一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型及其构建方法和应用 (In-vitro cell model for simulating proliferation after glioma radiotherapy and construction method and application thereof ) 是由 冯骁 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药生物技术领域,公开了一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型。该细胞模型由标记胶质瘤细胞与放疗照射后的胶质瘤细胞共培养而成,所述标记胶质瘤细胞为荧光素酶和绿色荧光蛋白共同标记的人胶质瘤细胞。该细胞模型制备方法为将放疗照射后的胶质瘤细胞接种至培养基中,37℃培养12-48h,再向培养基中接种荧光素酶和绿色荧光蛋白共同标记的胶质瘤细胞,进行共培养。该细胞模型可用于模拟放疗后胶质瘤再增殖的过程；此外,在此模型中加入某些化合物或者药物,探究这些物质对于胶质瘤放疗后再增殖是否存在抑制作用。因此,此模型可用于筛选抑制胶质瘤放疗后再增殖的潜在药物。(The invention belongs to the technical field of medical biology, and discloses an in vitro cell model for simulating proliferation after glioma radiotherapy. The cell model is formed by co-culturing marked glioma cells and glioma cells irradiated by radiotherapy, wherein the marked glioma cells are human glioma cells marked by luciferase and green fluorescent protein together. The preparation method of the cell model comprises the steps of inoculating glioma cells irradiated by radiotherapy into a culture medium, culturing at 37 ℃ for 12-48h, inoculating glioma cells jointly marked by luciferase and green fluorescent protein into the culture medium, and performing co-culture. The cell model can be used for simulating the process of glioma re-proliferation after radiotherapy; in addition, certain compounds or drugs were added to this model to investigate whether these substances had inhibitory effects on repopulation following radiation therapy of glioma. Therefore, the model can be used for screening potential drugs for inhibiting the re-proliferation of glioma after radiotherapy.)
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型及其构建方法和应用。
背景技术
胶质瘤是指起源于中枢神经系统胶质细胞的恶性肿瘤，占原发性颅内恶性肿瘤的80%左右。基于组织学类型，胶质瘤包含星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜细胞瘤、混合细胞类型以及其它类型。世界卫生组织（WHO）中枢神经系统肿瘤分类系统把胶质瘤分为I-IV级，I、II级为低级别胶质瘤，III、IV级为高级别胶质瘤。不同类型和级别的胶质瘤有着不同的生物学特征、临床特点以及预后情况。
