阅读说明：本技术 一种山药dna提取的新方法 (novel method for extracting Chinese yam DNA ) 是由 薛刚 于 2018-05-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种山药DNA提取的新方法,包括：S1鲜山药去皮、洗净,在液氮中磨成山药粉；S2将山药粉在2-8倍重量的水中,水热处理1-2h获得混合浆液,处理温度为40-50℃,混合浆液经离心获得沉淀物；取沉淀物5-10g,加入15-20mL 65℃预热的裂解缓冲液和300-400μL的β-巯基乙醇,混合均匀,于60-70℃下保温40-50min;加入15-20mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液,混合后,室温下离心分离获得上清液；S4向上清液中加入等体积的异丙醇,出现絮状沉淀,离心分离获得DNA沉淀；S5 DNA洗涤：用体积浓度为75%的乙醇洗涤DNA沉淀,达到了提高山药DNA纯度的效果。(The invention discloses a novel method for extracting Chinese yam DNA, which comprises the following steps: s1 peeling fresh rhizoma Dioscoreae, cleaning, and grinding into rhizoma Dioscoreae powder in liquid nitrogen; s2, putting the yam powder into water with the weight 2-8 times of that of the yam powder, carrying out hydro-thermal treatment for 1-2h to obtain mixed slurry, wherein the treatment temperature is 40-50 ℃, and the mixed slurry is centrifuged to obtain a precipitate; taking 5-10g of precipitate, adding 15-20mL of lysis buffer preheated at 65 ℃ and 400 mu L of beta-mercaptoethanol at 300-70 ℃, uniformly mixing, preserving the heat at 60-70 ℃ for 40-50min, adding 15-20mL of phenol-chloroform-isoamylol solution with the volume ratio of 25:24:1, mixing, and performing centrifugal separation at room temperature to obtain supernatant; s4, adding isopropanol with the same volume into the supernatant to generate flocculent precipitate, and performing centrifugal separation to obtain DNA precipitate; s5DNA wash: the DNA sediment is washed by ethanol with the volume concentration of 75 percent, and the effect of improving the purity of the yam DNA is achieved.)

一种山药DNA提取的新方法

技术领域

本发明涉及植物DNA提取技术领域，特别涉及一种山药DNA提取的新方法。

背景技术

山药为薯蓣科，是植物薯蓣的地下块根，肉质细嫩，含有极丰富的营养保健物质，不仅可做成保健食品，而且具有调理疾病的药用价值。

我国山药种质资源丰富，实际生产中，对于山药的分类，通常以块茎的形状为依据，或者采用同工酶作为鉴别依据，然而，这两种方法均存在局限性。

利用分子标记从DNA分子水平揭示山药品种间的差异以及相关性，可以对其亲缘关系做出更为准确的鉴定，在分子水平上为山药种质资源的品种分类、质量评价、新品种选育以及核心种质的构建提供依据。

山药中多糖等次生代谢产物含量较高，影响山药DNA的提取进程，容易大量留存于山药DNA提取物中，导致山药DNA的纯度不高，进而影响山药DNA的后续使用。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种山药DNA提取的新方法，达到提高山药DNA提取纯度的目的。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种山药DNA提取的新方法，包括有以下步骤：

S1液氮研磨：鲜山药去皮、洗净，在液氮中磨成山药粉；

S2水热处理：将山药粉在2-8倍重量的水中，水热处理1-2h获得混合浆液，处理温度为40-50℃，混合浆液经离心获得沉淀物；

S3DNA提取：取沉淀物5-10g，加入15-20mL 65℃预热的裂解缓冲液和300-400μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于60-70℃下保温40-50min；加入15-20mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液；

