阅读说明：本技术 阳离子桥联订书针肽及其应用 (Cationic bridged staple peptides and uses thereof ) 是由 张金强 夏学锋 李红 胡宇晨 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种阳离子桥联订书针肽,所述订书针肽为具有10到20个氨基酸残基的环状多肽,具有以下序列及结构特征：多肽序列可以P<Sub>n</Sub>-K<Sub>c</Sub>-P<Sub>m</Sub>-K<Sub>c</Sub>-P<Sub>i</Sub>为通式；其中,P<Sub>n</Sub>,P<Sub>m</Sub>,及P<Sub>i</Sub>是具有“n”“m”“i”个氨基酸残基的多肽片段,n,i均为自然数,m为3或6；其中K表示赖氨酸,c表示两个赖氨酸侧链氨基之间形成环状结构。本发明提供此类阳离子桥联订书针肽的制备方法及其应用。本发明创新性的在两亲性阳离子抗菌肽的亲水性表面一侧形成环状结构,制备了一类订书针抗菌肽。该类抗菌肽具有以下优点：具有广谱抗菌活性,尤其对临床耐药细菌具有显著抑制效果；结构简单,易于合成；生物稳定性好；可以应用于人或动物感染性疾病或肿瘤的预防和治疗。(The invention discloses a cationic bridged staple peptide, which is a cyclic polypeptide with 10 to 20 amino acid residues and has the following sequence and structural characteristics: the polypeptide sequence may be P n ‑K c ‑P m ‑K c ‑P i Is shown in the general formula (II); wherein, P n ，P m And P i Is a polypeptide fragment with 'n','m' and 'i' amino acid residues, wherein n and i are natural numbers, and m is 3 or 6; wherein K represents lysine, and c represents a cyclic structure formed between two lysine side chain amino groups. The present invention provides a process for the preparation of such cationic bridged staple peptidesPreparation method and application thereof. According to the invention, a ring structure is innovatively formed on one side of the hydrophilic surface of the amphiphilic cationic antibacterial peptide, so that the staple antibacterial peptide is prepared. The antibacterial peptide has the following advantages: has broad-spectrum antibacterial activity and especially has obvious inhibition effect on clinical drug-resistant bacteria; the structure is simple and the synthesis is easy; the biological stability is good; can be applied to the prevention and treatment of infectious diseases or tumors of human beings or animals.)

阳离子桥联订书针肽及其应用

技术领域

本发明设计了一类阳离子桥联的订书针肽，本发明还涉及这些多肽的制备和应用，属生物医学领域。

背景技术

已有许多文献表明环肽有助于增强多肽的稳定性，提高多肽的生物活性。形成环肽的方法主要有以下三种：侧链与侧链交联，头尾相连，侧链与末端相连。其中氨基酸侧链与侧链之间相互连接成环形成订书针肽。订书针肽的形成有助于稳定多肽的二级构象，提高多肽与受体的结合能力。目前形成订书针肽的方法主要通过烯烃复分解反应，半胱氨酸二硫键形成硫醚或者氨基酸侧链的氨基与羧基偶联形成订书针肽。但是现有的这些方法都只能在多肽的疏水性一侧成环，如何在亲水性一侧构建订书针肽仍是一片空白。对多肽尤其是抗菌肽而言，电荷和两亲性对其活性具有重要影响,如何在保持多肽原有两亲性不变的情况下引入订书针结构极其重要。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种不易被蛋白酶降解的阳离子桥联订书针肽，本发明同时提供阳离子桥联订书针肽的制备方法，本发明还提供阳离子桥联订书针肽的应用。两亲性阳离子抗菌肽订书针肽具有显著的抗菌作用，尤其对临床耐药细菌具有很好的抑制效果，具有结构简单，人工合成方便，抗菌谱广等优点。其显著特点在于耐受血清蛋白酶降解，抗菌活性保留时间长。可以应用于人或动物感染性疾病的预防和治疗。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

阳离子桥联订书针肽，所述订书针肽具有以下序列：

P_n-K_c-P_m-K_c-P_i

其中，P_n，P_m,及P_i是具有“n”“m”“i”个氨基酸残基的多肽片段，n,i均为自然数，m为3或6；其中K表示赖氨酸，c表示两个赖氨酸侧链末端氨基之间形成环状结构，多肽序列总长度为10-20个氨基酸残基。本发明以新颖、绿色、高效的方法得到了具有上述通式的一类订书针肽，经过活性测试，证明该方法有效增强了多肽的稳定性及生物活性，具有潜在的药用价值。

作为本发明的一种优选方案，所述订书针肽由至少两个赖氨酸残基及其它L-型氨基酸残基组成，且两个赖氨酸之间间隔3或者6个氨基酸残基组成的多肽序列，所述的衍生物均为L-型氨基酸组成并符合以下序列之一：

