吡虫啉抗体特异性结合的噬菌体展示多肽及其用途
阅读说明：本技术 吡虫啉抗体特异性结合的噬菌体展示多肽及其用途 (Phage display polypeptide specifically bound by imidacloprid antibody and application thereof ) 是由 王鸣华 华修德 杜梅 丁园 陈贺 于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,涉及具有与吡虫啉抗体特异性结合的多肽,以及该多肽在检测吡虫啉中的应用。本发明采用噬菌体展示技术,用蛋白A柱纯化的吡虫啉抗体对噬菌体展示随机线十二肽库进行3轮淘选,淘选出与吡虫啉抗体结合的噬菌体克隆；随机挑取若干噬菌体克隆进行扩增和质粒提取,通过噬菌体ELISA方法选择阳性噬菌体克隆,并将阳性克隆进行测序获得多肽序列。本发明还涉及该噬菌体展示多肽在吡虫啉检测中的应用。用该噬菌体展示多肽建立的噬菌体酶联免疫分析方法可用于快速、灵敏、简便和廉价检测环境和农产品中吡虫啉残留。(The invention belongs to the technical field of biology, and relates to a polypeptide specifically bound with an imidacloprid antibody, and application of the polypeptide in detection of imidacloprid. The invention adopts a phage display technology, and performs 3 rounds of panning on a phage display random linear dodecapeptide library by using an imidacloprid antibody purified by a protein A column, and panning phage clones combined with the imidacloprid antibody; randomly picking a plurality of phage clones for amplification and plasmid extraction, selecting positive phage clones by a phage ELISA method, and sequencing the positive clones to obtain a polypeptide sequence. The invention also relates to application of the phage display polypeptide in imidacloprid detection. The phage enzyme-linked immunoassay method established by the phage display polypeptide can be used for quickly, sensitively, conveniently and cheaply detecting imidacloprid residue in environment and agricultural products.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及具有与吡虫啉抗体特异性结合的多肽，包括所述多肽在检测吡虫啉中的应用。
背景技术
吡虫啉是一种烟碱类超高效杀虫剂，并具有触杀、胃毒和内吸等多重作用。由于吡虫啉的广泛、持续和大量的使用导致了许多害虫天敌的死亡，研究发现吡虫啉对稻飞虱的天敌黑肩绿盲蝽和蚜虫的天敌龟纹瓢虫有较大的毒性，且对水生生物、蜜蜂以及土壤中的有益生物均会造成损伤。为预防吡虫啉应用存在的潜在风险，需要一种灵敏、快速、选择性的残留检测方法。
目前对吡虫啉的残留检测，主要采用仪器分析方法(如液相色谱、气相色谱-质谱联用仪等)检测吡虫啉在农产品和农业环境中的残留，仪器检测灵敏度高、准确性强，但相对用时较长、操作复杂，不能满足快速检测大量样品的需求。且全新的农药残留检测体系，对农药残留检测分析技术提出更高的标准和更严格的要求：不只推动着农药残留检测技术向着更加快速、简便、灵敏可靠的检测目标发展，而且逐步由原先的在实验室进行少量室内检测演变为如今的现场及时检测以及实验室的大批次、高通量检测。免疫检测技术具有简便、快速、低成本和可靠的特点，极大的推动了农药残留快速检测技术的发展，为保障农产品的质量安全和环境的生态安全提供重要的工具。由于农药等小分子化学品为单抗原决定簇分析物，整个分子只能和一个抗体结合，所以通常选择竞争模式来建立免疫分析方法。在这种形式中，必须存在与分析物竞争结合抗体的竞争物，这个竞争物通常是将半抗原与蛋白、酶或荧光物等连接制备获得。根据竞争物与免疫抗原结构的同异，可以将分析方法分为同源和异源免疫分析。目前，农药异源竞争物通常采用化学合成的方法制备，系列异源半抗原的化学合成及半抗原与蛋白、酶或荧光物的偶联需要很大的工作量，并且不能预知制备的竞争物是否具有活性，所以存在一定的盲目性。