胶质母细胞瘤是最常见的原发性脑恶性肿瘤，约占50%。胶质母细胞瘤是恶性程度最高的胶质瘤，WHO分级为IV级。目前针对胶质母细胞瘤的基本治疗策略为最大限度的手术切除、术后同步放化疗以及序贯化疗。尽管针对胶质母细胞瘤已经形成了以手术、放疗、化疗为基础的综合治疗模式，然而其临床预后仍然极其不理想，一年生存率不到40%，五年生存率约为5%。胶质母细胞瘤在经过初始一线治疗后几乎无法避免复发，这是其不良预后的重要原因。
胶质瘤放疗后再增殖是指在放疗中幸存的胶质瘤细胞于放疗间歇期或者放疗结束后以更快的速度加速增殖，最终导致肿瘤复燃的生物学过程。探索胶质瘤放疗后再增殖的机制有利于揭示胶质瘤放疗后复发的重要分子机制，还可为研发能够抑制胶质瘤放疗后再增殖的相关药物提供更多有效靶点。
建立模拟性强、条件可控、重复性好、便于操作的模拟胶质瘤放疗后再增殖体外细胞模型不仅可为探索其机制提供研究工具，还可为筛选能够抑制胶质瘤放疗后再增殖药物提供筛选模型。然而经过充分的文献检索和挖掘，目前国内外尚缺乏合适的细胞模型。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一旨在提供一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型，本发明的目的之二旨在提供一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型的构建方法，本发明的目的之三在于提供一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型的应用。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型，所述体外细胞模型由标记胶质瘤细胞与放疗照射后的胶质瘤细胞共培养而成，所述标记胶质瘤细胞为荧光素酶和绿色荧光蛋白共同标记的人胶质瘤细胞。
根据上述的模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型，优选地，所述胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞系U87-MG（简写U87）。
根据上述的模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型，优选地，所述放疗照射为X射线照射，所述放疗照射剂量为10Gy。更加优选地，所述放疗照射为使用医用直线加速器产生的X射线照射进行照射。
根据上述的模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型，优选地，所述荧光素酶为萤火虫荧光素酶。
本发明第二方面提供了一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型的构建方法，该方法具体为：将放疗照射后的胶质瘤细胞接种至培养基中，37℃培养12-48h，然后再向培养基中接种标记胶质瘤细胞，进行共培养，共培养结束得到模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型。
根据上述的构建方法，优选地，所述放疗照射后的胶质瘤细胞的接种量与标记胶质瘤细胞接种量之比为150:1。
根据上述的构建方法，优选地，所述培养基为2%胎牛血清培养基。
根据上述的构建方法，优选地，共培养温度为37℃，共培养时间为10-14天。
根据上述的构建方法，优选地，所述胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞系U87-MG。
根据上述的构建方法，优选地，所述标记胶质瘤细胞为荧光素酶和绿色荧光蛋白共同标记的人胶质瘤细胞。
根据上述的构建方法，优选地，所述放疗照射为X射线照射，所述放疗照射剂量为10Gy。更加优选地，所述放疗照射为使用医用直线加速器产生的X射线照射进行照射。
本发明第三方面提供了一种上述第一方面所述的模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型在筛选抑制胶质瘤放疗后再增殖的药物中的应用。
具体来讲，在此模型中加入某些化合物或者药物，进而探究这些物质是否对胶质瘤放疗后再增殖存在抑制作用，从而筛选可抑制胶质瘤放疗后再增殖的具有潜在临床价值的药物。
本发明中应用一种靶向环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）的小分子抑制剂NS-398，说明如何应用此体外细胞模型筛选可抑制胶质瘤放疗后再增殖的具有潜在临床价值的药物。具体方法为：将放疗照射后的胶质瘤细胞接种至24孔细胞培养板中，37℃培养24小时，再向细胞培养板中接种标记后的胶质瘤细胞（标记后的胶质瘤细胞为荧光素酶和绿色荧光蛋白共同标记的胶质瘤细胞），同时向培养孔中加入NS-398，进行10-14天共培养，共培养结束时使用细胞活体成像技术来检测标记后胶质瘤细胞增殖情况。同时设置加入NS-398的对照剂（对照剂为甲基亚砜，二甲基亚砜为溶解NS-398的溶剂）的对照实验。通过统计分析NS-398组和对照剂组之间荧光素酶活性差异，进而判断NS-398是否能够抑制胶质瘤放疗后再增殖的能力。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
