具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片

文档序号：1668184 发布日期：2019-12-31 浏览：36次 >En<

阅读说明：本技术 具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片 (Self-driven micro-fluidic chip with integrated processing and amplification color development functions ) 是由曹志黄倢董宣邹培卓万晓媛李晨于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物检测技术领域,尤其涉及一种具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片。所述芯片由若干病原检测单体组合而成；病原检测单体上各样液池由通道联通,所述通道通过遮蔽技术由纳米材料构建。本发明可以直接从组织裂解液中一步到位进行扩增,能有效降低样品检测成本,提高检测效率,保障检测准确性,从根本上增进对虾种业的疫病筛查能力。(The invention belongs to the technical field of microbial detection, and particularly relates to a self-driven micro-fluidic chip with integrated processing and amplification color development functions. The chip is formed by combining a plurality of pathogen detection monomers; the various liquid pools on the pathogen detection monomer are communicated by a channel, and the channel is constructed by a nano material through a shielding technology. The invention can directly amplify from the tissue lysate in one step, effectively reduce the sample detection cost, improve the detection efficiency, ensure the detection accuracy and fundamentally improve the epidemic disease screening capability of the shrimp breeding industry.)

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片。

背景技术

从我国对虾养殖病害防控发展的现状和趋势来看，以生物安保为指导促使我国对虾养殖业的技术升级与结构调整是重点，而生物安保工作的开展，需要更大样品量、更多病原的准确、灵敏、低成本现场即时检测(Point-of-care testing,POCT)技术。理想的POCT分析集样品制备、扩增、检测于一体，并且能够摆脱检测环境的限制。聚合酶链式反应(PCR)是目前高灵敏度分子检测的标准，然而并不适合快速便携的现场操作；因为它通常涉及需要外部电源的实验室设备(如热循环仪和离心机)、几个小时的测定时间、多个手动样品制备步骤和训练有素的技术人员。因此，将集中式实验室测试转变为现场养殖环境中普遍存在的核酸检测微型化和实用化研究显得尤为重要。

微型化和实用化的第一个选择是降低所需机械的复杂性。全自动一体化Real-time PCR仪已经商业化(如，GeneXpert,Cepheid)；然而，高精密仪器带来的昂贵检测成本仍是大规模采用的障碍。核酸恒温扩增技术(Nucleic acid isothermal amplificationtechnology,NAIAT)因反应温度的恒定性、检测程序简单快速、摆脱了高精密的仪器等优势，非常适用于POCT。微流控芯片技术的发展成果正在为医学检测领域注入新的活力，能够将核酸检测的常规实验室技术全部集成在一个很小的芯片中，实现“Sample to answer”的分析目标。微流控芯片技术与NAIAT的高效整合有望为开发低成本、便携式的核酸(RNA和DNA)快速检测技术带来革命性的突破。

进一步微型化和实用化的选择是简化从样品输入到结果输出的整个过程。首先要解决的问题是如何利用非常简单的微流体芯片结构，在无需任何外部设备驱动下，实现微流体的自驱动；其次需要一种方法，该方法可以将试剂浓缩成适合微孔的高度限定的点状印迹，使得多重反应可以直接在微孔中开始而没有交叉污染。

发明内容

本发明要解决的技术问题是基于核酸扩增的病原检测试剂盒和高通量检测芯片均离不开样品处理，虽然近年来各种热循环扩增或等温扩增技术有很多新的发展，但扩增模板的提取技术一直缺少更简便快捷的突破，成为影响各种基于核酸扩增技术的检测试剂盒或芯片应用的瓶颈。现有各种核酸提取试剂盒成本高，提取操作复杂，还需依赖一定的仪器设备，主要适用于科研工作，一次提取的核酸量就可用于成千上万次检测反应，用于大批量样本的超微量检测时过于“浪费”。当前有芯片实验室在微流控芯片上研发了核酸提取技术，但需要借助外力驱动和精密流道设计，依然存在高昂成本以及复杂操作过程，限制了其在现场即时检测中的应用。

