阅读说明：本技术 一种有序定向共固定的酶膜反应器及其制备方法和应用 (Ordered oriented co-immobilized enzyme membrane reactor and preparation method and application thereof ) 是由 叶鹏 祝黛莲 于 2019-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种有序定向共固定的酶膜反应器及其制备方法和应用,基于渗透汽化膜组件,所述渗透汽化膜组件包括复合有微孔滤膜的渗透汽化膜,所述微孔滤膜上按照酶催化级联反应顺序依次固定有反应所需的组合酶的固定化酶,所述组合酶为辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的组合、酪氨酸酶和碱性磷酸酶的组合、长链醇氧化酶和ω-转氨酶的组合以及乙醇脱氢酶、环己酮单加氧酶和脂肪酶的组合中的任一种,有利于提高催化反应效率,将固定化酶集合于一张微孔滤膜上,提高多步催化中间产物转移效率；通过设置微孔滤膜使得反应与分离一体,利于反应平衡向有利的方向移动；反应条件温和,酶固定化方法较为简单。(the invention discloses an orderly oriented co-immobilized enzyme membrane reactor and a preparation method and application thereof, based on a pervaporation membrane component, the pervaporation membrane component comprises a pervaporation membrane compounded with a microporous filter membrane, immobilized enzymes of combined enzymes required by reaction are sequentially fixed on the microporous filter membrane according to an enzyme catalysis cascade reaction sequence, the combined enzymes are any one of a combination of horseradish peroxidase and glucose oxidase, a combination of tyrosinase and alkaline phosphatase, a combination of long-chain alcohol oxidase and omega-transaminase and a combination of alcohol dehydrogenase, cyclohexanone monooxygenase and lipase, and are beneficial to improving the catalytic reaction efficiency, the immobilized enzymes are integrated on one microporous filter membrane, and the transfer efficiency of multi-step catalytic intermediate products is improved; reaction and separation are integrated by arranging the microporous filter membrane, so that the reaction balance is favorably moved to a favorable direction; the reaction condition is mild, and the enzyme immobilization method is simpler.)

一种有序定向共固定的酶膜反应器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于反应器技术领域，具体来说涉及一种有序定向共固定的酶膜反应器及其制备方法和应用。

背景技术

酶作为生物催化剂，能够提高生物体内发生的一系列广泛而多样的化学反应的速率。其参与生命必需的重要化学反应过程，如 DNA 复制和转录、蛋白质合成、初级和次级代谢、信号转导和细胞防御机制，对于生命体而言是不可或缺的组成部分。酶被广泛应用于生物催化、生物传感和生物医学装置等领域。但是，酶由于其存在热稳定性低，有机溶剂稳定性差，成本高，可重复利用性差等问题，使得其广泛应用受到了极大的阻碍。

酶固定化技术是克服游离酶缺点的有效方法之一，在提高酶在储存和反应条件下的稳定性方面显示出非常好的效果。人们通常利用酶固定化技术将其固定在不同的大分子载体上，然后制备成固定化酶反应器，这样可缩短酶催化反应的时间，并提高酶的重复利用性，但是传统的固定化酶反应器的转化效率较低，制备固定化酶反应器的方法较为复杂。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有的固定化酶反应器转化效率低的问题，提供一种有序定向共固定的酶膜反应器。

本发明的目的之二在于克服现有的固定化酶反应器的制备方法复杂的问题，提供所述有序定向共固定的酶膜反应器的制备方法。

本发明的目的之三在于提供所述有序定向共固定的多酶反应器的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种有序定向共固定的酶膜反应器，基于渗透汽化膜组件，所述渗透汽化膜组件包括复合有微孔滤膜的渗透汽化膜，所述微孔滤膜上按照酶催化级联反应顺序依次固定有反应所需的组合酶的固定化酶，所述组合酶为辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的组合、酪氨酸酶和碱性磷酸酶的组合、长链醇氧化酶和ω-转氨酶的组合以及乙醇脱氢酶、环己酮单加氧酶和脂肪酶的组合中的任一种。

优选地，所述固定化酶的有机大分子载体由金属有机骨架材料（MOF）制成。

优选地，所述金属有机骨架材料（MOF）为ZIF-8纳米粒子。

优选地，所述渗透汽化膜为聚二甲氧基硅氧烷/聚偏氟乙烯（PDMS/PVDF）复合膜，所述微孔滤膜为PVDF膜，所述固定化酶采用死端过滤的方法固定在微孔滤膜上。

优选地，所述PVDF膜的孔径为1~3 μm，单位面积PVDF膜上所有固定化酶的固定量为0.1~0.5 mg/cm²。

优选地，所述有序定向共固定的酶膜反应器的渗透通量为21~22 g·m^-2·h^-1。

一种有序定向共固定的酶膜反应器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

第一步，制备组合酶的固定化酶溶液

步骤1：将组合酶分别溶解于去离子水中得到多种酶溶液；

步骤2：将步骤1所得的多种酶溶液分别与混合溶液混合，室温下反应30min后静置3h，得到多种反应液，所述混合溶液包括硝酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液；

