阅读说明：本技术 百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用 (Application of thymol in preparation of medicine for treating biofilm infection ) 是由 尹立子 袁中伟 苟玉虹 欧阳萍 陈涵 谷可欣 舒刚 梁晓霞 殷中琼 于 2019-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用。该药物还包括万古霉素,按照质量份,该药物包括百里香酚20-45份、万古霉素5-20份。同时使用万古霉素和百里香酚可完全清除已形成的生物被膜和粘附细菌。(The invention discloses an application of thymol in preparing a medicament for treating biofilm infection. The medicine also comprises vancomycin, and the medicine comprises 20-45 parts of thymol and 5-20 parts of vancomycin in parts by mass. The use of both vancomycin and thymol completely removed the biofilm and adherent bacteria that had formed.)

百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用

技术领域

本发明属于药物研发技术领域，具体地说，涉及一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用，尤其涉及一种百里香酚在制备治疗植入性医疗器械形成的生物被膜感染药物中的应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）是社区感染和医院感染中常见的病原菌，危害极大。特别是从中分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S. aureus, MRSA)，由于其引起的感染发病率、致死率和治疗费用均远高于普通的金黄色葡萄球菌感染，严重威胁人类的生命安全。MRSA感染迁延难愈的重要原因之一是细菌生物被膜的形成。生物被膜是吸附于惰性或活性材料表面的微生物群落。它的外部被由多糖、DNA和水等物质组成的胞外聚合物包裹。抗菌药物几乎不能穿过生物被膜对休眠细菌发挥作用。MRSA通过粘附在植入性医疗器械和组织表面形成生物被膜，造成慢性感染，表现为难治愈，易复发的特点。因此寻找一种能有效抑制生物被膜的形成和破坏生物被膜的药物已经迫在眉睫。

目前对于国内外抗生物被膜的治疗主要通过物理手段清除，然而该方法有众多不足之处。而化学药物的研发周期长，容易产生耐药性。因此天然药物成为抗生物被膜治疗的研究热点。百里香酚（5-甲基-2-异丙基酚）是一种无色水晶单萜酚，主要存在于百里香属（Thymus）、罗勒属（Ocimum）和牛至属（Origanum）等植物提取的精油中。研究发现百里香酚具有多种药理作用，包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化和自由基清除等。

本实验室在先前的研究发现百里香酚可以抑制MRSA生物被膜的形成（袁中伟，陈志英，甘盈盈，等.百里香酚对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制[J].华南农业大学学报，2018，39(6): 18-23.）。

现有实验表明，目前没有有效的药物和方法治疗植入性医疗器械感染，物理手段需要把医疗器械取出进行除去生物被膜，这样对于植入的医疗器械非常不便。单独使用百里香酚不能完全清除生物被膜，而且所需浓度较大，预后较差。在临床上需要长期大剂量服药，且对机体有一定损伤。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用。

可选地，所述的生物被膜为植入性医疗器械形成的生物被膜。

可选地，所述药物还包括万古霉素，按照质量份，该药物包括百里香酚20-45份、万古霉素5-20份。

可选地，按照质量份，该药物包括百里香酚20-40份、万古霉素5-10份。

可选地，按照质量份，该药物包括百里香酚40份、万古霉素20份。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

百里香酚和万古霉素均对体内MRSA已形成的早期生物被膜有较好的清除作用，能减少细菌的粘附。同时两者均可降低MRSA早期生物被膜腹腔感染小鼠的炎症水平，改善腹腔炎症，。联合用药结果提示，同时使用万古霉素（40 mg/kg）和百里香酚（20 mg/kg）可完全清除已形成的生物被膜和粘附细菌，减轻病理损伤，改善炎症，预后良好。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明载体SEM图；其中，A：PBS组；B：百里香酚组；C：万古霉素组；D：联合给药低剂量组；E：联合给药中剂量组；F：联合给药高剂量组；

图2是本发明病理观察；其中，A：PBS组；B：百里香酚组；C：万古霉素组；D：联合给药低剂量组；E：联合给药中剂量组；F：联合给药高剂量组；

图3是本发明TNF-α和IL-6浓度；其中，A：TNF-α；B：IL-6。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用。

进一步地，所述药物还包括万古霉素，按照质量份，该药物包括百里香酚20-45份、万古霉素5-20份。

进一步地，按照质量份，该药物包括百里香酚20-40份、万古霉素10-20份。

进一步地，按照质量份，该药物包括百里香酚40份、万古霉素20份。

实施例1

一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用，包括40mg百里香酚。

实施例2

一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用，包括百里香酚40mg、万古霉素20mg。

实施例3

一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用，包括百里香酚40mg、万古霉素10mg。

实施例4

一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用，包括百里香酚40mg、万古霉素10mg。

实施例5

一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用，包括百里香酚20mg、万古霉素20mg。

实施例6

一种百里香酚在制备治疗生物被膜感染药物中的应用，包括百里香酚45mg、万古霉素5mg。

下面结合具体的实验数据进行说明本发明的技术效果：

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

MRSA标准菌株USA300（ATCC® BAA-1717）购于美国标准菌种库。

1.1.2 实验动物

8~9周龄的BalB/c 小鼠（雌性），重量20 ± 2 g（SPF 级），购自成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号为SCXK（川）2015–030。

