阅读说明：本技术 一种精制棉籽蛋白的方法 (Method for refining cottonseed protein ) 是由 丁姣 陈文杰 尹国强 赖锐豪 周向阳 冯聘娴 欧阳湘怡 柯杰明 赖诗敏 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种精制棉籽蛋白的方法,该方法是将脱酚棉籽粕经过尿素预处理后,通过碱液浸提得到棉籽蛋白粗浸提液,然后经透析、酸沉、洗涤、干燥,精制得到棉籽蛋白固体粉末。采用本发明的方法,可以精制得的棉籽蛋白分子量在8~14kD、纯度大于98%,其与合成高聚物的相容性较好,可用于制备力学性能较好的棉籽蛋白基复合材料。(The invention discloses a method for refining cottonseed protein, which comprises the steps of pretreating dephenolized cottonseed meal by urea, leaching by alkali liquor to obtain a crude cottonseed protein leaching solution, dialyzing, precipitating by acid, washing, drying and refining to obtain solid cottonseed protein powder.)

一种精制棉籽蛋白的方法

技术领域

本发明属于高分子技术领域，涉及一种精制棉籽蛋白的方法，尤其涉及一种精制得与合成聚合物相容性较好的棉籽蛋白。

背景技术

棉籽粕是棉籽脱壳去油后的副产品，其含有丰富的蛋白质，是重要的植物蛋白资源。棉籽蛋白（CP）中含有的氨基酸具有一定的营养价，因此常被加工成为动物饲料。然而，棉籽蛋白在材料领域并未得到广泛应用，这是因为以往的棉籽蛋白提取过程一般都是在高温、强酸、强碱的环境下进行，这容易导致蛋白质变性和较低的棉籽蛋白纯度，影响其作为材料的理化性质和可加工性。

我国是棉花种植大国，近年来棉籽的年产量达到800万吨以上。除棉籽油外，仍有500余万吨废弃的棉籽粕，其含有20%左右的蛋白质。目前，在棉籽粕中提取棉籽蛋白主要包括碱溶酸沉法、盐提法、酶解法等。

传统的碱溶酸沉法是采用一定浓度的碱液对棉籽粕浸提一段时间后，混合物经过离心分离后，用酸溶液调节pH值，是棉籽蛋白沉淀析出的方法。申请号为201310382819.4的发明专利公开一种采用氢氧化钠和亚硫酸钠复合碱液提取棉籽蛋白的方法，张步宁、白雪等人采用氢氧化钠碱液提取棉籽蛋白，李梅红等人采用氨水溶液提取棉籽蛋白。该方法操作简单、成本低廉，但所提取的棉籽蛋白纯度较低、蛋白质变性率较高，因此难以被进一步加工成材料利用。此外，这种方法会产生大量废酸废碱。

盐提法是采用NaCl等盐溶液促使棉籽粕中蛋白质吸附大量盐离子，增加棉籽蛋白分子之间的静电排斥，促进蛋白质的水合作用，提高蛋白质的溶解度，从而达到提取目的。申请号为201510364396.2的发明专利公布一种棉籽蛋白的提取工艺，其采用NaCl作为盐溶液，在38~42℃下，按照料液比（14~16）:1对棉籽粕浸提75~85 min。通过这类方法提取的棉籽蛋白的蛋白质变性率较低，但其产量和纯度亦较小，难以在材料领域被进一步加工利用。

酶提法是利用特定的酶对棉籽粕进行分解，从而提取棉籽蛋白。申请号为201711472292.9的发明专利公布一种棉籽蛋白的生产方法，其采用纤维素酶和木质氧化酶中的一种或两种复合酶从脱酚棉籽粕中提取棉籽蛋白。该方法反应温和，不会破坏棉籽蛋白的稳定性和发生副反应，但是提取率较低、蛋白质纯度低。

为了使棉籽蛋白能够进一步被应用在材料加工领域，所提取精制的棉籽蛋白需要具有较高的纯度、较低的蛋白质变性率，蛋白结构稳定性好，与合成高聚物具有较好的相容性。

发明内容

本发明提供一种精制棉籽蛋白的方法，旨在解决现有方法提取的棉籽蛋白杂质较多、与合成高聚物相容性较差的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种精制棉籽蛋白的方法，其特征在于，所精制得到的棉籽蛋白分子量主要集中在8~14kD之间、纯度大于98%，能以不同比例与一些合成高聚物混溶与去离子水或含氟试剂中。具体方法包括以下步骤：

(1)尿素预处理：将脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量10~30倍量、浓度为3~7mol/L的尿素溶液，在40~60℃搅拌12h，过滤，然后用去离子水洗涤，得到经预处理的脱酚棉籽粕；