（1）本发明建立了一种模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型，该细胞模型由标记胶质瘤细胞与放疗照射后的胶质瘤细胞直接共培养而建立，该细胞模型既能够体现放疗后胶质瘤细胞与未放疗的标记胶质瘤细胞的直接作用，也能够体现放疗后胶质瘤细胞通过分泌可溶性促生长物质对标记胶质瘤细胞的间接作用。利用本发明建立的体外细胞模型可观察到，与未经放疗的胶质瘤细胞相比较，经过放疗后的胶质瘤细胞促进标记胶质瘤细胞以更快的速度增殖。因此，在此模型中加入某些化合物或者药物，进而探究这些化合物或者药物是否对胶质瘤放疗后再增殖存在抑制作用，从而实现筛选可抑制胶质瘤放疗后再增殖的潜在药物。
（2）本发明中标记胶质瘤细胞采用萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白共同标记，在标记胶质瘤细胞中加入发光底物后，荧光素酶可催化发光底物发生变化，产生生物化学发光，后续通过细胞活体成像仪可有效评估荧光素酶活性强弱，而荧光素酶活性与细胞数量之间呈现正相关关系。因此，本发明通过细胞活体成像仪检测荧光素酶活性即可获知标记胶质瘤细胞的增殖情况，检测快速便捷，同时不会对细胞造成损伤。
附图说明
图1为pLEX-GFP-luc2质粒的图谱示意图；
图2为稳定转染萤火虫荧光素酶（Fluc）和绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的U87（即U87-Fluc）模式图；
图3为U87-Fluc中荧光素酶活性与细胞数量之间的正向相关关系图；
图4为放疗照射后的胶质瘤细胞系U87与U87-Fluc体外培养模型模式图；
图5为模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型中放疗后U87细胞对U87-Fluc促增殖效果结果图；
图6为在模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型中加入10 μM COX-2抑制剂NS-398时，放疗后U87细胞对U87-Fluc促增殖效果结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本说明书中，术语“U87”代表“人胶质瘤细胞系U87-MG”，是一种可用于体外培养的人胶质瘤母细胞瘤细胞系。
本说明书中，术语“Fluc”代表“萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Fluc）”。
本说明书中，术语“GFP”代表“绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）”。
本说明书中，术语“U87-Fluc”代表“稳定表达Fluc和GFP融合蛋白的U87细胞”。
实施例1：构建稳定表达Fluc和GFP融合蛋白的U87细胞（U87-Fluc）
1、慢病毒包装
慢病毒包装的具体操作如下：
1）待培养于10 cm细胞培养皿中的293T细胞汇合度达到60-70%时，开始进行操作。
2）在2 ml Opti-MEM培养基中加入3.3 μg pLEX-GFP-luc2（其质粒图谱示意图如图1所示）、3 μg psPAX2、1.2 μg pMD2.G，充分混合；在另外2ml Opti-MEM培养基中加入50μlLipofectamine 2000，充分混合。使两种混合液室温静置5分钟。
3）约5分钟后，将两种混合液充分混合，室温静置20分钟。
4）约20分钟后，吸除293T细胞培养基，将上一步骤中混合液缓慢加入293T细胞培养皿中。轻轻晃动培养皿，使液体充分覆盖细胞表面。
5）继续培养293T细胞6小时后，吸除覆盖细胞表面液体，并加入10%胎牛血清培养基（不含双抗），继续培养。
6）48小时之后，在荧光显微镜下观察293T细胞中GFP表达情况。如果GFP表达情况良好，基本说明293T细胞中慢病毒包装成功。收集富含慢病毒颗粒的293T细胞培养上清液，4℃、3000 rpm离心20分钟，并通过0.22 μm滤器过滤。将处理后的富含慢病毒颗粒的上清液分装至1.5 ml EP管中，每管1 ml，置于-80℃冰箱中保存待用。
