具体实施方式

定义

在本说明书中使用的术语通常具有在本领域中、在本发明的范围内以 及在使用各个术语的具体上下文中的它们的普通含义。以下或者在说明书 中的其他地方将讨论用于描述本发明的一些术语，从而提供对于本发明的 说明书的实践者以额外的指导。为了方便起见，一些术语可以被高亮显示， 例如使用斜体字和/或引号。使用高亮对术语的范围和含义并没有影响；无 论其是否被高亮显示，术语的范围和含义在相同的上下文中是一样的。应 该理解的是，同样的事情可以以多种方式描述。因此，可以使用替代性的 语言和同义词以用于在本文中所讨论的任何一个或多个术语，无论术语在 此是否被阐述或者讨论，都不会因此而具有任何特殊的意义。提供同义词 以用于一些术语。列举一个或多个同义词并会不排除使用其他同义词。在 本说明书中任何位置的实施例的使用，包括再次讨论的任何术语的实例都 仅是用于说明的目的，而决不是限制本发明或者任何示例性术语的范围和 含义。同样，本发明并不限于在本说明书中给出的各个实施方式。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属 领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，以本文 件，包括限定为准。

在本文中所使用的，“左右”，“大约”或“近似”一般是指在给定值或者范 围的20％，优选在10％，更优选在5％以内。这里所给出的数值的量值是近 似的，这意味着，如果没有明确的表达，则可以指术语“左右”、“大约”或“近 似”。

术语“样品盒”和“微片纳米吸量管”可以互相交换。

颗粒聚集是指在胶体悬浮液中的簇的形成，且其代表了导致胶体系统 的不稳定作用的最频繁的机制。

团聚是指颗粒对彼此或者对固体表面的粘着。聚集意味着强的吸引力 而且是不可逆的；团聚不像聚集一样强而且更容易是可逆的，即，所述胶 体颗粒更容易分裂成较小的团聚体或单个颗粒。裸颗粒会强烈聚集。表面 涂覆的颗粒会最终团聚，但可以被容易地破碎。

在此使用的“纳米颗粒”是指1000nm以下的颗粒，且该颗粒的至少一 个维度必须低于100nm。

在本文中使用时，当限定数字或范围时，本领域的普通技术人员理解， 这是意图包括关于本发明相关的特定领域的适当的、合理的范围。

对于大于0.5μm但小于5μm来说，这意味在这个范围内的所有的十 分之一单位量和整数单位量都作为本发明的一部分被具体公开。由此，包 含0.6、0.7、0.8和1、2、3和4μm单位量作为本发明的实施方式。

对于由50nm至300nm的范围来说，这意味在这个范围内的所有整数 单位量都作为本发明的一部分被具体公开。由此，包含50、51、52……298、 299和300nm单位量作为本发明的实施方式。

对于由5μm至30μm的范围来说，这意味在这个范围内的所有整数单 位量都作为本发明的一部分被具体公开。由此，包含5、6、7……28、29 和30μm作为本发明的实施方式。

能量色散X射线分析(EDX)，又称为EDS或EDAX，是用于确定材 料的元素组分的X射线技术。

支持向量机(SVM，又称支持向量网络[1])是具有分析数据和识别图 形的相关学习算法的监督学习模型，用于分类和回归分析。

术语“纳米颗粒的均匀分布”是指相邻的纳米颗粒之间的距离呈现出均 匀的高斯分布，如图11C中所示(使用纳米吸量管制备样品)。图11A-B(使 用铜网制备样品)显示出两个明显的峰，其代表在相邻的纳米颗粒之间距 离中的大的变化。

本发明公开了具有微小腔室的样品盒，以用于制备用于TEM的样品。 所述腔室的高度比血细胞的尺寸小，因此适于从血细胞分选纳米颗粒。根 据本发明制备的样品适用于TEM观察在液体样品(如血液)中的纳米颗粒的 分布状态。所述腔室的小高度消除了在干燥过程期间纳米颗粒的聚集和/或 团聚的可能性。因此，本发明制备的样品适用于TEM观察在液体样品中的 纳米颗粒的分散和/或团聚。

在一个方面，本发明涉及一种样品盒(图5、6、10、14)，其包括：

(a)顶基板和底基板，所述基板各自具有顶表面和底表面，以及长度 L1，宽度W1和厚度T1，所述顶基板和底基板是透明的且彼此平行；

(b)第一间隔物和第二间隔物，其各自具有长度L2，宽度W2和厚度 h，位于所述顶基板下方和坐落在所述底基板上，所述第二间隔物与所述第 一间隔物相对，并以间距d与所述第一间隔物间隔开；其中，所述间隔物 的宽度W2小于所述顶基板的宽度W1；和