为了解决这些问题，我们提供了一种集成核酸提取到恒温扩增功能的自驱动微流控芯片实验室，可以直接从组织裂解液中一步到位进行扩增，能有效降低样品检测成本，提高检测效率，保障检测准确性，从根本上增进对虾种业的疫病筛查能力。该技术采用多种纳米材料遮蔽喷绘构造微流体自驱动通道，对微流体通道结构表面进行分子改性，建立通道的核酸提取的层析通道，并结合缓冲液成分优化和通道局部精确温控处理，以实现微流体自驱动的芯片核酸提取功能。通过扩增产物的直接显色来指示扩增反应，直观简便；通过预包埋技术使所需试剂固定于芯片的检测池中；通过自驱动微流控实现样品经核酸提取通道自动流入检测池，大大简化操作流程；通过多路检测池分支的精确设计，实现多种病原的检测；在芯片实验室设计多个重复单元，实现对多样品的检测能力。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片，由若干病原检测单体组合而成；病原检测单体上各样液池由通道联通，所述通道通过遮蔽技术由纳米材料构建，通过筛选改性材料来调整流体与芯片表面的相互作用，并结合流体通道的对称性设计，利用微流体的毛细作用实现流体的自驱动，使样品微液滴得以自动流经各通道和样液池。

进一步的，如图1和图2所示，所述自驱动微流控芯片可以共设置有6样品组合的7病原检测单体结构，多个重复单元的设计可以实现对多样品的检测能力。其中每个单体结构的样液池包括按液体流向依次排布的加样池1、核酸变性池2、扩增检测池3和溢流池4；加样池1、核酸变性池2之间为核酸提取通道5。利用微流体的毛细作用实现自驱动，使加样池内的样品微液滴得以自动流经核酸提取通道进入核酸变性池，然后经由通道进入扩增检测池，而多余液体可以进入溢流池；在芯片的核酸提取通路后设计集成多路分支的核酸等温扩增检测池，扩增检测池中加入用于核酸恒温扩增反应体系、目标基因特异性引物、固定化酶制剂、冻干保护剂和扩增反应指示剂，建立核酸提取、核酸扩增和扩增反应显色等功能集成的自驱动微流控芯片实验室。

进一步的，核酸提取通道5结构表面利用固相可逆化固定(Solid-phasereversible immobilization,SPRI)原理进行分子改性。经过分子改性后的微通道表面羧基化，配合最佳比例的结合缓冲液可以实现样品核酸的提取和纯化。

进一步的，所述芯片分为上下两层，所有通道、核酸变性池、扩增检测池和溢流池均设置在芯片下层，以便预先构建超亲水通道、核酸变性通道以及在扩增检测池预包埋检测试剂；加样池贯穿芯片上下层。

进一步的，扩增检测池3设有若干个，围绕核酸变性池2按中心对称呈辐射状圆形分布，其***为溢流池。通过多路检测池分支的精确设计，可以实现多种病原的检测。

进一步的，如图3所示，所述芯片为长方形，尺寸为25×80mm；芯片上、下层的厚度均为2.0mm；通道的宽度为0.1mm，深度为0.1mm；核酸变性池直径为2.0mm，深度为1.0mm；扩增检测池直径为1.0mm，深度为1.0mm；溢流池直径为1.1mm，深度为1.0mm；加样池直径为2.0mm，深度为2.0mm；芯片的材质为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。尺寸越大，需要的检测体系的体积就增加，成本就高；而尺寸越小，成本就低，但制作难度相应就增大；本发明所限定的尺寸是在现有技术条件下能够实现的最小尺寸，也是满足检测最低限最终反应体积。

进一步的，所述构建通道的纳米材料为超亲水ZXL-CQS纳米自洁液和超疏水ZXL-CSS纳米自洁液。这二者均是能够使得通道表面超亲水或超疏水的效果最佳的材料，得到的芯片品质最佳。

一种上述自驱动微流控芯片的制备方法，包括：根据芯片结构图设计、加工、组配模具，浇注聚甲基丙烯酸甲酯，固化后清洁芯片；对芯片实验室通道结构表面进行分子改性，即上层基片喷绘超疏水纳米材料，下层基片喷绘超亲水纳米材料；构建核酸的层析通道，即在室温下，对微流体通道进行表面上的氨基(NH₂-)改性；利用冻干工艺向检测池内预包埋检测试剂；芯片上层、下层通过低温键合或粘合方式组装。

进一步的，检测池中包埋的检测试剂包括用于核酸恒温扩增常规试剂、特异性引物和冻干保护剂；上述冻干保护剂包括海藻糖和牛血清白蛋白，冻干前检测试剂中海藻糖的质量浓度为0.1～0.15g/mL，牛血清白蛋白的质量浓度为0.01～0.02g/mL。

