一种基于生物三维打印的体外gbm侵袭模型的构建方法
阅读说明：本技术 一种基于生物三维打印的体外gbm侵袭模型的构建方法 (Method for constructing in-vitro GBM (GBM) invasion model based on biological three-dimensional printing ) 是由 马梁 李雨亭 吴钰桐 张斌 杨华勇 于 2019-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于生物三维打印的体外胶质母细胞瘤(GBM)侵袭模型的构建方法,属于组织工程和生物三维(3D)打印领域。此方法采用含细胞的水凝胶作为“生物墨水”,利用生物三维打印机构建体外GBM侵袭模型。模型结构由载有正常人脑胶质细胞的水凝胶打印而成,并接种神经胶质瘤细胞团。此模型对研究GBM的侵润性生长具有重要意义,有望为多形性神经胶质母细胞瘤的治疗方法研究提供帮助。(The invention discloses a method for constructing an in-vitro glioblastoma multiforme (GBM) invasion model based on biological three-dimensional printing, and belongs to the field of tissue engineering and biological three-dimensional (3D) printing. The method adopts hydrogel containing cells as biological ink and utilizes a biological three-dimensional printer to construct an in-vitro GBM invasion model. The model structure is printed by hydrogel loaded with normal human brain glial cells, and is inoculated with glioma cell mass. The model has important significance for researching the invasive growth of GBM, and is expected to provide help for the research of the treatment method of the glioblastoma multiforme.)
技术领域
本发明涉及一种基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法，用于构建具有高细胞存活率的体外GBM侵袭模型，属于组织工程技术和生物三维(3D)打印领域。
背景技术
癌症严重危害着人民群众生命健康安全。全球疾病负担组织研究表明，仅2016年，全球因为癌症造成高达893万人死亡，另据美国癌症研究协会(AACR)发布的2017年度癌症进展报告表明，全球每年确诊的癌症病例数、癌症死亡人数都在不断增加，癌症病例数更是有可能在2035年突破2400万，这将造成医疗成本的大幅上升，在我国，2015年新增病例429万例，死亡281万例，亟需找到更加有效的研究与治疗癌症的新方法。
众所周知，抗癌药物的研发需要投入巨额的人力、财力和时间，往往要耗费十几年与数十亿美元的投入才能研发出一个切实有效的抗癌药物。传统的抗癌药物试验时通常选用二维平面细胞培养的方法，这种方法虽然简便快速，然而二维表面上的微环境所含的生物学信息，与含有多种特异性生物学信号(生物力学与细胞信号转导)的真实体内细胞外基质三维网络相去甚远，因为细胞对微环境的感知、识别以及刺激-响应行为以及自身功能调节都会存在显著性差异，不能反映体内真实的肿瘤细胞行为，从而导致药物研发失败。近年来，人们开始利用生物相容性优良的三维多孔材料、水凝胶等来构建肿瘤体外模型，并发现肿瘤细胞能够在三维多孔支架中生长、增殖、迁移和分化。
神经胶质瘤，也叫作多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)，是脑类肿瘤中侵袭性最强的肿瘤。它占脑瘤的15％，是脑瘤中第二常见的肿瘤，仅次于脑膜瘤。现在治疗它的方法主要有手术切除，放疗和化疗，但即使经过了最大程度的治疗，胶质瘤也经常复发，患者在确诊后的寿命通常只有12到15个月，只有3％到5％的人能够存活超过五年。若不接受治疗，存活时间通常只有三个月。每年每十万人中就有3人被确诊为此病。而GBM不同于其他肿瘤的最大特点就是其存在的原位侵袭性，GBM并不像其余癌症那样进行远端转移而是会发生原位的侵袭，这一特性使得GBM术后极易复发。因此研究胶质母细胞瘤的侵袭特性，了解其发生发展的分子机制对于治疗此类疾病具有重要的意义。