步骤3：将步骤2所得的多种反应液均以6000rpm离心10min，分别收集得到多种白色粉末；

步骤4：用去离子水分别将步骤3所得多种白色粉末分别洗涤3次后，再将其分别分散在去离子水中进行冷冻干燥，收集得到多种呈白色粉末状的固定化酶；

步骤5：将多种白色粉末分别再次放入去离子水中，超声分散得到组合酶的固定化酶溶液；

第二步，死端过滤固定及复合

将第一步所得的组合酶的固定化酶溶液按照顺序通过死端过滤固定于微孔滤膜上，然后用去离子水洗涤至少两次，然后将微孔滤膜复合于渗透汽化膜上，最后将渗透汽化膜固定于渗透汽化膜组件中。

优选地，所述步骤1中，任一酶溶液的浓度为（3.0-5.2）g/L；所述步骤2中，硝酸锌溶液、2-甲基咪唑溶液与任一酶溶液的体积比为2:20：（1-2）；硝酸锌溶液的浓度为0.25-0.36mol/L，2-甲基咪唑溶液的浓度为1.11-1.42mol/L。

有序定向共固定的酶膜反应器的应用，基于所述有序定向共固定的酶膜反应器，所述有序定向共固定的酶膜反应器所述酶膜反应器一侧还设有储液罐，所述酶膜反应器通过进料管和料液泵与储液罐连接，同一侧还通过第一出料管与储液罐连接；所述酶膜反应器的另一侧依次设有冷阱、干燥塔、缓冲瓶和真空泵，所述酶膜反应器通过第二出料管与冷阱连接，冷阱和干燥塔之间设有泵，将起始底物通过所述有序定向共固定的酶膜反应器，收集渗透物。

具体的说，通过冷阱和干燥塔之间的泵来调节渗透汽化膜组件下游的气压，使得渗透汽化膜的上下游之间产生气压差，调节到一定的压力之后，开始渗透汽化：用料液泵将储液罐中的原料通过进料管输送到酶膜反应器的一侧，原料在气压差的作用下向酶膜反应器的另一侧移动，导致原料在微滤滤膜上的各类固定化酶的作用下发生级联反应，将反应底物进行转化形成产物，将产物富集于渗透汽化膜的另一侧形成渗透物，若通过料液泵输送到渗透汽化膜组件的反应底物过剩，则通过第一出料管返回到储液罐中，渗透物在泵的作用下通过出料管输送到冷阱中，冷阱内设有干冰，用于对渗透物进行液化形成渗透液，对于未能及时液化的气体，通过干燥塔吸收水汽，为了防止干燥塔的气体在真空泵的作用下进入到真空泵中，在真空泵前设缓冲瓶。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

固定化酶的排列顺序按照酶级联反应的催化顺序，有利于提高催化反应效率，将固定化酶集合于一张微孔滤膜上，提高多步催化中间产物转移效率；通过设置微孔滤膜使得反应与分离一体，利于反应平衡向有利的方向移动；反应条件温和，酶固定化方法较为简单。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图2为转化葡萄糖的设备的示意图。

图中标记：1-渗透汽化膜组件，2-微孔滤膜，3-渗透汽化膜，4-酶膜反应器，5-冷阱，6-泵，7-干燥塔，8-缓冲瓶，9-真空泵，10-储液罐，11-料液泵。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所述描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种有序定向共固定的酶膜反应器的制备方法：

第一步，制备组合酶的固定化酶溶液

步骤1：将5mg辣根过氧化物酶（HRP）分子和5mg葡萄糖氧化酶分子（GOD）分别溶解于1mL去离子水中得到辣根过氧化物酶溶液和葡萄糖氧化酶溶液；

本发明步骤1中，葡萄糖氧化酶分子中含有辅基黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。

步骤2：将步骤1中的辣根过氧化物酶（HRP）溶液和葡萄糖氧化酶（GOD）溶液分别与混合溶液混合，室温下反应30min后静置3h得到2种反应液，所述混合溶液包括2-3mL浓度为0.31 mol/L的硝酸锌溶液和20-21mL浓度为1.36 mol/L 的2-甲基咪唑溶液；