2、慢病毒感染U87细胞及U87-Fluc细胞的筛选与构建
具体操作步骤如下：
1）将目的细胞（U87细胞）铺于6孔板中，铺入细胞数量以过夜后汇合度达到50%为宜。
2）从-80℃冰箱中取出1ml病毒液置于冰上，使其自然融化。
3）将1ml病毒液、1ml 10%胎牛血清培养基（不含双抗）、2μlpolybrene充分混合，得到混合液。
4）吸除6孔板中细胞培养基，加入上一步骤中混合液，继续培养细胞。
5）24小时后，在荧光显微镜下观察目的细胞中GFP表达情况。如果GFP阳性细胞比例较高，则更换6孔板中培养基为10%胎牛血清培养基。如果GFP阳性细胞比例较低（不足10%），则继续培养24小时后再更换培养基。
6）6孔板中目的细胞汇合度达到100%后，将其中细胞传代至10 cm细胞培养皿中进行培养。待10 cm皿中目的细胞汇合度达到50%后，开始使用嘌呤霉素浓度为1 μg/ml的培养基进行细胞培养。稳定转染pLEX-GFP-luc2的U87细胞会存活下来，其余细胞则会被杀死。
7）经过一段时间（10-20 天）嘌呤霉素筛选培养后（最终嘌呤霉素浓度可提高至3-4μg/ml），即可获得稳定转染pLEX-GFP-luc2 的U87细胞。
按照上述操作步骤，成功构建稳定表达萤火虫荧光素酶（Fluc）和绿色荧光蛋白（GFP）的U87细胞，将其命名为U87-Fluc细胞。U87-Fluc细胞模式图如图2所示。U87-Fluc细胞中荧光素酶的作用为：在U87-Fluc细胞中加入发光底物后，萤火虫荧光素酶可催化发光底物发生变化，产生生物化学发光，可以通过细胞活体成像仪检测生物化学发光来高效评估荧光素酶活性。
实施例2：U87-Fluc细胞荧光素酶活性与细胞数量的相关性探讨
在后续的体外共培养模型中，希望通过检测U87-Fluc萤火虫荧光素酶活性强弱来反应U87-Fluc增殖情况。所以，有必要证实U87-Fluc中萤火虫荧光素酶活性与细胞数量之间是否呈现正性相关关系。在96孔板中铺入指定数目的U87-Fluc，待细胞贴壁后，借助细胞活体生物化学发光成像仪检测96孔板中U87-Fluc的荧光素酶活性。
具体实验操作如下：
将生长状态良好的U87-Fluc细胞消化，制备单细胞悬液。分别按每孔100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000个细胞，将U87-Fluc铺于96孔板之中。待细胞充分贴壁后即可使用细胞活体成像仪对96孔板进行细胞成像，检测96孔板中U87-Fluc细胞的荧光素酶活性。
采用细胞活体成像仪进行细胞成像的具体操作为：弃掉待成像的细胞培养板中的培养液，加入适量体积（96孔板：80 μl/孔、24孔板：150 μl/孔）终浓度为0.15 mg/ml D-luciferin potassium。然后使用细胞活体成像仪进行U87-Fluc细胞生物化学发光活体成像，完成图像采集，并使用配套软件进行数据分析。
数据分析具体操作为：数据均以均数±标准误（Mean ± SEM）的形式呈现。我们使用统计学软件SPSS 20.0（IBM，USA）进行统计学分析。在参数检验中，对于多组独立数据两两比较，我们采用单因素方差分析（One-way ANOVA，One-way analysis of variance）和最小显著性差异法（least significant difference，LSD）。P值小于0.05被认为有统计学意义上的差异。
根据荧光素酶活性与细胞数量制作曲线，其结果如图3所示。
由图3可知，U87-Fluc细胞中荧光素酶活性与细胞数量表现出紧密的正向相关关系，R2为0.9864。因此，在后续的体外共培养模型中，可以通过检测U87-Fluc细胞荧光素酶活性强弱来反应其体外增殖情况。
实施例3：模拟胶质瘤放疗后再增殖过程的体外细胞模型构建
1、利用医用直线加速器放疗胶质瘤细胞U87
具体操作步骤如下：
1）细胞准备：可对生长于各种规格细胞培养皿中的U87细胞进行X射线照射。
2）将待照射的细胞放置在一块15 cm厚的透明有机玻璃上，细胞培养皿上方覆盖一块薄的透明塑料板，用来限定照射视野；照射使用的是产生X射线的医用直线加速器，其放射剂量率为3.6 Gy/分钟。
2、模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型的构建
本发明将U87-Fluc细胞与经医用直线加速器放疗后U87细胞进行共培养，得到模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型（体外细胞模型的模式图如图4所示）。
模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型的构建方法如下：
