阅读说明：本技术 一种扶正解毒复合制剂及其制备方法和应用 (Compound preparation for strengthening body resistance and detoxifying, and preparation method and application thereof ) 是由 张世新 万宗敏 陈波 贾付从 于 2018-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种扶正解毒复合制剂及其制备方法和应用,制备方法包括：S1：将乳酸菌、芽孢杆菌和将黑曲霉分别进行扩大培养,将扩大后的菌液按体积比乳酸菌菌液：芽孢杆菌菌液：黑曲霉菌液为1-4：2-4：1-3混合制得复合菌液；S2：按重量份数,取黄芪2-6份,板蓝根2-6份,淫羊藿2-4份,混合后于110-130℃下灭菌；S3：将复合菌液与灭菌后的中草药混合物按液固重量份比15-30：1混合后密闭发酵72-96h；S4：向发酵混合物中继续混入混合物总质量0.1-1.0%的促纤维素分解酶和混合物总质量0.1-1.0%的溶葡萄球菌酶,4-8h后,进行CO<Sub>2</Sub>超临界萃取,萃取物经冷冻干燥制得的成品改善了有效成分,提高禽畜机体免疫力。(The invention discloses a compound preparation for strengthening body resistance and detoxifying, a preparation method and application thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: s1: respectively carrying out amplification culture on lactobacillus and bacillus and aspergillus niger, and carrying out volume ratio on the amplified bacterium liquid of the lactobacillus bacterium liquid: and (3) bacillus liquid: the aspergillus niger bacterial liquid is 1-4: 2-4: 1-3, mixing to obtain a compound bacterial liquid; s2: mixing 2-6 parts of astragalus, 2-6 parts of isatis root and 2-4 parts of epimedium according to parts by weight, and sterilizing at the temperature of 110-; s3: mixing the compound bacterial liquid and the sterilized Chinese herbal medicine mixture according to the weight ratio of liquid to solid of 15-30: 1, mixing and then fermenting in a closed manner for 72-96 h; s4: continuously mixing 0.1-1.0% of cellulolytic enzyme and 0.1-1.0% of lysostaphin into the fermented mixture, and performing CO treatment for 4-8 hr 2 The effective components of the finished product prepared by supercritical extraction and freeze drying of the extract are improved, and the organism immunity of the livestock is improved.)

一种扶正解毒复合制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及家畜特别是猪规模化养殖技术领域，特别涉及一种扶正解毒复合制剂及其制备方法和应用。

背景技术

畜禽和水产养殖过程中，长期广泛应激因素容易造成免疫机能受到抑制。以猪为例，此时，多种致病性因素如病毒、细菌、原虫，会侵袭破坏猪体生理、免疫系统功能，器官组织代谢产生的自由基和乳酸、酮酸、尿酸等酸性物质导致猪体液长期偏酸(PH在7.31-7.36之间)，此时猪只血液粘度高，流动性低，细胞的作用就会变弱；血红细胞携氧和养份能力降低，酶促反应效率下降，新陈代谢就会减慢，导致生理机能衰退、免疫系统功能低下，特别是不能很好地吸收营养。久之会引发各种各样久治不愈的慢性疾病。

而且，随着我国养殖业的发展，已由粗放型家庭饲养逐步转变为专业化、集约化、高密度饲养，养猪水平得到明显提高。猪只在生长过程中，不断长期超量添加抗生素导致慢性中毒、耐药性增加、抵抗力下降。养殖各环节诸如频繁合群转群、频繁换料换人，再如养殖环境空气污浊、饮水污染、病原微生物超标等，这些病原及毒素在动物机体内首先损害动物的消化道，引起消化道炎症或溃疡，表现为呕吐、便秘、腹泻等消化障碍，其次损害呼吸道黏膜完整性，破坏呼吸道黏膜免疫屏障，表现为呼吸道综合征。

再者，在目前养殖模式下，长期多打乱打疫苗影响猪正常的免疫应答，导致免疫干扰、免疫耐受和免疫失败。饲料重金属、霉菌毒素超标、繁殖激素长期滥用，导致母猪体能下降、抵抗力低、宫缩无力；仔母猪外阴潮红肿大，呕吐，厌食，拉稀；经产母猪不发情，假发情，流产死胎，***不足、产程过长或屡配***。而在屡配***的淘汰母猪中，80％以上是由此原因引起的动物机体免疫力下降，畜禽产品品质下降，细菌耐药性增强等问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种扶正解毒复合制剂，改善了扶正解毒复合制剂的有效成分，提高禽畜的机体免疫力。