(2)碱液浸提：将经过尿素预处理的脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量的10~20倍量，浓度为0.03~0.10mol/L的新制碱液，在40~60℃搅拌1~4h，然后在3000r/min下离心5~10min，过滤得到棉籽蛋白粗浸提液；

(3) 透析净化：将棉籽蛋白粗浸提液装入透析袋中，在4~25℃的去离子水中透析5~7天，每隔8~12h换一次去离子水，然后收集透析液；所得透析液即为精制的棉籽蛋白液；

(4)棉籽蛋白沉淀：用稀盐酸调节棉籽蛋白液的pH值至4.5~5.5，出现大量蛋白质沉淀；离心、过滤后用蒸馏水洗涤，干燥后得到纯净的浅棕色棉籽蛋白粉末。

优选地，步骤（1）所述尿素溶液浓度为4~5mol/L，加入量为脱酚棉籽粕的12倍量。

优选地，步骤（2）所述新制碱液为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或组合，总浓度为0.03~0.10 mol/L。进一步优选为0.05mol/L新制氢氧化钠溶液。

优选地，步骤（3）所述透析袋的截留分子量为8~14kD，透析温度为4~10℃。

优选地，步骤（4）所述调节棉籽蛋白液的pH值为4.7~5.0，所述的干燥为冷冻干燥。

与现有技术相比，本发明技术方案有益效果在于，采用低温透析和冷冻干燥的方法精制得特定分子量的纯净棉籽蛋白，使其能按任意比例与一些合成高聚物混溶于去离子水或含氟试剂中。经精制后的棉籽蛋白变废为宝，能被制备成多种棉籽蛋白基复合材料，进一步拓宽废弃棉籽粕在新材料领域的应用。

附图说明

附图1为本发明精制棉籽蛋白的工艺流程图。

附图2为本发明精制的棉籽蛋白的红外光谱图。

附图3为本发明精制的棉籽蛋白与PVA共混成膜的表面和断面微观形貌图。

附图4为本发明精制的棉籽蛋白与PEO共混成膜的表面和断面微观形貌图。

附图5为本发明精制的棉籽蛋白与TPU复合纳米纤维的微观相貌图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种精制棉籽蛋白的方法，具体包括以下步骤：

(1)尿素预处理：将脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量10~30倍量、浓度为3~7mol/L的尿素溶液，在40~60℃搅拌12h，过滤，然后用去离子水洗涤，得到经预处理的脱酚棉籽粕；

(2)碱液浸提：将经过尿素预处理的脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量的10~20倍量，浓度为0.03~0.10mol/L的新制碱液，在40~60℃搅拌1~4h，然后在3000r/min下离心5~10min，过滤得到棉籽蛋白粗浸提液；

(3)透析净化：将棉籽蛋白粗浸提液装入透析袋中，在4℃~25℃的去离子水中透析5~7天，每隔8~12h换一次去离子水，然后收集透析液；所得透析液即为精制的棉籽蛋白液；

(4)棉籽蛋白沉淀：用稀盐酸调节棉籽蛋白液的pH值至4.5~5.5，出现大量蛋白质沉淀；离心、过滤后用蒸馏水洗涤，干燥后得到纯净的浅棕色棉籽蛋白粉末。

其中，步骤（1）所述尿素溶液浓度为4~5mol/L，加入量为脱酚棉籽粕的12倍量。

步骤（2）所述新制碱液为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或组合，总浓度为0.03~0.10 mol/L。进一步优选为0.05mol/L新制氢氧化钠溶液。

步骤（3）所述透析袋的截留分子量为8~14kD，透析温度为4℃~10℃。

步骤（4）所述调节棉籽蛋白液的pH值为4.7~5.0，所述的干燥为冷冻干燥。

下面通过傅里叶变换红外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、凯氏定氮法、共混浇注法对本发明精制的棉籽蛋白的结构、分子量、纯度、与合成高分子的相容性进行表征和测试。

1、傅里叶变换红外光谱_。

采用傅里叶变换红外光谱仪（Spectrum 100 infrared spectrometer, Perkin-Elmer, Fremont, CA, USA）对棉籽蛋白粉末的结构进行表征。对数据进行分析，发现3272cm^-1处出现N-H与O-H氢键缔合峰， 1637,1544和1399 cm^-1处分别出现酰胺Ⅰ型（C=O伸缩振动峰）、酰胺Ⅱ型（面内N-H弯曲和C-N伸缩振动）和酰胺Ⅲ型（C=O弯曲振动和C-N伸缩振动）特征峰；1044 cm^-1出现棉籽蛋白C-O伸缩振动峰。