P_n-K_c-P_m-K_c-P_i

其中，K选自赖氨酸或其衍生物构成的组中；

其余位置氨基酸均为L-型氨基酸或其衍生物。

作为本发明的另一种优选方案，所述订书针肽的结构如下：

其中，K为赖氨酸，两个赖氨酸侧链末端氨基之间通过与烷基化试剂发生亲核取代反应相连；R基团选自烷基、芳基、杂芳基、芳基取代烷基、杂芳基取代烷基或环烷基取代烷基。

作为本发明的又一种优选方案，R基团为1，2-二亚甲基苯、1，3-二亚甲基苯、1，4-二亚甲基苯或反式1，4-二亚甲基-2-丁烯。

一种阳离子桥联订书针肽的制备方法，该方法包括如下步骤：

1)制备寡肽固相树脂：通过标准的固相合成方法将目标寡肽负载在Rink-AM树脂上；

2)制备化合物2：通过标准的固相合成方法将侧链保护的赖氨酸负载在树脂上生成化合物2；

3)制备化合物3：化合物2与相应的烷基化试剂发生亲核取代反应得到化合物3；

4)制备化合物4：化合物3经过脱保护得到化合物4；

5)制备化合物5：将化合物4从树脂上切割下来得到化合物5。

所述订书针肽可用于制备人或动物抗肿瘤或者抗微生物感染的药物。

与现有技术相比，本发明的技术效果是：

1、本发明以线性抗菌肽为模板设计合成了阳离子桥联的订书针结构抗菌肽，在增强了抗菌活性的同时增强了多肽的稳定性，有效延长作用时间。

2、本发明得到的订书针结构抗菌肽具有显著的抗菌作用，尤其对临床耐药细菌具有很好的抑制效果，与其它抗菌肽相比，该订书针肽具有结构简单，人工合成方便，抗菌谱广等优点，尤其是有更强的抵抗血清蛋白酶水解的能力，能更长时间保持微生物的活性；其显著特点在于耐受蛋白酶降解，抗菌活性保留时间长；可以应用于人或动物感染性疾病的预防和治疗。

3、本发明得到的订书针结构抗菌肽全部由L-型氨基酸残基组成，耐血清蛋白酶的降解，在抗微生物活性方面与线性肽存在明显差异；订书针抗菌肽具有显著的抑制微生物生长的能力，尤其是对临床耐压细菌有很好的抑制作用。

4、本发明在形成订书针肽的同时保持其电荷和两亲性不变，有利于减小结构改变对多肽生物活性的影响，具有较大的潜在药物应用价值。

附图说明

图1为阳离子桥联订书针肽制备的流程图；

图2为订书针肽在25％血清中的稳定性实验结果图；

图3为LH115 16ug/mL的杀菌效率曲线图；

图4为LH065 32ug/mL的杀菌效率曲线图；

图5为LH115的抗肿瘤效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。

部分物质的全称或相应的中文名称如下：

DIEA:N,N-二异丙基乙胺

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

THF：四氢呋喃

TBAH:四丁基氢氧化铵

DBU:1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯实例1：订书针抗菌肽的制备

制备路线如下，如图1所示：

1.制备寡肽固相树脂：Rink-AM树脂(负载量为0.35mmol/g，每肽的起始负载量为200mg)，通过标准的固相合成方法将Fmoc-Val-OH负载在Rink-AM树脂。

2.制备侧链邻硝基苯磺酰基保护的赖氨酸：称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 4.68g放置于250mL圆底烧瓶之中，然后量取溶剂CH₂Cl₂ 60mL和三氟乙酸(TFA)20mL，加入到圆底烧瓶中，用10mL的CH₂Cl₂冲洗量取过TFA的量筒，并将冲洗液转移到圆底烧瓶之中，搅拌1h。向得到的中间体Fmoc-Lys-OH·TFA，加入H₂0:四氢呋喃(THF)＝1:1(各55mL)、N-乙基二异丙胺中和溶液PH至9、加入邻硝基苯磺酰氯2.1g，室温搅拌2h，萃取，柱层析分离得到纯度较高的氨基酸。

3.制备抗菌肽线性肽：通过标准的固相合成方法将氨基酸按序列从碳端开始依次偶联至树脂上(在偶联第二个及第六个氨基酸时***侧链由邻硝基苯磺酰基保护的赖氨酸)，每次偶联完毕，用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗涤树脂3次，最终得到线性肽抗菌肽LH091a。

4.制备烷基化多肽链：将通过标准的固相合成方法合成的线性抗菌肽在DCM中溶胀10分钟，加入THF 4mL,TBAH(6eq)后振摇10min，再加入烷基化试剂1，4-二溴丁烯(6eq),在摇床上振摇24h后依次用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗涤3次得到LH091b。

5.制备脱保护多肽链：将烷基化的订书针肽在DCM中溶胀10分钟，加入2-巯基乙醇(5eq),DBU(10eq),在摇床上振摇12h后依次用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗涤3次得到LH091c。

6.制备订书针肽终产物：向脱保护的订书针肽固相管中加入切割试剂(TFA:TIS：H₂O 95：2.5：2.5)，在摇床上切割过夜。收集切割溶液，空气吹干，加入冷***沉淀，离心，弃去***，加水溶解，冻干，半制备分离纯化得到LH090。收率18.41％，纯度>95％。