1.1.3 载体

一次性使用静脉输液针（成都市新津事丰医疗器械有限公司）的输液管裁成长度为1毫米后作为MRSA生物被膜的载体，备用。

1.1.4 主要试剂

百里香酚（纯度＞98%）购自成都瑞芬思生物科技公司；盐酸万古霉素、Gluta固定液（电镜专用，2.5%）和PBS缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；脑心浸出液肉汤（BHI）和脑心浸出液琼脂（BHIA）购自青岛海博生物技术有限公司；Mouse TNF-α ELISA Kit和Mouse IL-6ELISA Kit购自杭州联科生物技术股份有限公司。

1.1.5 仪器与设备

UV-2000型紫外分光光度计（UNICO，美国）；HT7700扫描电镜（Hitachi，日本）；ZD-85A气浴恒温振荡器（金坛市科析仪器有限公司，中国）；BC-2800 Vet血液细胞分析仪（迈瑞生物医疗电子股份有限公司，中国）。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制

戊巴比妥钠用无菌生理盐水配制成浓度为0.3%备用，百里香酚根据需求用DMSO配成相应浓度。

1.2.2 细菌复苏

取出-80 ℃保存的USA300菌株，复苏后接种到BHIA平板上37 ℃培养18 h，挑取一个菌落移入10 mL的BHI培养液中，置于气浴恒温振荡器（37℃，200 r·min-1）培养20 h后将菌液3 000 r·min-1离心10 min。去掉上清液用含3%蔗糖的BHI重悬底部细菌，然后将悬浮液用含3%蔗糖（W/V）的BHI调整为OD_{600 nm}=0.05。

1.2.3 生物被膜载体构建

根据岑艳灵等人的方法（岑艳灵，李亚楠，孔晋亮，等.黄芩苷联合美罗培南对小鼠腹腔铜绿假单胞菌早期生物被膜的体内影响[J]. 中华医院感染学杂志, 2017, 27(1).）构建载体，在50 mL的锥形瓶中加入10 mL上述D_{600 nm}=0.05的菌液和输液管载体。置于气浴恒温振荡器（37 ℃，200 r·min-1）培养20 h使生物被膜粘附于载体。植入时，将载体上粘附的细菌数目调整至平均数为6.9×10⁵。

1.2.4 实验动物分组及建立腹腔感染模型

小鼠60只，随机分为6组：PBS组、万古霉素组、百里香酚组（实施例1）、联合给药高剂量组（实施例2制备的药物，mg/kg）、联合给药中剂量组（实施例3制备的药物，mg/kg）、联合给药低剂量组（实施例4制备的药物，mg/kg）。先用碘伏在小鼠左下腹消毒，然后腹腔注射0.3%戊巴比妥钠0.2 mL。待小鼠麻醉后在其左腹股沟处剪开约0.5 cm的切口，逐层暴露皮肤及腹壁进入腹腔，用镊子取出带有MRSA生物被膜的载体，在无菌的PBS中去除表面的浮游菌，然后植入腹腔。载体植入后进行创口缝合并消毒。30 min后各组小鼠按上述给药浓度腹腔注射0.1 mL药液，PBS组给予等体积无菌PBS。

1.2.5 白细胞计数

给药24 h后，采用摘眼球采血法采血，采集的全血收集在0.6 mL预装抗凝剂的离心管中。确保血液与抗凝剂充分混匀后，用全自动动物血液细胞分析仪检测白细胞数量。

1.2.6 载体表面菌落计数

给药24 h后处死小鼠，取出载体并用无菌PBS冲洗表面附着物。然后置入有1 mL无菌PBS的离心管中，漩涡震荡10 min，取100 μL进行连续稀释测定载体表面活菌数量。

1.2.7 载体SEM观察

给药24 h后处死小鼠，取出的载体。先用无菌PBS洗涤3次，然后放入2.5%的戊二醛固定。再用PBS（pH7.4）洗3次，每次10 min。

1.2.8 组织病理学观察

将载体周围的腹膜组织小心分离并固定在10％甲醛溶液中。组织切片采用苏木精和伊红染色。

1.2.9 酶联免疫吸附试验（ELISA）

根据ELISA试剂盒说明（Lianke，中国），检测血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的细胞因子水平。