S4DNA分离：向上清液中加入等体积的异丙醇，出现絮状沉淀，离心分离获得DNA沉淀；S5DNA洗涤：用体积浓度为75％的乙醇洗涤DNA沉淀，获得山药DNA。

通过采用上述方案，在DNA提取之前，预先进行水热处理，设置合理的水热处理参数，使得山药中的大量多糖等次生代谢产物分解并溶于水中，而大部分的山药DNA仍然存在于沉淀物中，通过离心分离，获得包含大量山药DNA的沉淀物，之后，再进行DNA的提取，能够极大的降低山药DNA中的山药多糖等次生代谢产物，提高山药DNA的提取纯度，便于山药DNA的分析，并为山药种质资源的品种分类、质量评价、新品种选育、核心种质的构建等提供依据。

DNA提取用裂解缓冲液为3％CTAB、100mmol/L Tris-HCl,pH 8.0、20mmol/L EDTA,pH 8.0、1.4mol/L NaCl、2％β-巯基乙醇。Tris-HCl(Ph8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA鳌合Mg²⁺或Mn²⁺离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效防止酚氧化成醌，避免褐变。

较佳的，加入淀粉酶，每1g山药粉，加入1-2个活力单位的淀粉酶。

通过采用上述方案，淀粉酶对山药中的淀粉起到分解作用，并溶于水中，通过离心分离，与存在于沉淀物中的山药DNA分离，进一步减少沉淀物中的杂质，提山药DNA的提取纯度。

较佳的，步骤S2中，辅助超声波处理，超声波功率为100-300W。

通过采用上述方案，经过超声波处理，超声波在水中传播产生特殊的“空化效应”，不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴，微气穴不断“***”产生微观的强大冲击波，冲击波不断作用在山药组织上，进一步剥蚀山药组织的内部结构，促进多糖等次生代谢产物的外逸，提高多糖的去除效果。

较佳的，步骤S2中，超声波间隔处理多次，每次超声波处理时间为5-8min,相邻两次超声波处理之间间隔20-40min。

较佳的，步骤S2中，超声波功率为200W，每次超声波处理时间6min,相邻两次超声波处理之间间隔30min。

通过采用上述方案，超声波处理时间过长，容易导致山药组织在超声处理过程中产生的碎片过多，造成多糖等次生代谢产物的外逸通道堵塞，影响多糖等次生代谢产物的外逸。限定超声波处理时间和间隔时间，给山药组织碎片足够的流动时间，避免其堵塞多糖等次生代谢产物的外逸通道，进一步提高多糖去除效果。此外，超声波间隔处理的设置还能降低能耗，进而降低成本。

较佳的，步骤S3中，取沉淀物8g，加入16mL 65℃预热的裂解缓冲液和320μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于65℃下保温45min；加入16mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液。

本发明的目的二：提供一种上述方法制备的山药DNA。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、DNA提取之前，预先通过水热处理去除山药中的大量多糖等次生代谢产物，之后，再对包含大量山药DNA的沉淀物进行DNA提取，能够极大的降低山药DNA中的山药多糖等次生代谢产物，提高山药DNA的提取纯度；

2、淀粉酶对山药中的淀粉起到分解作用，并溶于水中，通过离心分离，与存在于沉淀物中的山药DNA分离，进一步减少沉淀物中的杂质，提山药DNA的提取纯度；

3、水热过程中进行超声波辅助处理，促进多糖等次生代谢产物的外逸，提高多糖的去除效果；4、限定超声波处理时间和间隔时间，给山药组织碎片足够的流动时间，避免其堵塞多糖等次生代谢产物的外逸通道，进一步提高多糖去除效果。此外，超声波间隔处理的设置还能降低能耗，进而降低成本。

具体实施方式

以下对本发明作进一步详细说明。

实施例1

S1液氮研磨：鲜山药去皮、洗净，在液氮中磨成山药粉；

S2水热处理：将山药粉在2倍重量的水中，加入淀粉酶，每1g山药粉，加入1个活力单位的淀粉酶，水热处理1h获得混合浆液，处理温度为40℃，混合浆液经离心获得沉淀物；期间，辅助超声波处理，超声波功率为100W，超声波间隔处理两次，每次超声波处理时间为5min,相邻两次超声波处理之间间隔20min；