自噬菌体展示技术报道以来便引起了研究人员的广泛关注，并且成为迄今为止发展最成熟、应用最广泛的抗体筛选技术。该技术已经被广泛应用于各种功能性重组多肽及抗体的高通量筛选。其原理是将编码多肽或外源蛋白的DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面。被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性以利于靶标分子的识别和结合，并使基因型与表型建立直接的联系。导入多种外源基因的一群噬菌体，就构成了一个噬菌体展示库。当噬菌体库与靶标分子即抗体通过3到5轮的“吸附-洗涤-洗脱-扩增”淘选后，与抗体特异性结合的噬菌体就会得到高度的富集。由已经商品化的抗噬菌体的二抗识别，可直接用作竞争物建立异源竞争免疫分析。与化学合成的竞争物相比，具有简单、快捷、安全环保且灵敏度更高的优点。但目前为止，尚未见具有与吡虫啉抗体特异性结合的多肽及其应用的研究和报道。
发明内容
本发明的目的是提供与吡虫啉抗体特异性结合的多肽，及相关多肽在吡虫啉检测中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
(1)将蛋白A柱纯化的吡虫啉抗体包被在酶标板上，用5％脱脂奶粉封闭酶标板，随后将噬菌体展示随机线十二肽库加入酶标板中进行亲和淘选，淘选过程按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的步骤进行，经过3轮的富集淘选，从第一轮到第三轮包被抗体的用量和用于竞争洗脱噬菌体的吡虫啉用量依次减少；
(2)3轮淘选后，挑选30个噬菌体克隆进行ELISA初步鉴定，对于得到的13个阳性克隆进行扩增、质粒提取、测序，共发现2种序列，其序列如SEQ ID NO 1～2所示：His Ser LeuTrp Met Ala Ser Pro Met Pro Gly Tyr和Gln Ile Phe Thr Ser Ser Pro Met Pro AlaMet Val。
本发明所述的多肽可与吡虫啉抗体特异性结合，建立异源竞争ELISA，用于吡虫啉在环境与农产品中的残留检测。
本发明具有以下有益效果：(1)新颖：为国内外首次报道的与吡虫啉抗体特异性结合的多肽；(2)实用：利用本发明提供的噬菌体展示多肽可以快速建立高敏感性的异源竞争ELISA；(3)特异性强：用本发明提供的噬菌体展示多肽建立的竞争ELISA与吡虫啉类似物的交叉反应，除氯噻啉(102％)外，其余均很低；(4)准确度高：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的竞争ELISA在环境和农业样品中的添加回收率为70.1-102.1％，变异系数低于10.2％，符合残留分析标准；(5)灵敏度高：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的竞争ELISA的抑制中浓度(IC50)为0.067ng/mL，检测限(IC10，LOD)为0.024ng/mL。
附图说明
图1是挑选的30个噬菌体克隆噬菌体ELISA(P-ELISA)检测的结果；横坐标为噬菌体克隆，纵坐标为OD450值；
图2是P-ELISA检测吡虫啉，OD值与吡虫啉浓度的曲线；横坐标为吡虫啉的浓度，单位为ng/mL；纵坐标为OD450值。
具体实施方式
本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：
主要实验材料：
蛋白A柱纯化吡虫啉单克隆抗体由南京农业大学，植物保护学院，农药残留与环境毒理实验室制备；噬菌体展示随机线十二肽库从NEB公司购买。
主要试剂：
蛋白胨(OXOID)、酵母提取物(OXOID)、琼脂(Amresco)、琼脂糖(Amresco)、四甲基联苯胺(Sigma)、IPTG(Amresco)、Xgal(Amresco)、PEG8000(Sigma)、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(GE)
主要试剂配方：
1、LB培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，高压灭菌，室温贮存；
2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；
3、顶层琼脂：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，7g琼脂粉。高压灭菌，固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；
4、四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于50％乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；