2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳_。

采用电泳仪，并应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对棉籽蛋白的分子量进行测试，发现按照本发明精制的棉籽蛋白分子量主要集中在8kD~14kD。

3、凯氏定氮法_。

采用凯氏定氮法对精制的棉籽蛋白的纯度进行测定。发现通过本发明精制得到的棉籽蛋白纯度为99%±1%以上。

4、棉籽蛋白与合成高聚物相容性分析_。

将精制得到的棉籽蛋白粉溶解于碱性去离子水或六氟异丙醇中，并与合成高聚物溶液共混均匀后浇注于聚丙烯容器中，待溶剂蒸发后，固化成膜。通过扫描电镜观察共混膜的微观形态，判断棉籽蛋白与合成高聚物的相容性。发现，本发明精制的棉籽蛋白与PVA、PEO、TPU、PLA、明胶等多种高聚物共混后未出现相分层现象，所制得的共混膜在电镜下观察得到表面形貌平整、断面形貌均一。因此，本发明所精制的棉籽蛋白与合成高聚物相容性较好。

实施例1_。

（1）尿素预处理：将50 g脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量12倍量（600g）、浓度为3mol/L的尿素溶液，在50℃搅拌12h，过滤，然后用去离子水洗涤，得到经预处理的脱酚棉籽粕；

（2）碱液浸提：将经过尿素预处理的脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量的12倍量（600g），浓度为0.05mol/L的新制氢氧化钠溶液，在60℃搅拌1h，然后在3000r/min下离心10min，过滤得到棉籽蛋白粗浸提液；

（3）透析净化：将棉籽蛋白粗浸提液装入透析袋中，在4℃的去离子水中透析7天，每隔8h换一次去离子水，然后收集透析液；所得透析液即为精制的棉籽蛋白液；

（4）棉籽蛋白沉淀：用稀盐酸调节棉籽蛋白液的pH值至4.8，出现大量蛋白质沉淀；离心、过滤后用蒸馏水洗涤，冷冻干燥后得到纯净的浅棕色棉籽蛋白粉末。

经测定，本实施例精制的棉籽蛋白分子量主要集中在9kD~16kD，纯度为99%。如附图3~4所示，本实施例精制的棉籽蛋白与PVA、PEO、TPU具有良好的相容性。

实施例2_。

（1）尿素预处理：将100 g脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量15倍量（1500g）、浓度为5mol/L的尿素溶液，在50℃搅拌12h，过滤，然后用去离子水洗涤，得到经预处理的脱酚棉籽粕；

（2）碱液浸提：将经过尿素预处理的脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量的15倍量（1500g），浓度为0.07mol/L的新制氢氧化钾溶液，在60℃搅拌1h，然后在3000r/min下离心10min，过滤得到棉籽蛋白粗浸提液；

（3）透析净化：将棉籽蛋白粗浸提液装入透析袋中，在10℃的去离子水中透析5天，每隔8h换一次去离子水，然后收集透析液；所得透析液即为精制的棉籽蛋白液；

（4）棉籽蛋白沉淀：用稀盐酸调节棉籽蛋白液的pH值至4.8，出现大量蛋白质沉淀；离心、过滤后用蒸馏水洗涤，冷冻干燥后得到纯净的浅棕色棉籽蛋白粉末。

经测定，本实施例精制的棉籽蛋白分子量主要集中在8kD~11kD，纯度为98%，与PVA、PEO、TPU、PLA和明胶具有良好的相容性。

实施例3_。

（1）尿素预处理：将70 g脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量10倍量（700g）、浓度为5mol/L的尿素溶液，在50℃搅拌12h，过滤，然后用去离子水洗涤，得到经预处理的脱酚棉籽粕；

（2）碱液浸提：将经过尿素预处理的脱酚棉籽粕置于反应器中，加入脱酚棉籽粕质量的10倍量（700g），浓度为0.05mol/L的新制氨水溶液，在60℃搅拌1h，然后在3000r/min下离心10min，过滤得到棉籽蛋白粗浸提液；

（3）透析净化：将棉籽蛋白粗浸提液装入透析袋中，在4℃的去离子水中透析7天，每隔8h换一次去离子水，然后收集透析液；所得透析液即为精制的棉籽蛋白液；

（4）棉籽蛋白沉淀：用稀盐酸调节棉籽蛋白液的pH值至5.0，出现大量蛋白质沉淀；离心、过滤后用蒸馏水洗涤，冷冻干燥后得到纯净的浅棕色棉籽蛋白粉末。

经测定，本实施例精制的棉籽蛋白分子量主要集中在8kD~16kD，纯度为98%，与PVA、PEO、TPU、PLA和明胶具有良好的相容性。