(c)在所述顶和底基板之间和在所述第一和第二间隔物之间形成的腔 室，所述腔室具有两个向大气开放的端部，且所述腔室的特征在于，具有 长度L1，宽度d，以及由所述间隔物的厚度所限定的高度h，其中该高度h 比红血细胞的直径小。

在本发明的一个实施方式中，所述顶基板进一步包括多个孔或通道或 狭缝，所述孔或通道或狭缝的尺寸适于足够窄，以使腔室中的液体样品被 限制而不会通过顶基板中的所述孔或通道或狭缝泄漏/逸出。

在本发明的另一个实施方案中，所述顶基板不包含如孔或狭缝或通道 的中空结构。

所述样品盒的底基板是平坦且连续的，在所述底基板中不形成任何中 空结构。所述腔室未在所有的侧面封闭或密封。

所述腔室的长度、宽度和高度由顶基板和底基板的长度、两个间隔物 之间的距离、以及间隔物的厚度分别限定。因此，所述通道的容积是固定 的，并且可以被计算或测定。根据本发明的一个实施方式的腔室的长度不 超过1cm，且腔室的高度小于红血细胞的直径。

在本发明的另一个实施方式中，上述的样品盒进一步包括：

(a)具有顶表面和底表面的顶框，所述顶框位于所述顶基板上，并具 有在其顶表面和底表面之间形成的开放的窗口；以及

(b)具有顶表面和底表面的底框，所述底框位于所述底基板下方，并 具有在其顶表面和底表面之间形成的开放的窗口；

其中，所述开放的窗口各自具有面向所述腔室开口的一个窗口和背离 所述腔室开口的另一个窗口，所述面向所述腔室开口的窗口具有不超过50 μm的宽度和不超过800μm的长度。

所述顶框和底框通过对基板提供强度而支撑所述顶基板和底基板。

在本发明的另一个实施方式中，所述顶基板和底基板各自具有在50nm 至300nm，或者50nm至200nm的范围内，优选在100nm至200nm范 围内的厚度。重要的是，两个基板各自具有不小于50nm的厚度以使变形 最小化，并使所述顶基板和底基板(或膜)在加载和干燥液体样品期间保 持平行。

在本发明的另一个实施方式中，所述腔室的高度大于0.1μm但小于5 μm。或者，所述腔室的高度小于或等于5μm。在本发明的另一个实施方式 中，所述腔室的高度选自小于10μm、5nm至2μm、5nm至0.5μm、和5 nm至150nm。在本发明的另一个实施方式中，所述腔室具有不超过1cm 的长度，以及小于1cm的宽度。

在本发明的另一个实施方式中，顶基板和底基板各自包括氮化硅 (Si_xN_y)膜。

在另一个方面，本发明涉及上述的样品盒在制备用于透射电子显微镜 (TEM)纳米颗粒表征的干燥样品中的用途。

在另一个方面，本发明涉及一种用于制备用于TEM纳米颗粒表征的样 品的方法，其包括：(a)提供如上所述的样品盒；以及(b)向所述非封闭 的腔室中装载包含纳米颗粒的液体样品。在这种情况下，该方法不包括干 燥过程，从而在TEM下观察在液体样品中的纳米颗粒。