5、LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；
6、封闭液：含有5％脱脂奶粉，0.14M，pH 7.4PBS，过滤除菌，4℃保存；
7、PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5M NaCl，高压灭菌，室温贮存；
8、IPTG/Xgal配方：将1.25g IPTG(isopropylβ-D-thiogalactoside)和1g Xgal溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光贮存；
9、显色液(四甲基联苯胺-H2O2底物溶液)：25mL 0.1M，pH 5.5柠檬酸盐缓冲液中加入0.4mL，6mg/mL四甲基联苯胺，0.1mL 1％H2O2。
实施例1吡虫啉抗体特异性结合多肽的淘选和制备
1、与吡虫啉抗体特异性结合的噬菌体克隆的淘选
按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，经过3轮的淘选，具体操作如下：
(1)取100μL 100μg/mL蛋白A柱纯化的吡虫啉抗体加入酶标板中，4℃包被过夜，共三个孔；
(2)取少量大肠杆菌ER2738涂在LB+Tet平板上，37℃过夜培养；
(3)将步骤(1)的酶标板用PBST洗涤3遍，每孔加入300μL 5％脱脂奶粉，37℃孵育2小时，用PBST洗涤3遍，存放于4℃备用；
(4)将酶标板每孔加入100μL 2×1011的噬菌体(含5％脱脂奶粉)，室温轻微震荡1小时；
(5)取20mL LB培养基加入250mL三角瓶中，加入ER2738单菌落，37℃培养至OD600为0.01至0.05；
(6)将步骤(4)的微孔用PBST洗涤10遍，加入100μL 10μg/mL的吡虫啉进行洗脱，室温轻微震荡1小时；
(7)收集步骤(6)中的洗脱缓冲液，加入到5％脱脂奶粉包被的孔，室温轻微震荡1小时，去除非特异性结合。收集上清液，4℃保存；
(8)取少量洗脱液测定噬菌体的滴度(操作方法见滴度测定)；
(9)剩余的洗脱缓冲液用于扩增，将剩余的洗脱缓冲液加入步骤(5)中的三角瓶中，37℃摇床250rpm培养4至4.5小时；
(10)将扩增后的噬菌体移入50mL的离心管中，4℃12000g离心25分钟，取上清。重复离心一次；
(11)取上层80％的上清放入离心管中，加入上清1/6体积的20％PEG-8000/2.5MNaCl，混匀，4℃静置过夜；
(12)将(11)步骤的混合液4℃12000g离心15分钟，去上清，重复一次；
(13)取300μL PBS溶解步骤(12)的沉淀物用于下一轮的淘选，也可放于4℃短期(大约三周不会影响滴度)保存，或者加入甘油，放于-20℃长期保存；
(14)步骤(1)到(13)为一轮淘选和扩增，第二轮和第三轮的淘选和扩增步骤同上，步骤(1)中使用的吡虫啉抗体浓度分别为50μg/mL和25μg/mL，步骤(6)中使用的吡虫啉浓度分别为5μg/mL和2.5μg/mL。
噬菌体滴度测定操作步骤如下：
(1)取4mL LB培养基，加入4μL 20mg/mL的四环素，取大肠杆菌ER2738单菌落加入其中，37℃培养至OD600为0.5；
(2)将LB/IPTG/Xgal平板放入37℃培养箱中预热1小时以上；
(3)取5mL融化的顶层琼脂(LB+7g/L琼脂糖)放入试管中，并保持试管温度在45℃；
(4)将需要测滴度的噬菌体进行稀释，通常洗脱缓冲液稀释10至103倍，扩增之后的噬菌体稀释108至1011倍；
(5)取10μL稀释后的噬菌体加入到180μL步骤(1)的大肠杆菌培养液中，混匀；
(6)将步骤(5)的混合液加入步骤(3)中的顶层琼脂中，混匀；
(7)将步骤(6)的混合液均匀的加入到步骤(2)中的平板上，室温冷却，放入37℃培养箱中过夜培养；
(8)根据平板上蓝色斑点的数量来计算所测噬菌体的滴度。
整个淘选过程的洗脱噬菌体和扩增后的噬菌体的个数如表1所示。
表1与吡虫啉抗体结合的噬菌体展示多肽淘选情况(线十二肽库)
2、噬菌体克隆的筛选及其展示多肽序列的测定
在完成最后一次淘选之后，对洗脱液进行滴度测定，选择蓝色斑点少于100个的LB/IPTG/Xgal平板，从中挑选出30个克隆用于扩增和鉴定。操作程序如下：
(1)用LB培养基将过夜摇培的大肠杆菌ER2738以1∶100稀释，加入到含有2ml培养基的48个试管中；
(2)从LB/IPTG/Xgal平板挑选出30个克隆放入试管中，37℃摇床培养4.5至5小时；
(3)将培养液4℃12000g离心10分钟，上清用于噬菌体酶联免疫分析(P-ELISA)验证(操作方法见P-ELISA)，沉淀用质粒提取试剂盒提取质粒，送测序公司进行序列测定。
噬菌体酶联免疫分析操作步骤：
(1)包被：用PBS缓冲液将吡虫啉抗体稀释后加入酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜；