步骤3：将步骤2所得的2种反应液均以6000r/min离心10min，分别收集得到2种白色粉末；

步骤4：用去离子水将2种白色粉末分别洗涤3次后，再将其分别分散在去离子水中进行冷冻干燥，收集得到呈白色粉末状的HRP/ZIF-8和GOD /ZIF-8；

步骤5：将步骤4所得的HRP/ZIF-8和GOD /ZIF-8分别再次放入10mL去离子水中，超声分散得到HRP/ZIF-8溶液和GOD /ZIF-8溶液。

第二步，死端过滤固定及复合

将第一步所得的HRP/ZIF-8溶液和GOD /ZIF-8溶液先后通过死端过滤固定于PVDF膜（膜的直径为55mm，孔径为2um）上，然后用去离子水洗涤两次，然后将PVDF膜复合于PDMS/PVDF膜上，最后将PDMS/PVDF膜固定于渗透汽化膜组件中得到有序定向共固定的酶膜反应器。

本发明步骤2中，所述硝酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液混合，使得锌离子与2-甲基咪唑配位形成ZIF-8。

本发明第二步中的死端过滤方法为：将固定化酶溶液，置于膜的上游，在压力差的推动下，水和小于膜孔的固定化酶透过微孔滤膜，大于膜孔的固定化酶则被微孔膜截留，从而将固定化酶固定在微孔滤膜上，此为本领域的常规技术手段。

PVDF膜与PDMS/PVDF膜的复合可以为：在PVDF膜上涂布一层粘合剂，然后与PDMS/PVDF膜中的PVDF层胶粘在一起或者其他复合方法，此为本领域的常规技术手段；至于如何将渗透汽化膜固定于渗透汽化膜组件中，为本领域常规技术手段，本领域技术人员可以根据实际情况自行设置。

利用该有序定向共固定的酶膜反应器分解葡萄糖，所述酶膜反应器一侧还设有储液罐，所述酶膜反应器通过进料管和料液泵与储液罐连接，同一侧还通过第一出料管与储液罐连接；所述酶膜反应器的另一侧依次设有冷阱、干燥塔、缓冲瓶和真空泵，所述酶膜反应器通过第二出料管与冷阱连接，冷阱和干燥塔之间设有泵，取适量浓度为20μmol/L葡萄糖溶液放入储液罐，利用料液泵将储液罐中的葡萄糖溶液输送到酶膜反应器在渗透汽化膜的一侧作为底物，底物在泵的作用下先通过GOD /ZIF-8，葡萄糖在氧化剂FAD的作用下经葡萄糖氧化酶催化发生氧化反应，生成葡萄糖酸，FAD被还原为FADH₂，接着FADH₂将氢传给氧气形成过氧化氢，自身回到FAD，过氧化氢在HRP的催化作用下，持续的酶催化反应产生H₂O，H₂O通过该渗透汽化膜的另一侧得到渗透物，在泵的作用下进入到冷阱中，冷阱中设有干冰用于对渗透物液化，收集渗透物。

其反应过程如下：

在渗透通量为21.05 g·m^-2·h^-1的条件下持续反应2h，转化葡萄糖的量为2.67μmol。

实施例2：

一种有序定向共固定的酶膜反应器的制备方法：

第一步，制备组合酶的固定化酶溶液

步骤1：将4.5mg酪氨酸酶（TYR）分子和4.5mg碱性磷酸酶（AKP）分子分别溶解于1.2mL去离子水中得到酪氨酸酶溶液和碱性磷酸酶溶液；

步骤2：将步骤1的酪氨酸酶溶液和碱性磷酸酶溶液分别与混合溶液混合，室温下反应30min后静置3h得到2种反应液，所述混合溶液包括2-3mL浓度为0.26 mol/L硝酸锌溶液和20-21mL浓度为1.13 mol/L的2-甲基咪唑溶液；

步骤3：将步骤2所得的2种反应液均以6000r/min离心10min，分别收集得到2种白色粉末；

步骤4：用去离子水分别将2种白色粉末洗涤3次后，再将其分别分散在去离子水中进行冷冻干燥，收集得到呈白色粉末状的TYR/ZIF-8和AKP/ZIF-8；

步骤5：将TYR/ZIF-8和AKP/ZIF-8分别再次放入去离子水中，超声分散得到TYR/ZIF-8溶液和AKP/ZIF-8溶液。

第二步，死端过滤固定及复合

将第一步所得的TYR/ZIF-8溶液和AKP/ZIF-8溶液先后通过死端过滤固定于PVDF膜（膜的直径为55mm，孔径为3um）上，然后用去离子水洗涤两次，然后将PVDF膜复合于PDMS/PVDF膜上，最后将PDMS/PVDF膜固定于渗透汽化膜组件中得到有序定向共固定的酶膜反应器。

利用该酶膜反应器分解邻-磷酸-L-酪氨酸，分解邻-磷酸-L-酪氨酸的装置与实施例1相同，将储料罐中的葡萄糖溶液改为邻-磷酸-L-酪氨酸溶液，其反应过程如下：

在渗透通量为21.05 g·m^-2·h^-1的条件下持续反应2h，将转化邻-磷酸-L-酪氨酸的量为3.03μmol。

实施例3：

一种有序定向共固定的酶膜反应器的制备方法：

第一步，制备组合酶的固定化酶溶液

步骤1：将5.2mg长链醇氧化酶（LCAO）分子和5.2mgω-转氨酶（ω-TA）分子分别溶解于1.5mL去离子水中得到长链醇氧化酶（LCAO）溶液和ω-转氨酶（ω-TA）溶液；

步骤2：将步骤1所得的长链醇氧化酶溶液和ω-转氨酶溶液分别与混合溶液混合，室温下反应30min后静置3h得到2种反应液，所述混合溶液包括2-3mL浓度为0.26 mol/L硝酸锌溶液和20-21mL浓度为1.13 mol/L的2-甲基咪唑溶液；

步骤3：将步骤2所得的2种反应液均以6000rpm离心10min，分别收集得到2种白色粉末；

步骤4：用去离子水将2种白色粉末分别洗涤3次后，再将其分别分散在去离子水中进行冷冻干燥，收集得到呈白色粉末状的LCAO/ZIF-8和ω-TA /ZIF-8；

步骤5：将步骤4LCAO/ZIF-8和ω-TA /ZIF-8分别再次放入去离子水中，超声分散得到LCAO/ZIF-8溶液和ω-TA /ZIF-8溶液。

第二步，死端过滤固定及复合

将第一步所得的LCAO/ZIF-8溶液和ω-TA /ZIF-8溶液先后通过死端过滤固定于PVDF膜（膜的直径为55mm，孔径为2um）上，然后用去离子水洗涤两次，然后将PVDF膜复合于PDMS/PVDF膜上，最后将PDMS/PVDF膜固定于渗透汽化膜组件中得到有序定向共固定的酶膜反应器。

利用该酶膜反应器分解长链脂肪伯醇，分解长链脂肪伯醇的装置与实施例1相同，将储料罐中的葡萄糖溶液改为长链脂肪伯醇溶液，其反应过程如下：

在渗透通量为21.05 g·m^-2·h^-1的条件下持续反应2h，转化长链脂肪伯醇的量为4.03μmol。

实施例4：

一种有序定向共固定的酶膜反应器的制备方法：

第一步，制备组合酶的固定化酶溶液

步骤1：将5mg乙醇脱氢酶（ADH）分子、5mg环己酮单加氧酶（CHMO）分子和5mg脂肪酶（CAL-A）分子分别溶解于1mL去离子水中得到乙醇脱氢酶溶液、环己酮单加氧酶溶液和脂肪酶溶液；

步骤2：将步骤1所得的乙醇脱氢酶溶液、环己酮单加氧酶溶液和ω-转氨酶溶液分别与混合溶液混合，室温下反应30min后静置3h得到3种反应液，所述混合溶液包括2-3mL浓度为0.31 mol/L的硝酸锌溶液和20-21mL浓度为1.36 mol/L 的2-甲基咪唑溶液；

步骤3：将步骤2所得的3种反应液均以6000rpm离心10min，分别收集得到3种白色粉末；

步骤4：用去离子水将3种白色粉末分别洗涤3次后，再将其分别分散在去离子水中进行冷冻干燥，收集得到白色粉末状的ADH/ZIF-8、CHMO/ZIF-8和CAL-A/ZIF-8。

步骤5：将ADH/ZIF-8、CHMO/ZIF-8和CAL-A/ZIF-8分别再次放入去离子水中，超声分散得到ADH/ZIF-8溶液、CHMO/ZIF-8溶液和CAL-A/ZIF-8溶液；

第二步，死端过滤固定及复合

将第一步所得的ADH/ZIF-8溶液、CHMO/ZIF-8溶液和CAL-A/ZIF-8溶液先后通过死端过滤固定于PVDF膜（膜的直径为55mm，孔径为2um）上，然后用去离子水洗涤两次，然后将PVDF膜复合于PDMS/PVDF膜上，最后将PDMS/PVDF膜固定于渗透汽化膜组件中得到有序定向共固定的酶膜反应器。

利用该酶膜反应器分解环己醇，分解环己醇的装置与实施例1相同，将储料罐中的葡萄糖溶液改为环己醇溶液，起始底物环己醇在连续经过ADH和CHMO傕化生成环己内酯后再由CAL-A醇在水相中催化环己内酯的寡聚反应，其反应过程如下：

在渗透通量为21.05 g·m^-2·h^-1的条件下持续反应2h，将转化环己醇的量为4.73μmol。