在另一个方面，本发明涉及一种用于制备用于TEM纳米颗粒表征的样 品的方法，其包括：

(a)提供如上所述的样品盒；

(b)向所述非封闭的腔室中装载含纳米颗粒的液体样品；以及

(c)在所述非封闭的腔室中干燥所述液体样品，以得到干燥的含有纳 米颗粒的样品，所述纳米颗粒附着在顶基板的底表面和底基板的顶表面上。

在本发明的一个实施方式中，所述装载步骤是通过使腔室的一端向下 放置以与液体样品接触而进行的。

在本发明的另一个实施方式中，所述含纳米颗粒的液体样品是选自血 液样品、体液、乳液、化学机械抛光/平坦化的浆料、和包含碳酸钙纳米颗 粒的液体或牛奶中的至少一种。

在本发明的另一个实施方式中，在所述液体样品的干燥过程中，纳米 颗粒被限制运动以及聚集和/或团聚。

在另一个方面，本发明涉及一种用于分析在液体样品中的纳米颗粒的 TEM图像的方法，其包括：

(a)根据上述的方法制备用于TEM纳米颗粒表征的干燥样品；

(b)将所述干燥样品放置在TEM下；以及

(c)观察并分析在所述干燥样品中的纳米颗粒的TEM图像，以得到 关于在液体样品中的纳米颗粒的聚集、团聚和/或浓度的信息。

在本发明的一个实施方式中，所述观察并分析的步骤进一步包括：

(i)获得纳米颗粒的TEM图像并将该TEM图像存储在计算机中；

(ii)预处理该TEM图像以增强对比度，降低噪音和背景；

(iii)将所述图像中的纳米颗粒从背景中分割出；

(iv)构建具有用户界面的训练数据库；以及

(v)基于在所述训练数据库中的信息将单个颗粒分类。

在本发明的另一个实施方式中，利用计算机软件进行步骤(i)至(v)。

在本发明的另一个实施方式中，所述构建步骤包括训练计算机以识别 纳米颗粒的性质。所述性质可以是选自聚集的颗粒和单个颗粒中的至少一 种。

在另一个方面，本发明涉及一种用于分析在组合物中的颗粒的TEM图 像的系统，其中，所述系统包括：

(a)如上所述的样品盒；以及

(b)具有算法以进行以下功能的计算机软件：

(i)获得纳米颗粒的TEM图像并将该图像存储在计算机中；

(ii)预处理该TEM图像以增强对比度，降低噪音和背景；

(iii)将所述图像中的纳米颗粒从背景中分割出；

(iv)构建具有用户界面的训练数据库；以及

(v)基于在所述训练数据库中的信息将单个颗粒分类。

支持向量机(SVM)是可适用于进行预处理、分割、训练数据库的构 建和颗粒分类的算法。预处理步骤采用以下的直方图均衡算法：

k＝cdf_x(x)

仍在另一方面，本发明涉及一种干燥的含纳米颗粒的样品，其特征在 于纳米颗粒在上述的样品盒的非封闭的(或者非闭合的)腔室中的均匀分 布，所述干燥样品从干燥含纳米颗粒的液体样品而得到，其中，所述纳米 颗粒在非封闭的腔室中的均匀分布反映了所述纳米颗粒在液体样品中的状 态。所述含纳米颗粒的样品是未封闭的或者是非闭合的。所述含纳米颗粒 的液体样品可以是选自血液样品、体液、乳液、化学机械抛光/平坦化的浆料、和包含碳酸钙纳米颗粒的液体或牛奶中的至少一种。

实施例

以下将给出根据本发明的实施方式的示例性的仪器、装置、方法及其 相关结果，而不意图限制本发明的范围。应注意的是，可以在实施例中使 用标题或副标题以方便读者，其并不是为了限制本发明的范围。此外，在 此提出并公开了一些理论；然而，无论其正确或者错误，其都不应当限制 本发明的范围，只要根据本发明而实践该发明，而不必考虑任何特定的理 论或者作用机制。

通过常规方法制备显微样品

图1A-E是说明用于制备显微样品的常规方法的示意图。在一片基板 100(例如铜网)上放置一滴生物体液样品102(例如，血液样品)，其含有 血细胞104和颗粒106(例如，纳米颗粒)(图1A-B，侧视图)。纳米颗粒 的直径通常不大于1微米，因此，比血细胞的直径小。红血细胞(RBC) 具有6至8μm的平均直径，且白血细胞(WBC)具有10至12μm的平均 直径。在干燥过程期间在生物体液或血液样品102中的液体蒸发，这导致 液滴的收缩和多个更小的液滴的形成(图1C，侧视图)。在每个液滴内的 表面张力108拉动其中的组分(例如，纳米颗粒)彼此越来越接近，从而导致 在液滴内的纳米颗粒的聚集。图1D(侧视图)显示出在样品中的液体完全 蒸发之后形成的两个聚集群110a和110b。在上述制备的样品中发生的纳米颗粒110a和110b的聚集显示出了与纳米颗粒团聚相似的外观，这导致了 在纳米颗粒聚集和纳米颗粒团聚之间的观测的混乱，并给TEM观察者以不 准确或者错误的信息。图1E是图1D的顶视图，显示出形成的两个聚集群 110a和110b。图1E的显微样品并不反映在原始样品102中的纳米颗粒106 的真实状态，因为在原始样品102中的纳米颗粒106是均匀分散而没有聚 集的(图1B)。这将导致使用TEM以获得在来自受试者的血液样品中的纳 米颗粒的状态、分散和/或团聚的信息的目的失效。

图2A-2E是根据常规方法制备的显微样品的另一个例证。在一片基板 100(例如铜网)上放置一滴生物体液样品102(例如，血液样品)，其含有血 细胞104、分散的纳米颗粒106和纳米颗粒团聚体210(图2A-B)。在干燥 过程期间在血液样品102中的液体蒸发，这导致液滴的收缩和多个更小的 液滴的形成(图2C)。在每个液滴内的表面张力108拉动其中的组分(例如， 纳米颗粒)彼此越来越接近，从而导致在液滴内的纳米颗粒的聚集体110a 和110b的形成(图2D)。图2E是图2D的顶视图，显示出两个聚集群110a 和110b，这是新形成的聚集体，因为它们在原始血液样品102中并不存在 (图2B)。因此，根据图2制备的显微样品将给TEM观察者以错误的信息。