(2)洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH 7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；
(3)封闭：每孔加入300μL 3％脱脂奶粉，37℃孵育2小时；
(4)洗板：同(2)；
(5)加入分析物和噬菌体：每孔加入50μL PBS或50μL 10μg/mL吡虫啉标准品溶液，再加入50μL的噬菌体多肽，室温轻微震荡1小时，PBST洗涤5次，并平行设置阴性对照。
(6)洗板：同(2)；
(7)加入酶标二抗：每孔加入100μL经1∶5000倍PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体，室温轻微震荡1小时；
(8)洗板：同(2)；
(9)显色：每孔加入100μL现配制的显色液，37℃温箱孵育15分钟；
(10)终止：每孔加50μL 2mol/L的H2SO4溶液；
(11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值。
挑选的30个噬菌体克隆中13个克隆在P-ELISA检测吡虫啉时的OD450值显著降低(图1)。将上述13个克隆的质粒送测序，测序引物为5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’，测序结果共发现2种序列，其氨基酸序列如表2中SEQ ID NO 1～2所示。
表2噬菌体展示多肽的氨基酸序列
3、P-ELISA对吡虫啉的检测
3.1方法原理
采用间接竞争免疫分析方法。将吡虫啉抗体包被于96孔酶标板上，封闭后同时加入待测物和噬菌体多肽，免疫反应结束后，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(只能与结合在固相抗体上的噬菌体结合)，随后加入酶反应底物，根据显色后的吸光值大小对待测物的含量进行分析；显色程度深浅与待测农药的浓度成反比，颜色越深，吸光值越高，待测物含量越低。因而可根据已知量农药的标准曲线和待检样品的吸光值，推算出待测农药的浓度。
3.2抗体和噬菌体展示多肽的工作浓度
P-ELISA抗体和噬菌体展示多肽工作浓度的确定用方阵滴定法，选择OD值为1.0～2.0时的浓度，即抗体20μg/mL、SEQ ID NO 2噬菌体3×109pfu/mL为最适工作浓度。
(1)包被：用PBS缓冲液将吡虫啉抗体稀释至20μg/mL加入96孔酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜；
(2)洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH 7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；
(3)封闭：每孔加入300μL 3％脱脂奶粉，37℃孵育2小时；
(4)洗板：同(2)；
(5)加入分析物和噬菌体：每孔加入50μL待测样品，再加入50μL，6×109pfu/mL的噬菌体多肽，室温轻微震荡1小时，PBST洗涤5次，并平行设置阳性对照和阴性对照。
(6)洗板：同(2)；
(7)加入酶标二抗体：每孔加入100μL经1∶5000倍PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体，室温轻微震荡1小时；
(8)洗板：同(2)；
(9)显色：每孔加入100μL新鲜配制的显色液，37℃温箱孵育15分钟；
(10)终止：每孔加50μL 2mol/L的H2SO4溶液；
(11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值。
3.4标准曲线和灵敏度
根据OD450值与吡虫啉浓度作图即得到标准曲线(图2)，计算抑制中浓度(IC50)及最低检测限(IC10，LOD)分别为0.067ng/mL，LOD为0.024ng/mL。
3.5特异性
在最优免疫反应条件下，配制结构类似化合物的梯度标准溶液，建立结构类似化合物的标准曲线并计算交叉反应率(CR％)。交叉反应率越低，反应的特异性越强，对吡虫啉检测的干扰越小。P-ELISA除与氯噻啉有交叉反应外(CR％＝102％)，与其它新烟碱类杀虫剂没有比较明显的交叉反应。
3.6样品添加检测
3.6.1样品处理
称取粉碎混匀后的麦粒、稻米、苹果、黄瓜和土壤样品10g，装入50mL离心管中，加入15mL含50％甲醇的PBS缓冲液混匀，涡旋5min，超声15min，再涡旋5min，4000rpm离心5min，将上清全部转移至25mL容量瓶内，用PBS缓冲液定容至25mL。再用PBS缓冲液稀释40倍用于检测。
3.6.2样品检测
样品检测步骤参考3.3。经分析可知，该P-ELISA的吡虫啉回收率为70.1-102.1％，相对标准偏差为3.3-10.2％。
实际样品中吡虫啉残留量检测参照3.6方法进行。
本发明建立的吡虫啉P-ELISA方法符合吡虫啉残留分析标准。该方法可用于环境和农产品中吡虫啉的残留检测。