本发明还提供了基于上述自驱动微流控检测芯片的应用，用于对虾样本中病原体的检测。

其中，对虾7种病原包括对虾5种DNA病毒为对虾白斑综合症病毒(White spotsyndrome virus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus，IHHNV)、十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus1，DIV1))、急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosis disease,AHPND)、对虾肠孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)；

对虾2种RNA病毒为桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus,CMNV)。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)本发明首次将纳米改性材料应用于对芯片流体自驱动通道的改性，提出通道表面分子改性的核酸层析提取技术，为自驱动微流控芯片核酸提取的难题提供了一条简便的解决途径；通过筛选改性材料来调整流体与芯片表面的相互作用，并结合流体通道的对称性设计，实现流体的自驱动，摆脱了如离心机、注射泵，不需要研发和生产成本昂贵的精密流体通道。

2)本发明筛选出的最佳微流控芯片试剂预包埋工艺，将极大简化检测操作流程，使得多重反应可以直接在微孔中开始而没有交叉污染。

3)本发明将自驱动微流控技术、样品核酸提取的通道层析技术、试剂预包埋冻干技术、酶固定化技术、超微量NAIAT技术、扩增反应实时显色技术在芯片实验室上实现多功能的有机集成，开发自驱动集成微流控现场即时低成本检测芯片实验室，直接从对虾组织样品中对多种病原进行简单快速、灵敏特异、同步即时检测，有望成为实用化的低成本、便携式、一体化的高灵敏度核酸检测技术。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明7病原检测单体结构示意图；

图2是本发明6样品组合模式图；

图3是实施例1自驱动微流控芯片的结构示意图；

图中，加样池1、核酸变性池2、扩增检测池3、溢流池4、核酸提取通道5。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，均采用分析纯试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配置。

芯片注塑工艺用的设备住友SE180DU-C360，购自Sumitomo HeavyIndustries.Ltd.,JAPAN。

LY0-0.5型东富龙冷冻干燥机，购置上海东富龙科技有限公司。

超亲水ZXL-CQS纳米自洁液和超疏水ZXL-CSS纳米自洁液，购自莱阳子西莱环保科技有限公司。

卡夫特K-303无影胶透明亚克力粘合剂，购自广东恒大新材料科技有限公司。

WSSV、IHHNV、DIV1、AHPND、EHP、TSV、CMNV阳性及无特定病原(Special pathogenfree,SPF)的凡纳滨对虾组织，均由中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海水养殖病害防治重点实验室保存并提供。

7种对虾DNA病原、RNA病原的阳性质粒构建为选取GenBack所报道的相关序列片段采用人工基因合成的方法制备(Takara，大连)。将上述7种对虾DNA或RNA病原的特异性核酸片段克隆到pMD18-T载体上，分别构建pMD18-WSSV、pMD18-IHHNV、pMD18-DIV1、pMD18-AHPND、pMD18-EHP、pMD18-TSV和pMD18-CMNV共7种重组质粒，所构建质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确定为阳性克隆。

Bst 2.0 DNA聚合酶及配套10×Bst buffer和100mM MgSO4(#M0538L)，购自NEB。

RTx反转录酶(#M0380L)，购自NEB。

5M Betaine(非盐酸盐)：购买甜菜碱(C5H11NO2，分子量117.15)，分析纯试剂。称取甜菜碱117.15g，用100mL无RNase水溶解后，在专用pH计上用1M HCl调pH至8.0±0.2，加无RNase水定容至200mL。分装冻存于-20℃。

350mM MnCl2：购买无水氯化锰(MnCl2,MW 125.91)或者四水氯化锰(MnCl2·4H2O,MW197.91)，分析纯。称取4.407g无水氯化锰或者6.927g四水氯化锰，溶解于80mL无RNase水中，定容至100mL，分装为1mL/支，冻存于-20℃。

3.5mM Caclein：购买钙黄绿素(C30H26N2O13,MW 622.55)或钙黄绿素钠(Na2C30H26N2O13,MW 666.5)，分析纯。称取43.58mg钙黄绿素，加到6mL DMSO，溶解后，加约14mL无RNase水定容到20mL或者称取46.66mg钙黄绿素钠，溶解到20mL无RNase水中。所配溶液分装为0.5mL/支，冻存于-20℃。

SEMP液：取1M Tris·HCl(pH8.0)1mL、700mM EDTA 10mL、10％SDS 10mL、巯基乙醇0.5mL、平衡酚20mL、双蒸水调制100mL，保存于4℃。