在图2D-E中显示的显微样品存在纳米颗粒团聚体210，以及新形成的 纳米颗粒聚集体110a和110b，其具有与纳米颗粒团聚体210相似的外观。 新形成的纳米颗粒聚集体110a和110b是在干燥过程期间由液滴内的表面 张力108导致的。这将导致使用TEM以获得在原始血液样品中是否含有纳 米颗粒团聚体的信息的失效，这是由于以常规方法制备的显微样品并不能 反映纳米颗粒团聚体的真实数量。

利用微片纳米吸量管(即样品盒)制备的显微样品

本发明涉及利用具有微小腔室的微片纳米吸量管制备的显微样品。所 述腔室的高度被配置为比红血细胞(RBC)的直径小得多。RBC比WBC 更小。因此，在进入微片纳米吸量管的腔室时可以排除/筛选掉所有的血细 胞。在样品中不存在血细胞可以减少对观察纳米颗粒的干扰，且因此，提 高了样品的定性和定量检测。微片纳米吸量管的小腔室将血液样品保持在 其中，并消除了在干燥过程期间的表面张力的影响。根据本发明制备的显 微样品使得能够检测纳米颗粒的真实分散状态，如在原始血液样品中的分 散和/或团聚。

图3A-3E显示出根据本发明的显微样品的制备。使血液样品102与在 微片纳米吸量管的顶基板302和底基板304之间形成的腔室300的一个端 部接触(图3A)。血液样品102含有纳米颗粒106和血细胞104。在顶基板 302和底基板304之间的高度h被制成比红血细胞104的直径更小，从而所 有的红细胞和白细胞被排除进入腔室300。顶基板302具有顶表面306和底 表面307。底基板304也具有顶表面310和底表面312。对于腔室300而言， 10μm的高度h足够用于TEM观察在血液样品中的纳米颗粒的分布状态、 分散和/或团聚。

纳米颗粒106伴随血液流体进入腔室300(图3B)。由于细胞尺寸比所 述腔室的高度更大，血细胞104被排除进入腔室300中。腔室中的液体经 历干燥过程，这导致形成多个小液滴。每个液滴包含单个纳米颗粒106，并 因液滴308的附着力而附着在腔室300的内表面上(即，顶基板的底表面 和底基板的顶表面)(图3C)。图3D是在血液样品中的液体干燥后的显微 样品的侧视图，其显示出附着在顶基板302的底表面307上的一些纳米颗 粒106，以及附着在底基板304的顶表面310上的一些纳米颗粒106。由于 在两个基板302、304之间的微小间隔或小高度h，限制了在薄的样品层(H) 中分布的纳米颗粒106的数量，这消除了在薄的样品层(H)中的纳米颗粒 106的聚集的可能性。图3E是图3D的顶视图，显示出分散的纳米颗粒106 真实地反映了在如图3B中所示的原始血液样品102中的纳米颗粒106的真 正的分散状态。

图4A-4E显示出根据本发明的另一个显微样品的制备。使血液样品102 与在微片纳米吸量管的顶基板302和底基板304之间形成的腔室300的一 个端部接触(图4A)。血液样品102包含纳米颗粒团聚体210，分散的纳米 颗粒106和血细胞104。在顶基板302和底基板304之间的高度h被制成比 红血细胞104的直径更小，从而所有的红细胞和白细胞被排除进入腔室 300。纳米颗粒106和纳米颗粒团聚体210都随着血液样品102的流体进入 腔室300。血细胞104不能进入腔室300，这是由于其尺寸比腔室的高度更 大(图4B)。腔室中的液体经历干燥过程，这导致形成多个小液滴。每个 液滴包含单个纳米颗粒106或者团聚的纳米颗粒210，并因液滴308的附着 力而附着在腔室300的内表面上(即，顶基板的底表面和底基板的顶表面) (图4C)。在腔室300中的液体完全干燥之后，一些分散的纳米颗粒106 和纳米颗粒团聚体210附着在顶基板302的底表面和底基板304的顶表面 上。微小间隔或小高度h限制了在薄的样品层(H)中分布的纳米颗粒106 和纳米颗粒团聚体210的数量，且因此消除了在薄的样品层(H)中的纳米 颗粒106和纳米颗粒团聚体210聚集的可能性(图4D)。图4E是图4D的 顶视图，其中，显微样品的分散的纳米颗粒106和纳米颗粒团聚体210真 实地反映了在如图4B中所示的原始血液样品102中分布的纳米颗粒106和 纳米颗粒团聚体210的真正状态。