1）将利用医用直线加速器放疗后的U87细胞于当天消化，然后按一定数目（1.5×104/孔）接种至24孔板之中，采用2%胎牛血清培养基进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h。
2）然后将U87-Fluc细胞按一定数目（100个/孔）接种至含有步骤1）培养的放疗照射后U87细胞的培养孔中，采用2%胎牛血清培养基37℃进行培养，即得模拟胶质瘤放疗后肿瘤细胞再增殖的体外细胞模型。
按照上述共培养细胞模型构建方法，构建未经放疗的U87细胞（即0 Gy U87细胞）与U87-Fluc细胞的共培养体系；同时设置一组为只铺入U87-Fluc细胞（U87-Fluc细胞单独培养体系），作为阴性对照。
分别对模拟胶质瘤放疗后肿瘤细胞再增殖的体外细胞模型、未经放疗的U87细胞与U87-Fluc细胞的共培养体系和U87-Fluc细胞单独培养体系进行培养，每2天更换一次2%胎牛血清培养基，经过12天的培养后，利用细胞活体成像仪对24孔板进行细胞成像，检测U87-Fluc细胞的荧光素酶活性，反应U87-Fluc细胞的再增殖情况。采用细胞活体成像仪对构建的体外细胞模型进行细胞成像以及数据分析处理的具体操作与实施2相同，具体不再赘述。具体实验结果如图5所示。
由图5可知，与U87-Fluc细胞单独培养组相比较，经10Gy放疗后的U87细胞（即10Gy U87细胞）可显著刺激U87-Fluc细胞增殖；与未放疗U87细胞（即0 Gy U87细胞）相比，经10Gy放疗后的U87细胞可显著刺激U87-Fluc细胞增殖。具体来说，10 Gy U87细胞+U87-Fluc细胞共培养组的生物化学发光信号值约为U87-Fluc细胞单独培养组、0 Gy U87细胞+U87-Fluc细胞共培养组的3.5倍和5.8倍以上。
实施例4：本发明构建的体外细胞模型在筛选抑制胶质瘤放疗后再增殖的药物中的应用
本发明构建的模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型可应用于筛选抑制胶质瘤放疗后再增殖潜在药物。NS-398是一种特异性环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂。本发明中应用NS-398来说明实施例3构建的体外细胞模型如何应用于筛选抑制胶质瘤放疗后再增殖的药物。具体操作步骤如下：
1）经10 Gy放疗照射后的胶质瘤细胞系U87（即10 Gy U87细胞）按1.5×104/孔数量接种于24孔细胞培养板中，采用2%胎牛血清培养基进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h。
2）培养24小时后，向已接种放疗照射后U87细胞的培养孔中接种U87-Fluc细胞（接种量为100个/孔）；然后将接种过U87-Fluc细胞的培养孔划分为两组，一组向培养孔中加入NS-398（使得培养基中NS-398的浓度为10 μM），另一组向培养孔中加入NS-398的对照剂DMSO（DMSO即二甲基亚砜，为溶解NS-398的溶剂）；采用2%胎牛血清培养基在37℃进行培养，每2天更换一次2%胎牛血清培养基，12天后共培养结束。
同时，为了进行对比，设置至含只含有U87-Fluc细胞的对照实验，对照实验的具体操作步骤为：将U87-Fluc细胞按100个/孔接种于24孔细胞培养板中，采用2%胎牛血清培养基在37℃培养24h，然后经接种U87-Fluc细胞的培养孔划分为两组，一组向培养孔中加入NS-398（使得培养基中NS-398的浓度为10 μM），另一组向培养孔中加入NS-398的对照剂DMSO；采用2%胎牛血清培养基在37℃进行培养，每2天更换一次2%胎牛血清培养基，12天后共培养结束。
培养结束后通过细胞活体成像仪检测上述细胞培养板各体系中U87-Fluc荧光素酶活性。结果如图6示。
由图6可知，U87-Fluc 细胞单独培养体系中加入10 μM NS-398后，并没有明显抑制U87-Fluc细胞自身增殖能力；而在10 Gy放疗照射 U87细胞（记作10 Gy U87）+U87-Fluc细胞共培养体系中加入10 μM NS-398，明显抑制了该体系中U87-Fluc细胞的增殖。由此说明，NS-398对于U87-Fluc细胞本身没有抑制作用，而是通过抑制放疗后U87细胞与U87-Fluc细胞相互作用来实现抑制U87-Fluc细胞增殖的效果。NS-398或可作为一种抑制胶质瘤放疗后再增殖的未来潜在药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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