中，加入酸并在多孔质材料的存在下使氨基化纤维素析出。即，通过在多孔质材料的存在下使氨基化纤维素析出，从而氨基化纤维素被固定化于多孔质材料，因此可得到本实施方式涉及的酶固定化用载体。

作为碱性水溶液，只要能够使氨基化纤维素溶解则没有特别限制，能够使用氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液等。溶解有氨基化纤维素的水溶液(以下，称为纤维素水溶液。)中的氨基化纤维素的浓度没有特别限制。例如，以加入酸并使氨基化纤维素析出时的浓度计，可以是1～10％(w/v)，也可以是1～5％(w/v)。需要说明的是，“％(w/v)”是指溶液100mL中所含的对象成分的质量(g)。

通过在碱性的纤维素水溶液加入酸而使其成为中性乃至酸性，从而使氨基化纤维素成为不溶性而析出。此时，可以一边进行搅拌/振动等一边进行培养，也可以静置(不进行搅拌/振动等而置于静止的状态)并进行培养，也可以通过培养使得氨基化纤维素自组织化。即，氨基化纤维素的分子排列整齐而成为具有纤维素II型的结晶结构的纤维素结构体。需要说明的是，即使进行搅拌/振动，氨基化纤维素也会自组织化，但是，通过静置并进行培养，能够使氨基化纤维素自组织化成更大的聚合体。在此，培养没有特别限制，例如可以在10～80℃进行30分钟～30天。

在上述培养时，通过在多孔质材料的存在下使氨基化纤维素析出，从而氨基化纤维素在多孔质材料中析出，因此成为保持或缠结在多孔质材料的微细空隙内的状态，固定化于多孔质材料。

作为使氨基化纤维素固定化于多孔质材料的具体方法，例如，可以在上述纤维素水溶液中加入酸并进行中和后，立刻使该中和了的纤维素水溶液浸透于多孔质材料，在该状态下进行培养(方法1)，或者，可以在使上述纤维素水溶液浸透于多孔质材料后，在该纤维素水溶液中加入酸并进行中和，然后进行培养(方法2)。在此，作为使纤维素水溶液浸透于多孔质材料的方法，例如，可以在多孔质材料中加入纤维素水溶液并使其浸透，也可以在纤维素水溶液中浸渍多孔质材料。

上述方法1和方法2虽然均是在多孔质材料的存在下使氨基化纤维素析出的方法，但是，方法1中，由于通过预先进行中和从而使氨基化纤维素在部分析出(即自组织化)的状态下浸透于多孔质材料，因此可认为不易浸透于多孔质材料。因此，更优选如方法2所述，在预先使纤维素水溶液浸透于多孔质材料之后加入酸并进行中和。

4.固定化酶的制造方法

本实施方式涉及的固定化酶能够通过以下工序来制造。

(1)纤维素固定化工序，在使上述氨基化纤维素溶解于碱性水溶液而得到的水溶液中，加入酸并在多孔质材料的存在下使氨基化纤维素析出，从而使氨基化纤维素固定化于所述多孔质材料；以及

(2)酶固定化工序，使酶固定化于氨基化纤维素。

纤维素固定化工序和酶固定化工序中，先实施哪个工序都可以。即，可以在使氨基化纤维素固定化于多孔质材料后，使酶固定化于该氨基化纤维素，或者，也可以在使酶固定化于氨基化纤维素之后，使用固定化有该酶的氨基化纤维素使其固定于多孔质材料。由于在纤维素固定化工序中使氨基化纤维素溶解于碱性水溶液，因此担心酶的改性，因此优选前者的方法，即，在使氨基化纤维素固定化于多孔质材料之后，使酶固定化于该氨基化纤维素。

纤维素固定化工序能够与上述的酶固定化用载体的制造方法同样地实施。

酶固定化工序的具体方法没有特别限制。氨基化纤维素能够利用该氨基的存在而使酶吸附并固定化，因此只要使酶与氨基化纤维素接触即可。例如，可以使酶的水溶液浸透于固定化有氨基化纤维素的多孔质材料，在该状态下，例如在10～80℃培养30分钟～30天。作为酶的水溶液，优选使用调节至中性范围的缓冲液。然后，通过用不含酶的水或缓冲液进行清洗，从而得到经由氨基化纤维素使酶固定化于多孔质材料的固定化酶。

5.用途

本实施方式涉及的酶固定化用载体和固定化酶能够用于如下这样的公知的各种各样的用途：利用酶进行物质的检测等的生物传感器；利用酶进行物质的生产等的生物反应器等。

另外，如果是本实施方式涉及的酶固定化用载体，则能够通过使酶的水溶液浸透这样的简单操作来将酶固定，因此使用者能够简单地将各种酶固定化而制作与目的相应的固定化酶。

实施例

以下，基于实施例进一步进行说明，但本发明不限定于此。

1.试剂

4N氢氧化钠水溶液、6N盐酸、氯化镁六水合物、2-巯基乙醇从NACALAI TESQUE购入。αGDP二钠水合物、β-半乳糖苷酶(β-Gal、等电点：pH 4.6)、p-硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)、磷酸二氢钠二水合物从和光纯药工业购入。滤纸(Whatman、等级1、圆型、直径10mm)从GE healthcare购入。超纯水由Milli-Q系统(Milli-Q Advantage A-10，MerckMillipore)供给。其他从NACALAI TESQUE购入特级以上的试剂并使用。