一种扶正解毒复合制剂的制备方法，包括有以下步骤：

S1：将乳酸菌、芽孢杆菌和将黑曲霉分别进行扩大培养，然后，将扩大后的菌液按体积比乳酸菌菌液：芽孢杆菌菌液：黑曲霉菌液的比例为1-4：2-4：1-3混合，制得复合菌液；

S2：按重量份数，取黄芪2-6份，板蓝根2-6份，淫羊藿2-4份，混合后于110-130℃下灭菌；

S3：将复合菌液与灭菌后的中草药混合物按液固重量份比15-30：1混合均匀，密闭发酵72-96h；

S4：向发酵混合物中继续混入用量为混合物总质量0.1-1.0％的促纤维素分解酶和用量为混合物总质量0.1-1.0％的溶葡萄球菌酶，4-8h后，进行CO₂超临界萃取，萃取物经冷冻干燥制得成品。

通过采用上述方案，在发酵之前，对中草药进行高温灭菌处理，避免杂菌对发酵过程的影响。发酵时，选取乳酸、菌芽孢杆菌和黑曲霉作为发酵菌种，含有针对植物学原料的几乎全套的分解酶，是自然界分解能力最强大的微生物，通过微生物强大的生物转化功能，降低中草药的毒性，酶解天然植物细胞，使草药中的有效成分充分游离释放并富集。发酵之后，加入的促纤维素分解酶和溶葡萄球菌酶能够选择性地将中草药中的天然大分子、植物多肽等降解成易被机体吸收利用的小分子物质如多种苷类、生物碱、多糖、有机糖、挥发油等免疫活性物质。CO₂超临界萃取工艺，提取温度低，能够尽可能的减小对中草药有效成分的破坏。制得的成品中包含多种免疫活性物质，能对机体的神经、体液和细胞分子进行全方位的调节，活化机体的细胞和体液免疫系统，提高禽畜机体的抗病能力，清热解毒、扶正祛邪。

较佳的，步骤S1中黑曲霉的扩大培养为：将黑曲霉用质量百分比8-12％麦鼓浸出物和质量百分比5-10％的脱脂大豆粉组成的培养液进行扩大培养，pH6.5-6.8，连续发酵70-75h。

通过采用上述方案，针对黑曲霉，配置专门的培养液，提高黑曲霉的培养效果。

较佳的，步骤S2中的中草药按重量份计，还包括杜仲2-4份，党参2-4份。

通过采用上述方案，杜仲味甘，性温，有补益肝肾、强筋壮骨、调理冲任、固经安胎的功效，具有补中益气，健脾益肺之功效。党参有增强免疫力、扩张血管、降压、改善微循环、增强造血功能等作用。杜仲和党参的加入能够进一步提高复合制剂中的有效成分的种类，进而能够进一步提高药效。

较佳的，步骤S3中密封发酵的最适温度32-35℃，产酶温度28-30℃。

较佳的，步骤S3中密闭发酵时添加增效剂，增效剂为由矿物元素Cu²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺的水溶性化合物按如下元素的物质的量之比配成的水溶液：Cu²⁺：Co²⁺：Mg²⁺：Fe²⁺：Zn²⁺：Ca²⁺＝1.0-6.25：1.5-5.0：20-100：18-89：38.5-115：250-500。

较佳的，增效剂为由CaCl₂，ZnSO₄，Fe SO₄，CuSO₄，Co(NO₃)₂，MgSO₄配成的水溶液。

通过采用上述方案，矿物元素能够为微生物的生长提供多种营养成分，提高发酵液中的活菌数量，提高复合制剂性能的稳定性和活性，且能够缩短发酵周期，降低发酵成本。

较佳的，制得的成品剂型为颗粒剂，泡腾颗粒，分散片，泡腾片，薄膜衣片，丸剂，胶囊剂，软胶囊剂、滴丸、口服液、注射液中的一种。

本发明的目的二：提供一种上述制备方法制备的扶正解毒复合制剂。

本发明的目的三：提供上述扶正解毒复合制剂的应用，应用于禽畜养殖领域。

较佳的，用于提高猪的免疫力。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、发酵过程中，选取乳酸菌、芽孢杆菌和黑曲霉，利用中草药和益生菌的协同作用，即中草药活性成分促进益生菌增殖效率，益生菌对中草药的生物转化作用，产生益生菌体蛋白抗体、寡糖及其衍生物，具有抗炎、抗感染、促进肠道有益菌群繁殖的作用，同时还具有激活机体免疫功能的作用。防治猪的各种病毒性呼吸道病和高热综合征等。提高中草药中活性成分药效；