图5显示出微片纳米吸量管500在制备用于在TEM下观察的显微样品 中的用途。微片纳米吸量管500具有在顶基板302和底基板304之间形成 的腔室300；其中，腔室300的高度h比RBC的直径更小，并且所述顶基 板302由对电子透明的材料制成。小于10μm的腔室高度足以允许TEM观 察在血液样品102中的纳米颗粒的分布状态、以及纳米颗粒的分散或团聚。 第一间隔物502a和第二间隔物502b插入在顶基板302和底基板304之间， 以控制腔室300的高度。所述腔室300具有第一端部301a和第二端部301b， 每个端部具有入口504。入口504可配置为用于样品的注射。

顶框506位于顶基板302上，底框508(其可以是与所述顶框相同的尺 寸)位于底基板304下方，其中，所述顶框506和底框508各自具有顶表 面510和底表面511，且在顶表面510和底表面511之间形成开放的窗口 512，所述开放的窗口512具有等于顶框506或底框508的厚度的高度h_w， 以及比所述顶框或底框的长度和宽度都小的长度和宽度。开放的窗口512 接收TEM电子束518(图5至6)。

在顶框506中的开放的窗口512和在底框508中的开放的窗口512各 自具有面向腔室的开口512c和背离腔室的另一开口(图10A)。顶框中开 放的窗口的开口512c(面向所述腔室)在顶框的底表面上形成，面向顶基 板302，且由此面向腔室300。底框中开放的窗口的开口512c在底框的底 表面上形成，面向底基板304以及腔室300。面向腔室的开口512c具有不 超过50μm的宽度516，以及不超过800μm的长度514。因此，腔室300 内的颗粒样品可以通过窗口开口512c(其位于顶框的底表面上并面向顶基 板302和腔室300)在TEM下从微片纳米吸量管500的顶部观察。

所述顶基板和底基板的厚度在50nm至300nm，或者50nm至200nm 的范围内，优选在100nm至200nm范围内。

基板的厚度和窗口的宽度对于使用根据本发明的纳米颗粒的TEM图 像分析中的所述样品盒是非常重要的。两个基板各自需要具有不小于50nm 的厚度，且面向腔室的窗口宽度516c(即，面向腔室的窗口开口)需要是 小于或等于50μm。这些需求是必要的，以使顶基板和底基板的变形最小化， 并保持顶基板和底基板(或膜)平行。基板(或膜)的变形会导致在干燥 过程期间的颗粒的聚集，以及纳米颗粒的不正确的TEM图像分析。

图14A-B显示出面向腔室的开放的窗口512c的宽度(w)以及膜(顶 基板和底基板)的厚度的尺寸。该尺寸必须在一定范围内，以使两个膜(即， 顶基板和底基板)在与所述开放的窗口512c相邻(或者暴露于其)的部分 保持彼此平行。面向所述腔室的开放的窗口512c的宽度是≤50μm，优选5 至30μm，且所述长度为≤800μm，优选50-500μm。所述膜(或基板)的 厚度为≤300nm，优选50-200nm。

图6显示出在顶基板302和底基板304之间形成的腔室300。在所述微 片纳米吸量管500的顶框506的中心制作观察窗口512。可以通过窗口512 在TEM下从微片纳米吸量管500的顶部观察腔室300的部分。腔室300的 一端用作用于液体样品的入口504。

图7A显示出在腔室300上的顶视图。顶基板302由平板制成，并对电 子透明。图7B是图7A的横截面图，显示出顶基板302和底基板304两者， 且液体样品(例如，血液102)被填充到在基板302和304之间的腔室300 中。

图8A-8B显示出根据本发明的另一实施方式的微片纳米吸量管。图8A 是在另一微片纳米吸量管中含有孔803的顶基板802的顶视图，显示出穿 过顶基板802的多个孔803。样品的观察可以在腔室中用血液或液体进行。 可以通过孔803在没有顶基板802的阻碍下用TEM进行对样品的更高品质 的观察。图8B是图8A的横截面图，显示出顶基板802和底基板804两者， 样品血液102被填充到在基板802和804之间的腔室中。每个孔被配置为 足够小以通过表面张力808保持在腔室中的血液样品102，从而所述血液样 品液体102不会通过孔803渗出。

图9A-9B显示出根据本发明的另一实施方式的微片纳米吸量管。图9A 是在另一微片纳米吸量管中含有狭缝或通道903的顶基板902的顶视图， 显示出穿过顶基板902的多个狭缝或通道(或者穿透槽)903。样品的观察 可以在腔室中用血液或液体进行。可以通过狭缝903在没有顶基板902的 阻碍下用TEM进行对样品的更高品质的观察。图9B是图9A的横截面图， 显示出顶基板902和底基板904两者，样品血液102被填充到在基板902 和904之间的腔室中。每个狭缝或通道被配置为足够小或窄以通过表面张 力908保持在腔室中的血液样品102，从而所述血液样品液体102不会通过 狭缝903渗出。