7种对虾DNA病原、RNA病原的特异性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。上述7种病原的特异性引物序列具体如表1所示：

表1.对虾病原特异性引物序列

实施例1：

一种具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片，由若干病原检测单体组合而成；病原检测单体上各样液池由通道联通，所述通道通过遮蔽技术由纳米材料构建。如图1和图2所示，所述自驱动微流控芯片可以共设置有6样品组合的7病原检测单体结构。其中每个单体结构的样液池包括按液体流向依次排布的加样池1、核酸变性池2、扩增检测池3和溢流池4；加样池1、核酸变性池2之间为核酸提取通道5。核酸提取通道5结构表面利用固相可逆化固定(Solid-phase reversible immobilization,SPRI)原理进行分子改性。7个扩增检测池3围绕核酸变性池2按中心对称呈辐射状圆形分布，其***为溢流池。

所述芯片分为上下两层，所有通道、核酸变性池、扩增检测池和溢流池均设置在芯片下层，加样池贯穿芯片上下层。

如图3所示，所述芯片为长方形，尺寸为25×80mm；芯片上、下层的厚度均为2.0mm；通道的宽度为0.1mm，深度为0.1mm；核酸变性池直径为2.0mm，深度为1.0mm；扩增检测池直径为1.0mm，深度为1.0mm；溢流池直径为1.1mm，深度为1.0mm；加样池直径为2.0mm，深度为2.0mm；芯片的材质为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。所述构建通道的纳米材料为超亲水ZXL-CQS纳米自洁液和超疏水ZXL-CSS纳米自洁液。

本实施例的自驱动微流控芯片实验室的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、微流控芯片实验室的设计与加工：

使用开模注塑技术，依据经计算机数控(computer numerical control,CNC)加工验证合格的芯片3D模型文件和2D工程图，出模具分体部件加工图；加工模具，检测模具，组配模具。将模具安装到注塑成型机上试制，注塑PMMA，待芯片固化后，利用等离子机清洗上、下层基片。然后，上层基片采用超疏水ZXL-CSS纳米自洁液喷绘，下层基片采用超亲水ZXL-CQS纳米自洁液喷绘。

步骤2、微流控芯片实验室核酸提取通道的构建：

在室温下，将2％APTES(3-Aminopropyltriethoxysilane,Sigma)溶于95％丙酮中，注入到微通道中2小时，对微流体通道进行表面上的氨基(NH2-)改性。表面氨基化反应取决于用氧等离子体处理产生的羟基。据报道，PMMA上的羟基将在1小时后消失。因此，在将PMMA层附着在具有氧等离子体处理的玻璃衬底上之后立即执行该步骤。用丙酮冲洗微通道以除去未反应的试剂。然后，10mM NHS(N-hydroxysuccinimide,Sigma)和20mM EDAC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,Sigma)混合均匀后注入氨基化的芯片通道，在室温下孵育1h后，活化羧基可共价结合到微通道表面。

步骤3、微流控芯片实验室检测池检测试剂预包埋：

如图3所示，微流控芯片实验室的检测单元设置辐射状环形分布的检测池，分别包埋用于检测WSSV、IHHNV、DIV1、AHPND、EHP、TSV和CMNV等7种病原的试剂；可构建更多的检测池以便对更多的病原及阳性和阴性质控进行检测。

按照表2所示，将检测试剂、特异性引物以及冻干保护剂混合均匀后加入相应的检测池中，置于LY0-0.5型东富龙冷冻干燥机进行冻干处理，具体冻干工艺如下：①预冻1小时(前箱两个探头为-40℃以下，后箱-45℃以下)；②对前后箱进行抽真空，当前箱真空度显示达到所需真空度0.08～0.10mbar即可；调整界面手动加热温度-5℃，当制品温度逐渐接近导油温度，真空度曲线有明显弯曲后，一次升华结束；③一次升华结束，对产品进行加热提温。前箱温度升至-10℃时，开始提温；调整界面手动加热温度-5℃，当制品温度升至-5℃时，保温计时1.5小时。

表2.扩增检测池预包埋试剂表

步骤4、自驱动微流控芯片的键合：

将卡夫特K-303无影胶透明亚克力粘合剂精细涂抹于芯片各个粘接处，涂均匀薄层后芯片剩下层基片粘接在一起，使用紫外线灯光照射5min后键合完成，成品包装，置于-20℃以下保存。