2、加入的促纤维素分解酶和溶葡萄球菌酶能够选择性地分解中草药中的天然大分子、植物多肽等，产生多种苷类、生物碱、多糖、有机糖、挥发油等免疫活性物质，配合分解发酵产物，进一步提高中草药中有效成分的种类和活性，提高中草药利用率；

3、选取CO₂超临界萃取工艺，提取温度低，相比传统的中草药煎煮提取的方式，能够尽可能的减小对中草药有效成分的破坏；

4、本发明的复合制剂不添加防腐剂，是一种高效、绿色、无残留、无抗、新型复合型中草药微生态制剂。能够强力提升免疫力，构筑家畜多重免疫屏障。可作为病毒性、细菌性呼吸道疾病首选药物、能迅速激活机体免疫功能，启动抗病系统，提高机体免疫力和抗病力，降低死亡率。作用范围广，疗效迅速，可长期添加。

附图说明

图1为对靶动物猪的安全性试验中各组试验仔猪肝脏组织学切片(400倍)；

图2为对靶动物猪的安全性试验中各组试验仔猪脾脏组织学切片(400倍)；

图3为对靶动物猪的安全性试验中各组试验仔猪肾脏组织学切片(400倍)。

具体实施方式

实施例1

一种扶正解毒复合制剂的制备方法，包括有以下步骤：

S1：将乳酸菌(200亿CFU/ml)接种到MRS液体培养液中进行扩大培养，气浴摇床200rmp，温度为35℃，当菌液pH达5.0时，停止发酵，发酵时间为16h；将芽孢杆菌(1000亿CFU/ml)接种到LB培养液进行扩大培养，气浴摇床200rmp、35℃、培养24h，使菌液的吸光度OD值达到4；将黑曲霉用质量百分比8％麦鼓浸出物和质量百分比5％的脱脂大豆粉组成的培养液进行扩大培养，pH6.5，连续发酵70h，浓缩的发酵清液中含糖化酶3000U/ml和α-淀粉酶7000U/ml；将扩大后的菌液按体积比乳酸菌菌液：芽孢杆菌菌液：黑曲霉菌液的比例为1：4：3混合，制得复合菌液；

S2：按重量份数，取黄芪2份，板蓝根2份，淫羊藿4份，搅拌均匀，在110℃下灭菌20min；

S3：将复合菌液与灭菌后的中草药混合物按液固重量份比15：1进行混合均匀，密闭发酵72h，最适温度32℃，产酶温度28℃；

S4：向发酵混合物中继续混入用量为混合物总质量0.1％的促纤维素分解酶和用量为混合物总质量0.1％的溶葡萄球菌酶，4h后，进行CO₂超临界萃取；

S5：萃取制得的浓缩后的清膏打入真空冷冻干燥设备于-10℃下冷冻干燥得到含水量≤6％的干膏，干膏经粉碎过80目筛后得到干膏粉，干膏粉加入糊精于槽型混合机中混匀后，加入玉米淀粉浆制软材，其中，糊精和玉米淀粉占总混物的质量分数分别为30％和20％，软材过摇摆制粒机制粒，制备成湿颗粒，湿颗粒经烘干、整粒、分装后得到含水量≤5％的颗粒剂型的扶正解毒复合制剂。

实施例2

一种扶正解毒复合制剂的制备方法，包括有以下步骤：

S1将乳酸菌(200亿CFU/ml)接种到MRS液体培养液中进行扩大培养，气浴摇床300rmp，温度为37℃，当菌液pH达5.2时，停止发酵，发酵时间为20h；将芽孢杆菌(1000亿CFU/ml)接种到LB培养液进行扩大培养，气浴摇床300rmp、37℃、培养36h，使菌液的吸光度OD值达到5；将黑曲霉用质量百分比10％麦鼓浸出物和质量百分比8％的脱脂大豆粉组成的培养液进行扩大培养，pH6.6，连续发酵72h，浓缩的发酵清液中含糖化酶3000U/ml和α-淀粉酶7000U/ml；将扩大后的菌液按体积比乳酸菌菌液：芽孢杆菌菌液：黑曲霉菌液的比例为4：2：3混合，制得复合菌液；