S3DNA提取：取沉淀物5g，加入15mL 65℃预热的裂解缓冲液和300μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于60℃下保温40min；加入15mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液；

S4DNA分离：向上清液中加入等体积的异丙醇，出现絮状沉淀，离心分离获得DNA沉淀；

S5DNA洗涤：用体积浓度为75％的乙醇洗涤DNA沉淀，获得山药DNA，

上述裂解缓冲液的配比为：3％CTAB；100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)；20mmol/L EDTA(pH 8.0)；1.4mol/L NaCl；2％β-巯基乙醇。100mL裂解缓冲液的配置过程为：取10％CTAB30mL，加1mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)10mL，加0.5mol/L EDTA(pH 8.0)4mL，加5mol/L NaCl28mL，定容至100mL，高压灭菌20min，β-巯基乙醇现用现加。

实施例2

S1液氮研磨：鲜山药去皮、洗净，在液氮中磨成山药粉；

S2水热处理：将山药粉在2-8倍重量的水中，加入淀粉酶，每1g山药粉，加入1.5个活力单位的淀粉酶，水热处理1.5h获得混合浆液，处理温度为40-50℃，混合浆液经离心获得沉淀物；期间，辅助超声波处理，超声波功率为200W，超声波间隔处理两次，每次超声波处理时间为6min,相邻两次超声波处理之间间隔30min；

S3DNA提取：取沉淀物8g，加入16mL 65℃预热的裂解缓冲液和320μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于65℃下保温45min；加入16mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液；

S4DNA分离：向上清液中加入等体积的异丙醇，出现絮状沉淀，离心分离获得DNA沉淀；

S5DNA洗涤：用体积浓度为75％的乙醇洗涤DNA沉淀，获得山药DNA，

裂解缓冲液的配比和配置同实施例1。

实施例3

S1液氮研磨：鲜山药去皮、洗净，在液氮中磨成山药粉；

S2水热处理：将山药粉在8倍重量的水中，加入淀粉酶，每1g山药粉，加入2个活力单位的淀粉酶，水热处理2h获得混合浆液，处理温度为50℃，混合浆液经离心获得沉淀物；期间，辅助超声波处理，超声波功率为300W，超声波间隔处理两次，每次超声波处理时间为8min,相邻两次超声波处理之间间隔40min；

S3DNA提取：取沉淀物10g，加入20mL 65℃预热的裂解缓冲液和400μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于70℃下保温50min；加入20mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液；

S4DNA分离：向上清液中加入等体积的异丙醇，出现絮状沉淀，离心分离获得DNA沉淀；

S5DNA洗涤：用体积浓度为75％的乙醇洗涤DNA沉淀，获得山药DNA，

裂解缓冲液的配比和配置同实施例1。

实施例4与实施例2不同的是：S2中不辅助超声波处理。

实施例5与实施例2不同的是：S2中超声波处理不间隔进行，而是持续超声12min。

实施例6与实施例2不同的是：不添加淀粉酶。

山药DNA浓度和纯度的测定：采用常规方法，用UV-1810型紫外-可见分光光度计，分别测定山药DNA样品在260nm和280nm的吸光值OD260和OD280，DNA纯度计算公式如下：

检测数据列于表1。

表1DNA纯度检测数据。

项目	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
							OD260/OD280	1.5-1.7	1.6-1.8	1.5-1.8	1.2-1.5	1.3-1.6	1.4-1.7

纯DNA的OD260/OD280≈1.8，OD260/OD280数值越接近1.8，DNA纯度越高。由表1中的检测结果可知，实施例1-3的OD260/OD280值更接近1.8，说明本发明的方法制备的山药DNA的纯度较高，超声波处理和淀粉酶的加入有效提高了制备山药DNA的纯度。对比实施例2、5可以看出，超声波间隔处理的手段也能提高山药DNA的提取纯度。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。