在此，具有狭窄腔室宽度的微片纳米吸量管被构建以防止在干燥过程 期间的颗粒的聚集，使得能够进行在血液中它们的聚集/团聚状态和颗粒浓 度的定量分析(图10A-10C)。当液滴在铜网上常规干燥时，所述纳米吸量 管的上基板打破了样品液滴的表面张力，抑制了伴随着水的蒸发的毛细管 流动，以及抑制了物质的聚集。该纳米吸量管充当用于简单且方便地分选 在全血、50％稀释的血、以及5％葡萄糖溶液中的聚乙二醇化的金纳米颗粒 的过滤器。观察到在50％稀释的血液样品中的羧基-PEG5k修饰的金纳米颗 粒(～18％)的轻微聚集，尽管它们在5％的葡萄糖溶液中良好分散。此外， 使用纳米吸量管和电感耦合等离子体质谱(ICPMS)分析对于体外50％稀 释的血液和体内全血都得到了对于cPEG5k-GNP的一致的浓度。

我们研究了使用纳米吸量管以获得在水性溶液中的颗粒的聚集/团聚状 态的可能性。羧基-PEG5k修饰的金纳米颗粒(cPEG5k-GNP)(这是已知的 在血液中长期循环并为良好分散的胶体形式)溶解在5％的葡萄糖溶液中， 并用作为用于检查和比较在纳米吸量管(具有Si_xN_y膜)和在铜网上(具有 碳膜或者SiO_x膜)干燥的TEM样品中的颗粒的空间分布的模型颗粒。在 具有Si_xN_y膜(水接触角：～32°)的纳米吸量管中观察到颗粒的均匀的空间 分布，在四个随机选择的2.0μm×2.7μm的图像区域中测定的颗粒数为 478、467、502和504(图11A-B)。对于全部四个2.0μm×2.7μm的图像 区域还测量了每个cPEG5k-GNP到最近的相邻颗粒的距离(图11C)，并以 颗粒数百分比(n/N)对相邻颗粒的距离作图(图11C)。观察到了具有69.4 ±21.6nm的平均距离的单个宽分布的峰(图11C)，这比cPEG5k-GNP(通 过TEM观察为～39.6nm，通过DLS测量为～39.3nm)的直径更大，并表明， 大部分的颗粒与其相邻的颗粒分离开来。在大于颗粒直径的d值处分布的 颗粒百分比更高表明了大部分的颗粒没有接触地分布，并且没有聚集地分 离。这些结果与cPEG5k-GNP的理解一致，其在5％的葡萄糖溶液中是良好 分散的，并表明，该纳米吸量管可以保持颗粒的天然空间分布，并避免在 样品溶液中的聚集/团聚。然而，在具有疏水碳膜(水接触角：～70℃)的铜 网上，甚至在具有亲水SiO_x膜(水接触角：～30℃)的网上干燥相同的样 品溶液时，观察到颗粒的明显不均匀的空间分布(图11A-B)。从颗粒数百 分比对到相邻的颗粒的距离的绘图(图11C)中，对于碳膜和SiO_x膜铜网 都得到了三个峰(图11C)。注：应修改在PDF文件中的图号。其应该是“到相邻的颗粒……的距离”。以小于cPEG5k-GNP的直径的距离存在的两个峰 表明，颗粒在干燥过程(大量溶剂的逐渐蒸发)期间在铜网上垂直堆叠或 者自我聚集，且甚至用SiO_x膜做亲水性表面修饰也不能防止聚集。在另一 实施例中，在纳米吸量管中和铜网上各干燥300nm的聚苯乙烯珠。所述珠 在纳米吸量管中良好地分离，但在铜网上(碳膜和SiO_x膜)高度聚集。所 述纳米吸量管显然提供了用于保持和量化颗粒的天然聚集/团聚状态的简单且方便的取样装置，且由于该取样装置而无需引入任何工件。