S2：按重量份数，取黄芪4份，板蓝根4份，淫羊藿3份，搅拌均匀，在120℃高温灭菌30min；

S3：将复合菌液与灭菌后的中草药混合物按液固重量份比20：1进行混合均匀，密闭发酵82h，最适温度34℃，产酶温度29℃；

S4：向发酵混合物中继续混入用量为混合物总质量0.4％的促纤维素分解酶和用量为混合物总质量0.4％的溶葡萄球菌酶，6h后，进行CO₂超临界萃取；

S5：萃取制得的浓缩后的清膏打入真空冷冻干燥设备于-10℃下冷冻干燥得到含水量≤6％的干膏，干膏经粉碎过80目筛后得到干膏粉，干膏粉加入糊精于槽型混合机中混匀后，加入玉米淀粉浆制软材，其中，糊精和玉米淀粉占总混物的质量分数分别为30％和20％，软材过摇摆制粒机制粒，制备成湿颗粒，湿颗粒经烘干、整粒、分装后得到含水量≤5％的颗粒剂型的扶正解毒复合制剂。

实施例3

一种扶正解毒复合制剂的制备方法，包括有以下步骤：

S1：将乳酸菌(200亿CFU/ml)接种到MRS液体培养液中进行扩大培养，气浴摇床350rmp，温度为40℃，当菌液pH达5.5时，停止发酵，发酵时间为24h；将芽孢杆菌(1000亿CFU/ml)接种到LB培养液进行扩大培养，气浴摇床350rmp、40℃、培养48h，使菌液的吸光度OD值达到6；将黑曲霉(100亿CFU/ml)用12％麦鼓浸出物和10％脱脂大豆粉组成的培养液进行扩大培养，气浴摇床pH6.8，连续发酵75h，浓缩的发酵清液中含糖化酶3000U/ml和α-淀粉酶7000U/ml；将扩大后的菌液按体积比乳酸菌菌液：芽孢杆菌菌液：黑曲霉菌液的比例为4：4：1混合，制得复合菌液；

S2：按重量份数，取黄芪6份，板蓝根6份，淫羊藿2份，搅拌均匀，在130℃高温灭菌40min；

S3：将复合菌液与灭菌后的中草药混合物按液固重量份比30：1进行混合均匀，密闭发酵96h，最适温度35℃，产酶温度30℃；

S4：向发酵混合物中继续混入用量为混合物总质量1.0％的促纤维素分解酶和用量为混合物总质量1.0％的溶葡萄球菌酶，8h后，进行CO₂超临界萃取；

S5：萃取制得的浓缩后的清膏打入真空冷冻干燥设备于-10℃下冷冻干燥得到含水量≤6％的干膏，干膏经粉碎过80目筛后得到干膏粉，干膏粉加入糊精于槽型混合机中混匀后，加入玉米淀粉浆制软材，其中，糊精和玉米淀粉占总混物的质量分数分别为30％和20％，软材过摇摆制粒机制粒，制备成湿颗粒，湿颗粒经烘干、整粒、分装后得到含水量≤5％的颗粒剂型的扶正解毒复合制剂。

实施例4

本实施例按照实施例2的方法进行，不同之处在于：步骤S2中的中草药，按重量份计，还包括杜仲2份，党参2份。

实施例5

本实施例按照实施例2的方法进行，不同之处在于：步骤S2中的中草药，按重量份计，还包括杜仲3份，党参3份。

实施例6

本实施例按照实施例2的方法进行，不同之处在于：步骤S2中的中草药，按重量份计，还包括杜仲4份，党参4份。

实施例7

本实施例按照实施例2的方法进行，不同之处在于：步骤S3中密闭发酵时添加增效剂，增效剂为由矿物元素Cu²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺的水溶性化合物按如下元素的物质的量之比配成的水溶液：Cu²⁺：Co²⁺：Mg²⁺：Fe²⁺：Zn²⁺：Ca²⁺＝1.0：1.5：20：18：38.5：250，水溶性化合物选为CaCl₂ 2-4g/L，ZnSO₄ 0.5-1.5g/L，FeSO₄ 0.2-1.0g/L，CuSO₄ 0.01-0.08g/L，Co(NO₃)₂ 0.02-0.06g/L，MgSO₄ 0.1-0.5g/L。