2.实验方法

(1)纤维素和氨基化纤维素的制备

按照T.Serizawa等,Polym.J.,2016年,48,539-544所记载的方法，合成平均聚合度为10的纤维素(下述式(3))。另外，按照下述方法，合成平均聚合度为10的氨基化纤维素(下述式(4))。

[化4]

氨基化纤维素的合成方法：

2-氨基乙基-β-D-葡糖苷基于B.Rao等,Chem.Commun.,2013年,49,10808-10810所记载的方法进行制备。关于CDP，基于M.Krishnareddy等,J.Appl.Glycosci.,2002年,49,1-8所记载的方法进行制备。

将200mM的αG1P、50mM的2-氨基乙基-β-D-葡糖苷和0.2U/mL的CDP在500mM的HEPES缓冲液(pH7.5)中混合，在60℃进行3天培养。通过对包含沉淀的生成物的反应液进行离心(15000rpm、10分钟以上、4℃)，去除上清液后，加入超纯水并使生成物再分散，反复进行离心(同条件)的操作，由此纯化至上清液的置换率成为99.999％以上，得到氨基化纤维素。

生成物的平均聚合度利用质子核磁共振(NMR)装置进行测定。通过使冻干的15mg以上的生成物溶解于500μL的4％重氢氧化钠重水溶液，从而制备试样。NMR装置使用AVANCEIII HD500(Bruker Biospin、磁场强度：500MHz、累计次数16次)。基于氨基化纤维素的纤维素部位中的还原末端的端基异构体位(δ～4.2)以及除此以外的端基异构体位(δ～4.3)的质子的积分值，计算平均聚合度。

(2)滤纸/纤维素复合体以及滤纸/氨基化纤维素复合体的制备

在1.7mL管中在冻干的规定量的纤维素或氨基化纤维素中加入1N氢氧化钠水溶液并使其分散。将其在-20℃培养30分钟，在使溶液恢复至室温后进行移液并使其溶解，分别制备2％(w/v)、4％(w/v)、6％(w/v)的纤维素水溶液以及6％(w/v)的氨基化纤维素水溶液。

纤维素或氨基化纤维素对作为多孔质材料的滤纸的固定化(即，滤纸与纤维素或氨基化纤维素的复合化)使用2种方式的复合化方法来实施。

在第一个复合化方法(方法1)中，在1.7mL管中通过移液对纤维素或氨基化纤维素的水溶液15μL与1N盐酸15μL进行混合后，立刻使其含浸在置于24孔板的滤纸中，在25℃静置1小时。将使用2％(w/v)的纤维素水溶液复合化得到的复合体(纤维素的最终浓度：1％(w/v))作为比较例1，将使用4％(w/v)的纤维素水溶液复合化得到的复合体(纤维素的最终浓度：2％(w/v))作为比较例3，将使用6％(w/v)的纤维素水溶液复合化得到的复合体(纤维素的最终浓度：3％(w/v))作为比较例5。并且，将使用6％(w/v)的氨基化纤维素水溶液复合化得到的复合体(氨基化纤维素的最终浓度：3％(w/v))作为实施例1。

在另一个复合化方法(方法2)中，在使纤维素或氨基化纤维素的水溶液15μL含浸于滤纸后，使1N盐酸15μL含浸于滤纸，在25℃静置1小时。将使用2％(w/v)的纤维素水溶液复合化得到的复合体(纤维素的最终浓度：1％(w/v))作为比较例2，将使用4％(w/v)的纤维素水溶液复合化得到的复合体(纤维素的最终浓度：2％(w/v))作为比较例4，将使用6％(w/v)的纤维素水溶液复合化得到的复合体(纤维素的最终浓度：3％(w/v))作为比较例6。并且，将使用6％(w/v)的氨基化纤维素水溶液复合化得到的复合体(氨基化纤维素的最终浓度：3％(w/v))作为实施例2。

(3)滤纸/纤维素复合体以及滤纸/氨基化纤维素复合体的稳定性评价

通过分别在24孔板内用超纯水3mL进行10次移液，由此对用方法1和2制备的实施例1、2的滤纸/氨基化纤维素复合体以及比较例1～6的滤纸/纤维素复合体进行清洗。利用紫外可见分光光度仪(V-670、日本分光)测定清洗液的紫外可见吸收光谱。测定条件设为：测定波长：200-800nm，操作速度：400nm/min，带宽：0.5nm，数据捕获间隔：0.5nm，响应：Fast。

此时，在2％、4％、6％(w/v)的纤维素水溶液和6％(w/v)的氨基化纤维素水溶液各15μL中分别添加1N盐酸15μL，对于使得到的生成物分散在3mL的超纯水的试样(对照分散液)，也同样进行测定。