此外，我们研究了使用具有恰当限定的腔室宽度的纳米吸量管以从血 液中分选出(sort out)特定尺寸的颗粒的可能性，这是感兴趣的生理环境，其 中纳米颗粒的观察和表征是具有挑战性的。除了保持颗粒的天然空间分布 之外，纳米吸量管限定的窄的腔室结构也可以作为用于简单且方便地分选 纳米尺寸材料的过滤器，以防止在血液中发现的较大的物质的进入；在这 种情况下，血细胞和血小板可以在样品装载过程中被排除(图10B)。因此， 仅在血浆中比该纳米吸量管的腔室宽度小的亚微米尺寸的颗粒被取样并通 过TEM观察。使用此方法研究50％稀释的血液样品，且观察到一些可能是 血清蛋白(如血清白蛋白)的不规则形状的纳米尺寸物质(5至20nm)(图 12A)。当cPEG5k-GNP被掺入在50％稀释的血液中时，金纳米颗粒(以紫 箭头表示)和推测的血蛋白(以白箭头表示)都很容易观察，识别，并用 于基于图像的定量分析(图12A)。使用四个纳米吸量管装载来自相同的50％ 稀释的血液样品的颗粒，且各自观察到相似的颗粒数(图12B)。颗粒的均 匀空间分布和可再现的定量结果表明，该纳米吸量管是一种用于从血液中 分选颗粒的很有前途的采样装置。此外，cPEG5k-GNP在50％稀释的血液 中的聚集/团聚状态通过以颗粒数百分比对到相邻颗粒的距离绘图而评价 (图12D)。在图12C中，四个重复试验表明，cPEG5k-GNP显示出宽峰 (～80％的颗粒)，其与相邻颗粒的距离大于cPEG5k-GNP的直径，这表明 大部分的颗粒在血液中良好地分散。对于全部四个重复的纳米吸量管而言， 观察到颗粒数百分比为21.7％、18.4％、15.4％和15.6％的小的额外的峰出 现在cPEG5k-GNP的直径附近(～39.6nm)。因为在相同浓度的cPEG5k-GNP 被掺入到5％的葡萄糖溶液中时仅观察到一个单峰，颗粒数为～18％的额外 的聚集峰表明，50％稀释的血液引起颗粒的轻微聚集(图12D)。结果证实， 该纳米吸量管提供了用于分选纳米颗粒并消除在血液中的纳米颗粒的聚集/ 团聚状态的简单且方便的取样装置，其具有可再现性和定量结果，且还能 用于其他目标生物体液的分析。此外，测试了有意聚集的由柠檬酸盐修饰 的金纳米颗粒(柠檬酸盐-GNP)。在5％的葡萄糖中，柠檬酸盐-GNP显示 出～70％的聚集，在每个聚集体中具有2至10个纳米颗粒，而在50％稀释 的血液中，颗粒的聚集程度增加到～87％，～40％的聚集体中在每个聚集体内含有11至100个颗粒。因此，该纳米吸量管有可能区分在不同的水性环境 中的有意聚集的纳米颗粒的聚集程度。

在生物基质中的纳米颗粒浓度的量化对于其吸收、分布、代谢和排泄 的体内分析，以及对于药代动力学和毒性研究而言是重要的，特别是对于 在体内的生物体液中丰富元素(例如，C、H、O、N、P、Fe、Zn和Ca) 组成的纳米颗粒而言仍是共同的挑战。除了为了制备均质的样品并作为用 于分选来自血液的颗粒的过滤器而保持颗粒的天然的空间分布以外，纳米 吸量管的固定且恰当限定的窄腔室容积具有等于TEM图像面积乘以纳米 吸量管的腔室宽度的图像体积(V)(V＝L×W×H)。由此计数在每个TEM 图像中的颗粒数(N)，并除以总的图像体积，从而测定在每个样品溶液中 的颗粒浓度(C)(C＝N/V)(图13A)。然后将在TEM图像中计数的纳米 吸量管中的cPEG5k-GNP的数量与ICPMS分析(这是定量金属(例如Au、 Ag、Fe等)的浓度的金标准方法)比较。在50％稀释的血液中，在纳米吸 量管(n＝3)中计数的cPEG5k-GNP的颗粒浓度与通过ICPMS计算的 cPEG5k-GNP的颗粒浓度在颗粒浓度范围上相一致，从5×10¹⁰至5×10¹³颗粒/mL(图13B)。此外，将在5％的葡萄糖(400μL，3×10¹⁴颗粒/mL) 中的cPEG5k-GNP被静脉内注射到大鼠中，并在注射后收集血液样品(t＝ 0.1、1、3、7、24、48小时)。使用纳米吸量管(n＝3)分选每个全血样品， 并通过ICPMS分析。图13C显示出在纳米吸量管中计数的cPEG5k-GNP 的数量和通过ICPMS测量的cPEG5k-GNP的数量而得到的可比较的结果。 这个实验证实了纳米吸量管是用于使用TEM评价纳米颗粒的浓度的简单 且方便的取样装置。该成功是归因于需要的超小的样品体积(<1μL)，并 且该工具可被用于分析在目标局部体液中的颗粒浓度。