实施例8

本实施例按照实施例2的方法进行，不同之处在于：步骤S5中密闭发酵时添加增效剂，增效剂为由矿物元素Cu²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺的水溶性化合物按如下元素的物质的量之比配成的水溶液：Cu²⁺：Co²⁺：Mg²⁺：Fe²⁺：Zn²⁺：Ca²⁺＝3.0：3.5：60：55：68：375，水溶性化合物选为CaCl₂ 2-4g/L，ZnSO₄ 0.5-1.5g/L，FeSO₄ 0.2-1.0g/L，CuSO₄ 0.01-0.08g/L，Co(NO₃)₂0.02-0.06g/L，MgSO₄ 0.1-0.5g/L。

实施例9

本实施例按照实施例2的方法进行，不同之处在于：步骤S5中密闭发酵时添加增效剂，增效剂为由矿物元素Cu²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺的水溶性化合物按如下元素的物质的量之比配成的水溶液：Cu²⁺：Co²⁺：Mg²⁺：Fe²⁺：Zn²⁺：Ca²⁺＝6.25：5.0：100：89：115：500，水溶性化合物选为CaCl₂ 2-4g/L，ZnSO₄ 0.5-1.5g/L，Fe SO₄ 0.2-1.0g/L，CuSO₄ 0.01-0.08g/L，Co(NO₃)₂ 0.02-0.06g/L，MgSO₄ 0.1-0.5g/L。

有效成分检测

实施例1-9制备的成品的主要有效成分检测数据列于表1。

表1有效成分检测数据结果。

由表1中实施例1-3可以看出，制备工艺对成品中有效成分的量存在显著影响，实施例2中的制备参数较优；实施例4-6制备的成品的淫羊藿苷、黄芪甲苷与实施例2接近，此外，实施例4-6制备的成品中还包含黑芥子苷、腺苷、桃叶珊瑚苷、党参皂苷、多种氨基酸等多种微量的有效成分；实施例7-9制备的成品的淫羊藿苷、黄芪甲苷量高于实施例2，这是因为增效剂的加入，为微生物的生长提供多种营养成分，提高发酵液中的活菌数量，进而提高发酵分解效果。

对靶动物猪的安全性试验

选取实施例2制备的样品进行安全性试验，证明由本发明的制备方法制备的复合制剂的安全性能，具体如下。

1试验目的

按农业部《实验临床试验技术规范》(试行)和农业部《兽用中药、天然药物临床试验技术指导原则》要求，评价样品对靶动物猪临床应用的安全性和安全剂量。

2材料与方法

2.1材料

试验药物：实施例2制备的样品。

实验动物：50日龄断奶仔猪40只，品种不限，雌雄各半。

2.2试验分组与饲养

仔猪购回后在标准动物房(北京市实验动物管理委员会认证)饲养和观察2天，将40只仔猪随机分成4组，每组10只。根据药效学最大剂量的1、3、5倍(即0.4g/kg、1.2g/kg、2.0g/kg)设定为药物的3个剂量组，同时设定不给药的空白对照组。试验期间，饲喂的饲料和饮水按正常饲养规程进行，温度和湿度分别保持在20±25℃和40-60％。给药方式采用混饲给药，每天1次，连续给药15天。

2.3效果评价指标与方法

试验仔猪体征：观察记录仔猪的采食、精神和二便(尿、粪便)情况，与对照组比较体征差异。

相对增重率：试验开始前和结束后各称重1次，计算仔猪相对增重率，相对增重率＝药物处理组相对增重/空白对照组相对增重×l00％。

血常规和血液生化指标：试验结束后每组仔猪抽血进行血常规检查和血液生化指标检查。

病理学观察：试验结束后将仔猪处死，每组解剖取肝脏、脾脏、肾脏，观察各脏器情况，同时，取仔猪组织器官称重，计算脏器系数，脏器系数＝脏器重量/总重×l00％。

病理组织切片：视仔猪病变情况取相应病变组织，每组取3只仔猪的相关

器官组织，用10％甲醛溶液固定，制作病理切片，观察组织病理情况。

2.4数据分析

使用统计软件SPASS 18.0进行数据处理，采用独立样本t检验，试验数据均以平均值±标准差表示，P≤0.05为差异显著。

3试验结果

3.1体征观察

试验周期内各组仔猪总体情况良好，采食正常，精神状况良好，未出现死亡；试验第7天，对照组中2头猪出现咳嗽症状，3天后恢复正常；1倍、3倍、5倍剂量的药物组中的猪各项体征正常。