7.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第5及第9个氨基酸，其它处理与LH090相同得到化合物LH065。收率16.63％，纯度>95％。

8.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第6及第10个氨基酸，其它处理与LH090相同得到化合物LH092。收率19.07％，纯度>95％。

9.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第10及第14个氨基酸，其它处理与LH090相同得到化合物LH091。收率15.97％，纯度>95％。

10.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第13及第17个氨基酸，其它处理与LH090相同得到化合物LH089。收率13.79％，纯度>95％。

11.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第2及第9个氨基酸，其它处理与LH090相同得到化合物LH109。收率10.68％，纯度>95％。

12.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第6及第13个氨基酸，其它处理与LH090相同得到化合物LH110。收率9.5％，纯度>95％。

13.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第9及第16个氨基酸，其它处理与LH090相同得到化合物LH124。收率13.6％，纯度>95％。

14.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第10及第17个氨基酸，其它处理与LH090相同得到化合物LH111。收率9.96％，纯度>95％。

15.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第9及第13个氨基酸，其它处理与LH090相同得到化合物LH123。收率14.61％，纯度>95％。

16.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第5及第9个氨基酸，并将烷基化试剂换为1，2-二溴甲基苯，其它处理与LH090相同得到化合物LH115。收率16.01％，纯度>95％。

17.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第5及第9个氨基酸，并将烷基化试剂换为1，3-二溴甲基苯，其它处理与LH090相同得到化合物LH116。收率12.57％，纯度>95％。

18.将引入侧链为邻硝基苯磺酰基修饰的赖氨酸的位点改为第5及第9个氨基酸，并将烷基化试剂换为1，4-二溴甲基苯，其它处理与LH090相同得到化合物LH117。收率13.96％，纯度>95％。

实施例2：订书针抗菌肽抑制细菌生长的作用

抗菌活性检测，按常规倍比稀释法进行。96孔板第一排每孔加菌液180uL，药液20uL，(药物浓度128ug/mL)每孔设3复孔，以TSB培养基为阴性对照，后面倍比稀释，使最终浓度成倍比下降，37度孵育16-20h，测定各孔吸光度，吸光度无变化的最低浓度为最小抑制浓度(MIC)。

表1.订书针肽抑制细菌增长的作用

由表1可见，订书针抗菌肽具有广谱高效的抗菌活性，且用1，2-二亚甲基苯基连接的订书针肽化合物115对临床耐药的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有更强的抑制作用，可作为抗微生物物质用于制备抗微生物感染制剂。

实施例3：订书针抗菌肽耐血清水解作用

实验方法：将多肽(LH098、LH065、LH115)与25％新鲜人血清(v/v)37℃下孵育(多肽最终浓度为1.28mg/mL)。在不同的时间点(0,1h,2h,3h,6h,9h,12h和24h)取60ul,然后加入120uL含12％三氯乙酸的溶液(水：乙腈1：3)，4℃30min沉淀血清蛋白质。然后以14000rpm离心10min，取上清，采用高效液相色谱法分析。实验结果见图2。

实施例4：抗菌肽LH115及LH065的杀菌动力学

实验方法：将MRSA活化至对数期后，将96孔板中菌液稀释至5*10⁵CFU/well,加入药物(LH115 16ug/mL，LH065 32ug/mL)，在不同的时间点分别取菌液稀释至适当倍数后，取5uL菌液于24孔板上，37摄氏度培养20h，计数24孔板上菌落数目。实验结果见图3和图4所示。

实施例5：订书针肽的抗肿瘤作用

为考察本发明桥联订书针肽的抗肿瘤活性，通过初步抗肿瘤药理试验进行肿瘤生长抑制活性评价，如图5所示。采用肿瘤细胞模型，CCK-8法进行活性筛选试验，(所涉及的试剂及材料均可通过公开渠道获得，这属于本领域的公知常识)试验操作步骤包括：

(1)细胞培养

Raw264.7细胞使用含10％胎牛血清的DMEM培养。

(2)药物配制

所有化合物现配现用，最高浓度为1.28mg/mL，化合物以PBS配制完后置于室温，供使用。给药时再根据所需浓度，用PBS进行逐步稀释。

(3)CCK-8法

取对数生长期的所需细胞，调整为适当浓度后种入96孔培养板，每板100uL(约5000个细胞)，并分别置于37℃、5％CO₂的条件下孵育12h，给药前根据设定的终浓度，用PBS对最高浓度药物进行稀释配制，再将配好的药物依次加入培养板孔内，每孔50uL，使其终浓度分别为128ug/mL、64ug/mL、32ug/mL、16ug/mL、8ug/mL，每个浓度均设3个复孔。阴性对照为等体积培养基，同时设相应浓度的PBS溶剂对照。并且将给药后96孔板培养板分别置于37℃、5％CO₂的条件下孵育24h。

采用CCK-8法：在96孔细胞培养板的每孔中加入10uL的CCK-8，并置于37℃、5％CO₂的条件下孵育2h,使用酶标仪检测各孔OD450值，计算抑制率。

实验结果显示，阳离子桥联订书针肽具有较好的抗癌活性，具有潜在药物用途。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。