总之，我们已经构建了用于制备均质样品和分选来自血液的纳米颗粒 的基于微片的纳米吸量管。除了基于形态学的信息之外，还开发了用于分 析在目标水性环境中的颗粒的形状、尺寸/尺寸分布、聚集/团聚状态和浓度 的基于TEM图像的定量方法。此外，该纳米吸量管适用于所有的TEM夹 具，并且可大规模生产，一次性使用，且方便用于装载样品和观察。聚乙 二醇化的金纳米颗粒的综合生理表征(包括它们在血液样品中的聚集/团聚 状态和颗粒数量)说明了该纳米吸量管装置用于在生物体液中的纳米颗粒 表征的潜力。因为该表征是基于单个颗粒的观察，该方法可以容易地扩展 到其他基于颗粒的材料，特别是用于量化生物体液中丰富的元素(例如，C、 H、O、N、P、Fe、Zn和Ca)组成的纳米颗粒。除了在干燥条件下的观察 之外，分选的薄层样品溶液可以被密封在所述纳米吸量管中并在其天然的 水性环境中成像。因此，在这项研究中，我们展示了我们的纳米吸量管是 一种简单且方便的取样装置，提供了使用TEM以对各种目标天然环境中的 纳米材料的尺寸/尺寸分布、形状、聚集/团聚状态和颗粒浓度的定量表征的 可能性。

使用计算机软件来分析纳米颗粒的图像。获取纳米颗粒的TEM图像并 将其存储在计算机中，然后进行预处理以提高对比度(图15A-B)并降低 噪音和背景(图15C-D)。在图像中的纳米颗粒被随后从背景分割(阈值图 像剪切)。然后，用户或观察者构建具有用户界面(颗粒选择器)的训练数 据库，以选择一级颗粒和二级颗粒(图15G)。最后，使该软件基于该训练 数据库的信息将单个纳米颗粒分类为一级颗粒或二级颗粒(图15J)。

图15A-J显示出从TEM数据库下载的原始图像(图15A)；通过直方 图均衡算法的增强对比度图像(图15B)；由于增强图像对比度的过程导致 的背景噪音的增加(图15C)；通过滑动平均滤波器减少背景噪声水平，且 同时保持颗粒的信号强度(图15D)；从TEM数据库下载的原始图像(图 15E)；通过使用交互式选择方法从图像分离颗粒的信号(图15F)；原始图像的放大图像(图15G)；在图像处理之后的分离的颗粒没有明显的特征失 真(图15H)；用户通过点击单个颗粒以用于构建训练数据库的程序截图(图 15I)和(图15J)。一级颗粒被标记为红色点(在此以“p”表示)，而二级颗 粒被标记为绿色点(在此以“s”表示)(I)；计算机软件能够区分每个颗粒(图 15J)。

图16A显示出在防晒乳液中的ZnO纳米颗粒的TEM图像、尺寸分布 和EDX分析。防晒乳液被直接装载在样品盒中，并干燥以用于TEM观察。 图16B显示出在防晒乳液中的TiO₂纳米颗粒的TEM图像、尺寸分布和EDX 分析。

图17A显示出在牛奶中的CaCO₃颗粒的TEM图像。牛奶被直接装载 在样品盒中，并干燥以用于TEM观察。图17B显示出在牛奶中的一级和聚 集/团聚的CaCO₃颗粒的TEM图像。图17C显示出在牛奶中的总的、一级 和聚集/团聚的CaCO₃颗粒的尺寸分布。牛奶被直接装载在样品盒中，并干 燥以用于TEM观察。

在图16A-图17C中所述的TEM样品盒中的腔室的高度为2μm。如乳 液、牛奶等的样品被直接装载在样品盒中，并干燥以用于TEM观察。

图18A显示出通过TEM/FEI/200keV、TEM/日立(Hitachi)/100keV和 STEM/FEI/30keV观察的在水性环境中的CMP浆料中的磨料的TEM图像。 图18B显示出在CMP浆料中的全部、一级和聚集/团聚的SiO₂磨料的TEM 图像和尺寸分布。在图18A-B中的CMP浆料直接被装载在具有0.2μm腔 室宽度的TEM样品盒中，并通过环氧树脂密封以用于TEM观察。

本发明的示例性实施方式的上述描述仅仅是为了说明和描述的目的， 且并不意图详尽或限制本发明至所公开的精确形式。在上述教导下可能有 许多修改和变化。

选择并描述实施方式和实施例以用于解释本发明的原理和其实践应 用，从而使本领域的其他技术人员能够应用本发明和各种实施方式，且各 种修改适用于预期的特定用途。对于本发明所属领域的技术人员而言，在 不脱离本发明的实质和范围的情况下，替代的实施方式将变得明显。因此， 本发明的范围是由所附的权利要求书，而不是由前面的说明书和其中描述 的示例性实施方式限定的。

在本发明的说明书中引用并讨论了一些参考文献，包括专利、专利申 请和各种出版物。提供这些参考文献的引用和/或讨论仅仅是为了阐明本发 明的描述，而不是承认任何这样的参考文献是对于在此描述的发明而言的 “现有技术”。在本说明书中引用和讨论的所有参考文献通过引用以其整体 并入本文，并与在各个参考文献单独通过引用并入本文的情况下的程度相 同。