3.2相对增重率

与空白对照组相比，1、3、5倍剂量组相对增重率均有所升高，但统计学上无显著性差异(p﹥0.05)(表2)。

表2试验仔猪相对增重率(n＝10)。

注：同行数据无肩标表示差异不显著(p>0.05)，*表示与对照组相比差异显著(p<0.05)。

3.3血常规检测结果

与空白对照组相比，各检测指标组间差异不显著(p>0.05)，且各组各项检测指标均在正常范围之内(表3)。

表3试验仔猪血常规指标(n＝10)。

注：同行数据无肩标表示差异不显著(p>0.05)，*表示与对照组相比差异显著(p<0.05)。

3.4血液生化指标检测结果

与空白对照组相比，1倍剂量组血清中谷草转氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)含量显著低于空白对照组；3倍剂量组血清中谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、尿素氮(BUN)含量显著低于空白对照组；5倍剂量组血清中谷丙转氨酶(GPT)、尿素氮(BUN)含量显著低于空白对照组；各组数据与空白组相比虽然差异显著，但仍在参考范围之内(表4)。

表4试验仔猪血液生化指标(n＝10)。

注：行数据无肩标表示差异不显著(p>0.05)，*表示与对照组相比差异显著(p<0.05)。

3.5脏器系数

与空白对照组相比各器官系数均无显著差异(表5)。

表5试验仔猪的脏器系数(n＝10)。

注：同行数据无肩标表示差异不显著(p>0.05)，*表示与对照组相比差异显著(p<0.05)。

3.6组织病理学检查

试验结束后，仔猪全部处死，剖检均未发现明显病变，进而进行组织学检测。

3.6.1肝脏

各组肝细胞结构清晰完整，形状大小一致，胞质丰富；细胞核圆，居中，偶有双核或多核；各组肝索结构清晰。结合图1，A为空白对照组，B为l倍剂量组，C为3倍剂量组，D为5倍剂量组。

3.6.2脾脏

各组脾组织颜色分明，红髓和白髓有明显分界；淋巴细胞数量较多，形态一致，着色均匀。结合图1，A为空白对照组，B为l倍剂量组，C为3倍剂量组，D为5倍剂量组。

3.6.3肾脏

各组肾小管形态清晰，染色均匀，肾小管上皮细胞界限清晰，细胞核完整；肾小球结构完整。结合图1，A为空白对照组，B为l倍剂量组，C为3倍剂量组，D为5倍剂量组。

4试验结论

本试验通过对仔猪的一般状况、脏器组织观察及血液生理、生化指标检查，得出实施例2制备的样品对仔猪未见有害效应，具有较好的安全性。

复合制剂对靶动物猪的免疫增强试验

选取具有代表性的实施例2、5、8制备的样品进行免疫增强试验，以证明由本发明的制备方法制备的复合制剂在提高动物免疫力方面的作用。

1试验目的

按照农业部《实验临床试验技术规范》(试行)和农业部《兽用中药、天然药物临床试验技术指导原则》要求，评价实施例2、5、8制备的样品对猪机体免疫增强的临床疗效。

2材料与方法

2.1材料

试验动物：仔猪，雌雄各65只，15±20kg，猪蓝耳病抗体检测为阴性，购自唐山大北农育种科技有限责任公司；环磷酰胺购自湖北康宝泰精细化工有限公司，批号KBT20170501；猪蓝耳病弱毒疫苗购自德国勃林格殷格翰，批号：1245110-05；实施例2、5、8制备的样品；灵芪速补金维他购自山东阿斯利康动保健品有限公司，批号：20170501。

2.2试验动物分组

参见表6，将130头仔猪随机分为13组，每组雌雄各5头。第1组为空白组，第2-3组为模型组，第4-13组为药物组。空白组不注射环磷酰胺，不给药，不接种疫苗；模型组1注射环磷酰胺，但不给药，不接种疫苗；模型组2注射环磷酰胺，接种疫苗，但不给药：药物组1注射环磷酰胺，接种疫苗，给药对照药物；药物组2-4注射环磷酰胺，接种疫苗，给药不同剂量(0.1-0.4g/kg-b.w.)实施例2制备的样品；药物组5-7注射环磷酰胺，接种疫苗，给药不同剂量(0.1-0.4g/kg-b.w.)实施例5制备的样品；药物组8-10注射环磷酰胺，接种疫苗，给药不同剂量(0.1-0.4g/kg-b.w.)实施例8制备的样品。环磷酰胺造模给药程序为，试验第1-4天按75mg/kg·b.w.肌肉注射环磷酰胺注射液，不注射环磷酰胺组注射等量生理盐水；药物给药程序为，试验第1-10天按表6所列药物和剂量混饲给药，每天1次；疫苗接种程序为，试验第11天肌肉注射猪蓝耳病疫苗，不接种组注射等量生理盐水。试验持续50天，正常饲喂，每天观察记录猪群状况。