根据500nm的吸光度，计算向纤维素或氨基化纤维素的滤纸的担载率(担载率(％)＝100-100×清洗液的吸光度/对照分散液的吸光度)。实验均进行3次，计算3次的平均值。

(4)担载在滤纸内的纤维素和氨基化纤维素的结晶结构分析

对于利用方法2制备的比较例6的滤纸/纤维素复合体以及实施例2的滤纸/氨基化纤维素复合体，分别利用全反射红外分光光度仪(FT/IR-4100typeA、日本分光)测定红外吸收光谱，评价担载在滤纸内的纤维素和氨基化纤维素的结晶结构。对于利用酶反应预先制备的纤维素或氨基化纤维素的结晶化物(对照试样)以及仅仅是未处理的滤纸也同样地进行测定。测定条件设为，测定波长：350-7800cm^-1，分辨率：2cm^-1，累计次数：100。

(5)酶(β-Gal)对滤纸/纤维素复合体以及滤纸/氨基化纤维素复合体的固定化以及其活性测定

在24孔板的孔中添加β-Gal水溶液500μL(10nMβ-Gal、50mM磷酸缓冲液、1mM氯化镁(pH 7.3))后，使样本在25℃浸渍30分钟。然后，向添加有清洗液1mL(50mM磷酸缓冲液、1mM氯化镁(pH 7.3))的24孔板中，移送已将β-Gal固定化的样本，静置15分钟。通过将其反复5次，清洗样本。作为样本，使用比较例6的滤纸/纤维素复合体、实施例2的滤纸/氨基化纤维素复合体、仅仅是滤纸(用30μL的超纯水润湿了的滤纸)。

在24孔板的孔中添加了作为β-Gal基质的PNPG的水溶液500μL(1mM PNPG、86mM磷酸缓冲液(pH 7.3)、116mM 2-巯基乙醇、1mM氯化镁)后，将固定化有β-Gal的样本在25℃浸渍30分钟，使其反应。利用紫外可见分光光度仪(V-670、日本分光)测定反应液的吸光度。测定条件设为：测定波长：200-800nm，操作速度：400nm/min，带宽：0.5nm，数据捕获间隔：0.5nm，响应：Fast。实验均进行3次，求出3次的平均值。

3.结果和讨论

在图1中示出上述稳定性评价中的复合体清洗液的紫外可见吸收光谱，在下述表1中示出由此得到的担载率。关于复合化方法，与方法1相比，方法2的担载率更高，方法2的担载率不论条件如何均为97％以上的值。在方法1中，由于使纤维素或氨基化纤维素预先部分地自组织化，因此在溶液内生成的自组织化物不易浸透到滤纸内，可认为会从滤纸上被清洗除去。与此相对，在方法2中，由于使纤维素或氨基化纤维素从最初起在滤纸内自组织化，因此自组织化物与滤纸的网眼物理缠结，可认为不易被清洗除去。如上所述，可知为了将纤维素或氨基化纤维素稳定地担载在滤纸内，从最初起使它们在滤纸内自组织化的方法(方法2)是有效的。但是，就氨基化纤维素而言，在方法1中70％以上被固定化。因此，作为使氨基化纤维素固定化的酶固定化用载体的制造方法，不仅确认了实施例2的方法2的有用性，而且也确认了实施例1的方法1的有用性。

[表1]

在图2中示出实施例2的滤纸/氨基化纤维素复合体以及比较例6的滤纸/纤维素复合体的红外吸收光谱。在3443cm^-1和3491cm^-1附近观察到表示纤维素II型结晶存在的两个峰。由于仅仅是滤纸观察不到这些峰，因此可知在滤纸内自组织化的纤维素或氨基化纤维素与利用酶反应预先制备的对照试样同样地具有纤维素II型的结晶结构。

在图3中示出酶活性测定中的反应液的紫外可见吸收光谱。在使β-Gal固定化于滤纸/氨基化纤维素复合体而得到的实施例2中，由于在400nm附近观察到来自在利用β-Gal使PNPG水解时生成的对硝基苯酚的吸收，因此可知经由氨基化纤维素而固定化于滤纸的β-Gal具有酶活性。比较405nm的吸光度，结果如图4所示，与将β-Gal固定化于滤纸/纤维素复合体的比较例6相比，在将β-Gal固定化于滤纸/氨基化纤维素复合体的实施例2中，表现出13.5倍的酶活性。另外，与将β-Gal固定化于仅仅滤纸的情况相比，实施例2的酶活性也表现出4.9倍的活性。如上所述，可知当使用担载有氨基化纤维素的滤纸时，可得到高效地将β-Gal固定的固定化酶，并且能够发挥酶活性。

以上，说明了本发明的若干实施方式，但这些实施方式仅作为例示，并非意图限制发明的范

围。这些实施方式能够以其他各种方式实施，在不脱离发明的主旨的范围内能够进行各种省略、替换和变更。这些实施方式或其省略、替换、变更等不仅包含在发明的范围、主旨中，同样也包含在权利要求书所记载的发明以及与其等同的范围中。