2 结果

2.1 载体菌落计数

药物作用24 h 后，不同给药组的菌落数均少于PBS组（表1）。其中，联合给药高剂量组基本没有细菌生长。与PBS组相比，联合给药高剂量组（实施例2）的菌落数减少72.55±22.67% (P<0.01)。

表1 载体菌落计数（平均值±标准差，Log10 CFU/mL，*P<0.05表示差异显著，与PBS组相比）

分组	菌落数(Log<sub>10</sub> CFU/mL)
		PBS组	4.80 ± 0.25
万古霉素组	4.25 ± 0.43*
		实施例1	3.17 ± 0.42**
实施例4	3.44 ± 0.55**
		实施例3	3.05 ± 0.85**
实施例2	1.40 ± 1.01**

2.2 载体SEM观察

扫描电镜结果显示，PBS组和实施例1组的载体被稠厚的生物被膜包裹，万古霉素组中粘附的生物被膜减少，联合用药组（实施例2-4）载体表面细菌随着浓度的增大而减少，菌体轮廓隐约可见，其中联合用药高剂量组（实施例2）基本未观察到生物被膜，仅存少量散落细菌粘附（图1 A-F）。

2.3 病理学观察

在PBS组中，小鼠的腹壁明显增厚并且毛细血管壁扩张，在肌细胞之间观察到许多中性粒细胞。百里香酚组（实施例1）小鼠的肌肉细胞结构完整，伤口处出现一些炎症细胞。在万古霉素组中发现少量炎症细胞。与PBS组相比，联合用药的三组（实施例2-4）中炎症细胞减少，特别是在高剂量组合组（实施例2）中，几乎观察不到的炎症细胞（图2）。

2.4 白细胞计数

白细胞计数结果如表2所示，给药24 h后，除了PBS组，所有组中小鼠的白细胞数均恢复到正常范围（0.8×10⁹/L ~ 6.8×10⁹/L）。其中联合用药高剂量组（实施例2）和PBS组相比差异显著，具有统计学意义。

表2 不同组的白细胞计数（结果以“平均值±标准差”表示，*P<0.05表示差异显著，与PBS组相比）

分组	白细胞数(10<sup>9</sup>/L)
		PBS	7.43±1.73
万古霉素组	5.47±1.20*
		实施例1	6.29±1.40
实施例4	3.24±1.02**
		实施例3	4.07±1.69**
实施例2	4.43±1.87*

2.5 炎症因子测定

细胞因子TNF-α和IL-6的水平显示在图3中。接受万古霉素和百里酚处理的小鼠，特别是高剂量（实施例2）和中等剂量（实施例3），血清中的TNF-α和IL-6与PBS组相比差异显著。治疗24 h后，高，中剂量组TNF-α含量分别比PBS组降低22.57 ± 8.81%（P <0.01）和15.26± 5.31%（P <0.01）。高，中剂量组IL-6含量分别比PBS组升高26.96 ± 9.95%（P <0.01）和33.69 ± 10.73%（P <0.01）。

3讨论：

在本发明中构建了小鼠腹腔MRSA早期生物被膜感染模型，单独给予百里香酚或万古霉素治疗后，载体表面仍有大量细菌粘附，不能彻底清除已形成的生物被膜。而两者联合后，尤其是高剂量组（实施例2），对生物被膜的破坏明显，只剩少量细菌粘附。这表明百里香酚对体内早期MRSA生物被膜有清除作用，而且与万古霉素联合作用后可加强万古霉素对生物被膜的清除能力。

组织病理学观察是诊断疾病的直接方法。百里酚和万古霉素分别可以减轻病理损伤。高剂量联合组（实施例2）的结果表明小鼠治疗后预后良好。

白细胞的检测是检查机体炎症反应的重要指标。给药后除PBS组，其他组白细胞数目均恢复正常范围。其中万古霉素可能是通过杀死浮游细菌，使得炎症水平降低。而百里香酚可能是一方面能抑制细菌生长，一方面自身就具有抗炎作用。

TNF-α和IL-6被广泛用于研究体内的炎症反应。 TNF-α是最早和最重要的炎症介质之一。 IL-6可诱导B细胞分化和抗体产生，诱导T细胞活化，增殖和分化，并参与机体的免疫反应。在本发明中，百里酚组（实施例1）TNF-α没有显著降低。这可能是生物膜不断刺激机体产生炎症反应。高，中剂量（实施例2和3）组合治疗中TNF-α明显下降。这可能是由于大部分生物膜被移除，刺激减少。百里酚组（实施例1）中IL-6的增加以及高剂量和中剂量组的联合治疗可能是由于生物膜的破坏和大量细菌的释放，导致细胞免疫和体液免疫快速响应。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。