表6试验分组。

2.3指标评价

2.3.1体重测定

分别于试验0、10、25、50天对每组猪称重，比较每组猪重量差异。

2.3.2血常规、血生化检测及抗体水平检测

免疫后第0、20、40天分别采取各组猪的外周血，将其分为两部分，一部分使用全自动血细胞分析仪进行血常规检测，另外一部分使用全自动生化分析仪检测其GOT、GTP、ALP、BUN、TP、ALB。

免疫后第0、7、15、25、40天分别采取各组猪的外周血，分离血清，利用猪蓝耳病抗体检测试剂盒检测各组的猪蓝耳抗体水平。

2.4数据分析

使用SPASS 18.0统计软件进行数据处理，采用独立样本t检验，试验数据均以平均值±标准差表示，P﹤0.05为差异显著。

2.5试验结果

2.5.1体重

与空白组相比，其余各试验组在10天、25天的日增重均较低，50天的日增重各试验组基本相同，但统计学上无显著性差。前10天日增重，与空白组相比，模型组1、模型组2、药物组1-3、药物组5-6、药物组8-9显著降低；与模型组2相比，药物组4、药物组7、药物组10日增重显著升高，见表7。

表7试验仔猪不同时间段日增重(n＝10)。

注：*表示与空白组相比差异显著(P﹤0.05)；△表示与模型组2相比差异显著(P﹤0.05)。

2.5.2血常规结果

分别在免疫后第0、20、40天对各组仔猪进行血常规检测，检测结果如下：

免疫后第0天.由于黄磷酰胺的免疫抑制作用仍有影响，所以与空白组相比，其余各试验组的白细胞(WBC)水平均降低，差异显著；模型组1、药物组1、药物组4、药物组7、药物组10的红细胞(RBC)水平均显著高于空白组。与模型组2相比，药物组2-3、药物组5-6、药物组8-9的红细胞(RBC)水平显著降低，药物组1、药物组4、药物组7、药物组10显著升高，见表8。

表8免疫第0天试验仔猪血常规指标(n＝10)。

注：*表示与空白组相比差异显著(P<0.05)；△表示与模型组2相比差异显著(P<0.05)。

免疫后第20天，与空白组相比，模型组2、药物组1-10的白细胞(WBC)水平显著升高。模型组2与模型组1相比白细胞(WBC)水平显著升高。与模型组2相比，药物组1、药物组4、药物组7、药物组10的血小板(PLT)显著升高，见表9。

表9免疫后第20天试验仔猪血常规指标(n＝10)。

注：*表示与空白组相比差异显著(P<0.05)；#表示与模型组2相比差异显著(P<0.05)；△表示与模型组2相比差异显著(P<0.05)。

免疫后第40天，与空白组相比，除模型组1以外，各组的白细胞(WBC)水平均显著升高，药物组1的红细胞(RBC)、血小板(RLT)水平显著降低。模型组2与模型组1相比，白细胞(WBC)水平显著升高。与模型组2相比，药物组1、药物组3-4、药物组6-7、药物组9-10的白细胞(WBC)水平显著升高。见表10。

表10免疫后第40天试验仔猪血常规指标(n＝10)。

注：*表示与空白组相比差异显著(P<0.05)；#表示与模型组2相比差异显著(<0.05)；△表示与模型组2相比差异显著(P<0.05)。

2.5.3血液生化指标检测结果

分别在免疫后0、10、20、40天对各组仔猪进行血液生化检测，检测结果如下：

免疫后第0天，与空白组相比，各试验组谷草转氨酶(GOT)，模型组2、药物组2、药物组4、药物组5、药物组7、药物组8、药物组10的白蛋白(ALB)，药物组2、药物组5、药物组8的总蛋白(TP)水平均显著降低；模型组1、模型组2、药物组1、药物组4、药物组7、药物组10的碱性磷酸酶(ALP)，药物组3、药物组6、药物组9的谷丙转氨酶(GPT)，模型组2的白蛋白(ALB)水平显著升高。与模型组1相比，模型组2的尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)水平显著降低；总蛋白(TP)水平显著升高。与模型组2相比，药物组3、药物组6、药物组9的谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)，药物组4、药物组7、药物组10的谷草转氨酶(GOT)水平显著升高，药物组2、药物组5、药物组8的总蛋白(TP)、肌酐(CRE)水平显著下降，见表11。