二、微流控芯片中核酸提取方法的建立

步骤1、结合缓冲液各成分比例的筛选

结合缓冲液包括聚乙二醇(PEG)和NaCl。研究表明，低浓度的PEG倾向于沉淀更大和更不等距的结构。

设计两因素四水平的正交试验：PEG(10％、20％、30％、40％)和NaCl(0.01M、0.05M、0.1M、0.2M)。采用核酸荧光染色剂(YO-PRO^TM-1 Iodide(491/509))标记爱德华氏菌gDNA，在荧光显微镜下对不同比例缓冲液抽提样本核酸的效果进行动态观察，筛选出最优化的抽提核酸用缓冲液比例。采用TaqMan探针实时荧光定量PCR法将经上述方案提取的核酸与商品化试剂盒提取的核酸进行比较，分析芯片中核酸提取方法的得率。结果如表3所示：结合缓冲液为10％的聚乙二醇(PEG)和0.1M的NaCl时，微流控芯片提取核酸的灵敏度最高。

表3.不同核酸提取方法对比结果

三、自驱动微流控芯片对目标基因检测的分析

步骤1、对目标基因检测的特异性分析

取上述制备而成的自驱动微流控芯片，选取经实验室保存的WSSV、IHHNV、DIV1、AHPND、EHP、TSV和CMNV感染的各对虾组织核酸作为待检样本依次加入。待各检测池充满后，用硅胶贴封堵上层基片的进样池；将封堵后的芯片置于65℃反应45min。基于使用的荧光染料性质，反应结果可在紫外灯激发下判读，根据检测结果判断微流控芯片对目标基因检测的特异性。检测结果未见假阳性和假阴性结果，说明所述检测方法特异性强。

步骤2、对目标基因检测的灵敏度分析

采用世界动物卫生组织(OIE)《Manual ofDiagnostic Tests forAquaticAnimals》检测WSSV、IHHNV、AHPND、TSV的Tag Man探针实时荧光定量PCR法对已知浓度的各病原核酸进行检测(具体方法详见http://www.oie.int/en/animal-health-in-the-world/information-on-aquatic-and-terrestrial-animal-di seases/)，根据标准曲线计算每微升样本核酸的拷贝数。剩余3种病原核酸的拷贝数根据相应参考文献《Detectionand quantification ofshrimp hemocyte iridescent virus by TaqMan probe basedreal-time PCR》、《虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测》、《Development of a TaqMan real-time RT-PCR assay fordetection ofcovert mortality nodavirus(CMNV)in penaeid shrimp》建立的检测DIV1、EHP、CMNV的Tag Man探针实时荧光定量PCR法进行计算。

分别将106copies/μL的各病原核酸进行10倍梯度稀释至101copies/μL，等比例混合每个梯度的各病原核酸，依次加入自驱动集成微流控芯片，采用“步骤1”所述方法进行检测。根据检测结果来分析微流控芯片对目标基因检测的灵敏度。检测结果表明：该系统的检测灵敏度对对虾DNA病原可达102拷贝，对虾RNA病原可达103拷贝。

步骤4、临床样本核酸的检测：

1)由中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物疾病控制与分子病理学实验室从全国范围采集不同地区的发病对虾样本40份，对虾组织均匀切块(约50mg)，放入相应编号的1.5mL EP管中，样本管中加入10％的聚乙二醇(PEG)和0.1M的NaCl，浸没组织样本，匀浆1-3min，至无任何组织块残留。取组织研磨上清液分别加入至各样本组合单元的进样池，样本将通过核酸提取通道自驱动至各个检测池并将其填满。采用“步骤1”所述方法进行检测。与标准的实时荧光定量PCR检测方法进行对比，确定诊断特异性(Diagnosticspecificity,DSp)、诊断灵敏度(Diagnostic sensitivity,DSe)和重复性(Repeatability)。

检测结果如表4所示：与TaqMan探针qPCR相比，自驱动微流控芯片对7种病原菌的DSe值在75％～100％之间，DSp值为100％，Kappa值在0.84～1.00之间。结果表明，自驱动微流控芯片与TaqMan探针qPCR有较高的检测一致性。

表4.自驱动微流控芯片实验室和TaqMan探针qPCR检测对比结果

注：如果0＜Kappa≤0.40，则说明诊断试验的可重复性差；如果0.40＜Kappa＜0.75，则说明具有中、高度可重复性；如果Kappa≥0.75，那么该诊断试验就具有极好的可重复性。

当然，上述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定对本发明的实施例范围。本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片

<130> 20190920

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA