阅读说明：本技术 一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器及其使用方法与应用 (Continuous flow immobilized formylglycine generating enzyme reactor and use method and application thereof ) 是由 贾凌云 彭强 任军 臧柏林 于 2019-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器及其使用方法与应用,属于固定化酶技术领域。用于蛋白的定点醛基化修饰。本发明通过将甲酰甘氨酸生成酶固载到琼脂糖凝胶上,显著提高了其稳定性,简化了产物分离。通过发明一种固定化酶的原位重构方法,使得固定化甲酰甘氨酸生成酶能够连续使用,且反应体系中无需再加入铜离子,从而简化了反应体系,降低了应用成本。将固定化甲酰甘氨酸生成酶应用于连续流反应器,提高了固定化酶的催化效率,实现了自动化的连续催化,具有过程可控、产物均一等优点,具有较大的工业放大潜力。(The invention discloses a reactor for generating enzyme by continuous flow immobilized formylglycine and a using method and application thereof, belonging to the technical field of immobilized enzyme. The method is used for site-directed aldehyde modification of protein. According to the invention, the formylglycine generating enzyme is immobilized on the agarose gel, so that the stability of the formylglycine generating enzyme is obviously improved, and the product separation is simplified. By the in-situ reconstruction method of the immobilized enzyme, the immobilized formylglycine generating enzyme can be continuously used, and copper ions do not need to be added into a reaction system, so that the reaction system is simplified, and the application cost is reduced. The immobilized formylglycine generating enzyme is applied to the continuous flow reactor, so that the catalytic efficiency of the immobilized enzyme is improved, the automatic continuous catalysis is realized, and the method has the advantages of controllable process, uniform product and the like and has great industrial amplification potential.)

一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器及其使用方法与 应用

技术领域

本发明涉及一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器及其使用方法与应用，属于固定化酶技术领域。

背景技术

蛋白质定点修饰是蛋白质工程中的核心技术，在生物工程领域和生物医药领域有着广泛的应用。由于醛基具有优异的生物正交反应特性，蛋白质的定点醛基化修饰是蛋白质修饰领域的重要组成部分。甲酰甘氨酸生成酶(formylglycine generating enzyme，FGE)是一种蛋白质高效定点醛基化修饰工具。如图1所示，其通过识别融合在蛋白特定位点的醛基标签“CXPXR”，并催化其中的半胱氨酸(Cys)转化为甲酰甘氨酸(fGly)从而产生醛基。目前FGE已被开发为一种蛋白质定点修饰工具，如美国实用新型专利US20080187956A1首次公开了FGE用于蛋白质定点醛基化修饰的技术，美国发明专利US20160230205A1公开了FGE进行体内和体外进行高效醛基转化的技术。然而，目前FGE的体外应用主要局限于其较低的稳定性，较高的制备和使用成本，以及复杂的反应体系，这些因素使得FGE难以应用于大规模的工业生产。

固定化酶反应器是一种将酶固载到载体基质上，并利用固相催化实现产物转化的技术。固定化酶相比于游离酶具有稳定性高、产物易分离等优点。固定化酶反应器分为批式反应器和连续流反应器。连续流反应器是指将底物流经固定化酶反应器，从而在流动的条件下获得产物的技术。连续流反应器具有过程自动化可控、在线分离、传质效果好等优点，目前已被广泛应用于工业生产中。

发明内容

本发明要解决的技术问题是将连续流固定化酶反应器应用于蛋白的定点醛基化修饰，从而提供一种用于稳定高效，成本更低，更易用于工业生产放大的蛋白质定点醛基化修饰的固定化酶反应器。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器，包括泵和反应腔体，所述反应腔体中填装有固定化甲酰甘氨酸生成酶，所述固定化甲酰甘氨酸生成酶是将甲酰甘氨酸生成酶固定到载体基质上，在连续流反应时，反应溶液中还加入了还原剂。

进一步地，上述技术方案中，所述泵包括微量蠕动泵、高效液相泵、注射泵。

进一步地，上述技术方案中，所述甲酰甘氨酸生成酶包括来源于结核分枝杆菌的甲酰甘氨酸生成酶、来源于天蓝色链霉菌的甲酰甘氨酸生成酶、来源于弯曲高温单胞菌的甲酰甘氨酸生成酶。

进一步地，上述技术方案中，所述载体基质包括环氧活化的琼脂糖微球、四氧化三铁磁性微球、二氧化硅微球。

进一步地，上述技术方案中，所述反应溶液中加入的还原剂包括二硫苏糖醇、巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、巯基乙胺。

本发明还提供了一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器的使用方法，包括如下步骤：

(1)启动泵，使反应缓冲液冲洗反应腔体；

(2)将带有醛基标签的样品溶于反应缓冲液中并加入还原剂，然后泵入连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器反应腔体，使样品流经反应器，收集反应器流出的液体，即得到醛基化修饰后的样品。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中反应缓冲液为50mM三乙醇胺，pH 9.0，50mM氯化钠。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中样品流经反应器的保留时间大于4分钟。

本发明还提供了一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器在纳米抗体的定点醛基化修饰中的应用。

发明有益效果

本发明提供了一种固定化的FGE，将常用的、不同来源的FGE进行固定化，提高其体外催化的稳定性，有利于催化反应后的产物分离。

本发明提供一种连续流固定化FGE反应器，该方法提高了固定化酶的催化效率，实现了自动化、连续的蛋白修饰，具有过程可控、产物均一、易于放大等优点。

附图说明

图1为FGE的催化原理示意图。

图2为各FGE的表达纯化电泳图；(图a)是来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的FGE(MtFGE)、(图b)是来自弯曲高温单胞菌(Thermomonospora curvata)的FGE(TcFGE)、(图c)是来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的FGE(ScFGE)；图中泳道M为Marker蛋白，泳道1、2、3、4分别是全菌表达、可溶表达、包涵体表达以及最终纯度情况。

图3a为底物和产物多肽的液相分离图；图3b为产物的质谱鉴定图；图3c为底物的质谱鉴定图。

图4为固定化酶相对于游离酶的活性保持情况。

图5a为纳米抗体的定点醛基化修饰电泳图，泳道1、2、3分别是未修饰、修饰后以及带有酰肼基团的荧光分子Lucifer Yellow CH(LYC)标记后的样品；图5b和图5c分别是修饰后和标记后的蛋白质谱图。

图6为连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器的催化示意图。

图7a为连续流固定化酶反应器的流速(保留时间)对转化率的影响；图7b为连续流固定化酶反应器的连续使用性。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

下述实施例中所用的材料：

来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的FGE(MtFGE)：蛋白序列如SEQ ID NO.1；

来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的FGE(ScFGE)：蛋白序列如SEQID NO.2；

来自弯曲高温单胞菌(Thermomonospora curvata)的FGE(TcFGE)：蛋白质序列如SEQ ID NO.3。

实施例1不同来源FGE的制备及表征

合成来源于结核分枝杆菌的FGE(蛋白序列如SEQ ID NO.1所示)、来源于弯曲高温单胞菌的FGE(蛋白序列如SEQ ID NO.3所示)、来源于天蓝色链霉菌的FGE(蛋白序列如SEQID NO.2所示)(苏州泓讯生物科技股份有限公司合成)，分别克隆至pET28a(+)表达载体中，然后转化入大肠杆菌T7 Shuffle(DE3)中，并在Terrific Broth培养基中进行培养和诱导表达。8000×g离心5分钟收集菌体，并用破碎缓冲液(20mM磷酸盐,pH 7.4,500mM氯化钠,10％甘油,20mM咪唑)重悬菌体。使用高压匀浆破碎仪(AH-NANO，ATS Engineeringlimited)进行细胞破碎，并用8000×g离心30分钟收集细胞破碎上清液和细胞碎片。利用金属离子亲和层析柱HisTrap HP 5ml(GE Healthcare)进行细胞破碎上清蛋白纯化，将纯化后的FGE使用Ultra-15 10K超滤管(Millipore)超滤浓缩至20mg/ml并换液至储存缓冲液(50mM三乙醇胺，pH 8.0，150mM氯化钠，10％甘油)中，并于-80℃中冻存待用。通过对诱导表达后的菌体、细胞破碎上清液、细胞碎片以及纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，得到结核分枝杆菌的FGE、弯曲高温单胞菌的FGE、天蓝色链霉菌的FGE的表达及纯化效果如图2所示。可以看到各FGE的可溶表达量较高(约400mg/L培养基)，且纯化后具有较高的纯度(>90％)。

建立一种间歇式高效液相的方法测定所制备酶的活性。将含有FGE识别标签的多肽SEQ ID NO.4：LCTPSRGSLFTGR(由浙江昂拓莱司生物技术股份有限公司合成)作为底物，多肽的N端进行了乙酰化修饰，C端进行了酰胺化修饰。将200μM多肽溶于缓冲液(50mM三乙醇胺，50mM氯化钠，2mM二硫苏糖醇)中，然后加入2μM FGE开始反应。反应用1/10体积的1M盐酸进行终止，然后利用装配有反相C18色谱柱(250mm×4.6mm,Thermo Fisher Scientific)的高效液相-高分辨质谱联用仪(LTQ Orbitrap XL，Thermo Fisher Scientific)进行产物的鉴定和定量(结果如图3所示)。可以看到产物和底物可以很好地分离，且质谱鉴定分子量与理论底物和产物分子量吻合。定义酶活力单位(U)为1U＝1μmol/min，即每分钟催化转化1μmol底物所需的酶量。通过测定各2μM酶在最优条件下，不断增加的底物浓度(0-1mM)下产物生成的速率进行米氏方程(v＝Vmax×[S]/(Km+[S]))拟合，得出各酶的动力学参数，如表1所示。

利用建立的间歇式高效液相的方法进行各酶的反应pH和温度的优化，得出各酶反应的最优pH与温度。将酶置于最优条件下，每隔一段时间测定酶活，将酶活的衰减进行非线性拟合，得出各酶的半衰期，如表2所示。

通过圆二色光谱测定各酶的热稳定性。将FGE稀释到10mM磷酸盐缓冲液中，最终浓度为0.03mg/ml，并加入到10mm比色皿中。在波长λ_CD＝220nm，温度范围为25-95℃，温度步长为1℃的条件下，观测光谱的变化。将最终得到的光谱数据通过双状态模型拟合得到各酶的熔解温度，如表2所示。

表1

表2

实施例2 FGE的固定化

1)环氧活化琼脂糖的制备：

将5ml保存在20％乙醇中的琼脂糖凝胶CL-4B用水清洗，然后加入到12ml 0.35M的NaOH溶液中，缓慢加入8ml 1，4-丁二醇缩水甘油醚并不断搅拌。将反应置于37℃下搅拌1小时，然后依次用0，20％，40％，60％，80％，100％梯度丙酮-水溶液清洗凝胶。最后将凝胶用水进行清洗，并保存在含有0.02％NaN₃的水溶液中，置于4℃保存。

2)FGE的固定化：

将FGE分别换液到固载缓冲液中(100mM碳酸铵，pH 9.0，500mM硫酸钠)，并将酶按酶：载体(w/w)为1：15加入到预先用固载缓冲液清洗过的步骤1)制备的凝胶中。固定化反应在室温下进行2小时，并不断进行翻转摇匀。通过BCA法测定固定化前后上清中的蛋白浓度差从而确定固载蛋白量。环氧活化载体上未反应的环氧基团通过4％乙醇胺(pH 9.0)在室温下孵育2小时进行封闭。最后将固定化的FGE用储存缓冲液(50mM三乙醇胺，pH 8.0，150mM氯化钠，10％甘油)进行清洗并储存于4℃。

3)固定化FGE的效果评价：

使用实施例1中的间歇式高效液相法测定固定化酶的反应活性。将50mg步骤2)得到的固定化的FGE用反应缓冲液(50mM三乙醇胺，pH 9.0，50mM氯化钠)进行清洗，加入500μl的含有200μM多肽的反应缓冲液进行反应，并且不断进行翻转摇匀。固定化后活性保持按如下公式进行计算：

其中，V₀和V₀’(μM/min)分别是固定化酶和游离酶的产物生成速率，m和m’分别是固定化酶和游离酶的质量。如图4所示，来自弯曲高温单胞菌(Thermomonospora curvata)的FGE在固定化后具有较高的活性保持。

实施例3连续流反应器定点醛基化修饰

将1.2g固定化TcFGE填装到7.2×26.5mm，总体积为1ml的色谱柱中，使用微量蠕动泵将柱用反应缓冲液(50mM三乙醇胺，pH 9.0，50mM氯化钠)冲洗10min，流速为500微升/分钟。将带有醛基标签的抗表皮生长因子纳米抗体(VHH 7D12-Cys)置换到反应缓冲液中，并在保留时间为0到20分钟的条件下流过反应器，收集流出产物(如图6所示)，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质谱进行产物定量。如图5a所示，蛋白质被醛基化修饰之后电泳条带会略微上移，使用能和醛基反应的荧光分子对蛋白进行标记后，电泳条带上升更为明显。如图5b和图5c所示，在解卷积的蛋白质谱图中，均能检测到修饰前、修饰后和标记后的蛋白，并且可通过其相对丰度计算其修饰效率和标记效率。不同流速下的蛋白修饰效率如图7a所示。当保留时间>4分钟时，催化效率能达到最大值。

为了确定固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器的连续使用性，将纳米抗体溶液中加入2mM还原剂二硫苏糖醇(DTT)，并在室温下进行连续流动催化5天。每隔一段时间进行取样测定转化率，测得5天内反应器的催化转化效率如图7b所示。可见在DTT的存在下，连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器可以进行连续催化，具有较高的生产率和较大的放大潜力。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，是优选的实施例。而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请型的保护范围之。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连理工大学

<120> 一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器及其使用方法与应用

<130> 2019

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 3

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Pro Leu

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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1 5 10