表11免疫后第0天试验仔猪血液生化指标(n＝10)。

注：*表示与空白组相比差异显著(P<0.05)；#表示与模型组1相比差异显著(P<0.05)；△表示与模型组2相比差异显著(P<0.05)。

免疫后第20天，与空白组相比，模型组1的谷丙转氨酶(GPT)，模型组2的谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)，药物组3、药物组6、药物组9的谷丙转氨酶(GPT)，谷丙转氨酶(GPT)水平均显著降低；模型组1、模型组2、药物组4、药物组7、药物组10的碱性磷酸酶(ALP)，模型组1、模型组2、药物组1、药物组2、药物组5、药物组8的尿素氮(BUN)，模型组2的总蛋白(TP)水平显著升高。与模型组1相比，模型组2的白蛋白(ALB)显著降低。与模型组2相比，药物组2、药物组5、药物组8的总蛋白(TP)，药物组3、药物组6、药物组9的尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)水平显著降低；药物组1的谷草转氨酶(GOT)，药物组2、药物组5、药物组8的尿素氮(BUN)和谷草转氨酶(GOT)，药物组4的谷草转氨酶(GOT)水平显著升高，见表12。

表12免疫后第20天试验仔猪血液生化指标(n＝10)。

注：*表示与空白组相比差异显著(P<0.05)；#表示与模型组2相比差异显著(P<0.05)；△表示与模型组2相比差异显著(P<0.05)。

免疫后第40天，模型组2的白蛋白(ALB)水平，药物组2、药物组5、药物组8的谷草转氨酶(GOT)显著升高。与模型1组相比，模型组2的谷草转氨酶(GOT)显著降低，尿素氮(BUN)显著升高。与模型组2相比，药物组1、药物组2、药物组5、药物组8的谷草转氨酶(GOT)显著升高，药物组1的谷丙转氨酶(GPT)水平显著降低。见表13。

表13免疫后第40天试验仔猪血液生化指标(n＝10)。

注：*表示与空白组相比差异显著(P<0.05)；#表示与模型组1相比差异显著(P<0.05)；△表示与模型组2相比差异显著(P<0.05)。

2.5.4抗体检测结果

免疫后第0、7、15、25、40天分别采取猪外周血，分离血清，利用猪蓝耳抗体检测试剂盒检测各组的猪蓝耳抗体，若试剂盒抗体水平检测结果大于0.4则判定为阳性，小于0.4则判定为阴性。抗体水平分析如下：

免疫前，与空白组相比各试验组均无显著差异。免疫后7天：与空白组相比，模型2组、药物组1、药物组4、药物组7、药物组10抗体水平显著升高；与模型组2相比，药物组4、药物组7、药物组10抗体水平显著升高。免疫后15天：与空白组相比，模型组2、药物组1-10抗体水平显著升高；模型组2抗体水平显著高于模型组1；与模型组2相比，各药物组抗体水平均无显著差异。免疫后25天：与空白组相比模型组2、药物组1-10抗体水平显著升高；模型组2、模型组5、模型组8抗体水平显著高于模型组1；与模型组2相比，药物组3-4、药物组6-7、药物组9-10抗体水平显著升高。免疫后40天：与空白组相比，模型组2、药物组1-10的抗体水平显著升高；模型组2抗体水平显著高于模型组1；与模型组2相比，药物组4、药物组7、药物组10抗体水平显著升高，见表14。

表14抗体水平结果。

注：*表示与空白组相比差异显著(P<0.05)；#表示与模型组1相比差异显著(P<0.05；△表示与模型组2相比差异显著(P<0.05)。

2.6结论

通过对以上结果分析，表明实施例2、5、8制备的复合制剂样品具有提高仔猪蓝耳病疫苗接种抗体滴度的效果，给药剂量为(0.2-0.4g/kg-b.w.)时效果优于对照药物。实施例5、8制备的复合制剂样品的效果优于实施例2。

上述具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。