传统二维细胞培养模型缺乏细胞外基质与复杂的三维结构，动物模型成本高昂且具有伦理学问题，因此迫切需要新的研究手段来研究GBM的侵润性生长。3D生物打印技术能够快速简便地构建三维含细胞的水凝胶体系，使得直接构建体外3D胶质瘤模型成为了可能。国内外现有的体外肿瘤模型大部分都是将含有细胞的水凝胶以挤出和喷墨等方式构成网格状的或实心的模型，或者先用水凝胶构建出肿瘤微环境基底，再将肿瘤等相关细胞嵌入或注射到水凝胶环境中。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足之处，发明一种基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法，
本发明的技术方案如下：
基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)配制含有人脑胶质细胞的生物墨水；所述生物墨水的溶剂为纯净水，生物墨水成分包括透明质酸、藻酸盐和明胶；所述透明质酸在生物墨水中的含量为0.01-0.02g/ml，所述藻酸盐在所述生物墨水中的含量为0.01-0.02g/ml，所述明胶在所述生物墨水中的含量为0.05-0.15g/ml；
2)将所述生物墨水加载到多喷头的微挤出式生物三维打印机的供料系统中，按照指定路径打印支架结构；得到的支架结构用氯化钙溶液浸渍；
3)在步骤2)得到的支架结构中均匀接种GBM细胞团；
4)将接种了GBM的支架结构置于细胞培养箱持续培养，每隔2-3天换液，获得具有高细胞存活率的体外GBM侵袭模型，并在培养的第1,7,14天分别提取培养结构的RNA进行测序。
优选的，所述的生物墨水中，所述透明质酸在所述生物墨水中的选用含量为0.02g/ml，所述藻酸盐在所述生物墨水中的选用含量为0.02g/ml，所述明胶在所述生物墨水中的选用含量为0.010g/ml。
优选的，所述生物墨水中还包括作为诱导侵袭因子的葡萄糖，葡萄糖的加入量为0.005-0.02g/ml。
优选的，所述的支架结构为单层、多层的网格结构或立体框架结构。
优选的，所述的步骤4)中，培养过程使用的培养基由普通细胞培养基、胎牛血清以及双抗配制而成。
优选的，所述的GBM细胞团的获得方法为采用悬滴法，具体过程为：贴壁培养U87细胞，当培养瓶底部贴壁的U87细胞生长增殖到占90％体积时，离心并用培养基吹打混匀，计算细胞浓度，稀释到100-200万个/毫升，吸取10μl的含U87细胞的培养液滴，滴在培养皿盖反面，在培养皿内加入5毫升的PBS用来形成水合环境腔，最后盖上培养皿盖，用封口膜包裹，置入37摄氏度细胞培养箱；悬滴内分散的细胞在重力作用下逐渐聚集形成若干片状聚集体，片状聚集体逐渐相互靠近聚合，经过6-8天的培养后，最终形成直径为200-300μm的球体，即为GBM细胞团。
本发明可通过一种复合调控方法，确保模型中细胞存活率达到90％以上且结构的机械性能保持稳定。
一般来说，为了使体外模型所构建的微环境尽可能地接近体内真实环境，以尽可能真实地模拟体内药物反应等各项生物生理过程，根据不同的细胞和组织，生物墨水的组分是各不相同的。
在这里，由于人脑中约20％的体积是细胞外基质，其中绝大部分是由透明质酸(HA)组成的，而在大脑的细胞组成上，占90％细胞体积的是神经胶质细胞，所以选择HA与HEB的混合体系来模拟大脑的组成。虽然生物打印组织结构的直接打印性能可能取决于生物墨水本身的物理性质(如黏性)，但结构随后的稳定性依赖于附加的交联步骤。本发明选择了海藻酸钠与氯化钙溶液(40wt.％)通过钙离子胶化的物理交联方式，通过改变组成生物墨水的聚合物的浓度和交联密度，在包括组织刚度和弹性的广泛范围内对生物打印后所得的水凝胶基质的机械性能进行精调；而明胶作为非常重要的天然生物高分子材料之一，具有吸水和支撑骨架的作用，明胶微粒溶于水后，能相互吸引、交织，形成叠叠层层的网状结构，并随温度下降而凝聚，使打印结构能保持稳定形态，即使承受较大的荷载也不变形。在打印过程中可减少结构脆性，有利于成型。且明胶是天然的生物材料，具有极好的生物活性，如生物相容性和固有的细胞粘附配体(如RGD)，有利于结构中细胞的生存。
所以生物墨水组分的正确选择以及打印过程中根据生物墨水的如粘度等各项性能进行的合理个性化工艺调控，使最终获得的GBM侵袭模型中细胞存活率达到90％以上且结构的机械性能在恒温37摄氏度的细胞培养箱中持续培养14天后仍能保持稳定。
本发明获得的体外GBM侵袭模型通过模拟体内的GBM侵袭过程，可以用来研究如侵袭前后的基因表达差异、在不同诱导侵袭因子作用下GBM的侵袭特性等生物学问题，为研究神经胶质瘤侵袭性生长的分子机制奠定理论和实验基础。同时，此模型的构建方法也可适用于其他生物系统，为模拟细胞间相互作用及微环境控制提供新的方法和手段。
诱导肿瘤细胞的迁移和侵袭是体外肿瘤模型的重要功能之一。在大多数二维培养研究和芯片构建的例子中，国内外学者广泛采用制造低氧或缺氧环境的方法来诱导肿瘤侵袭的发生，而在体外三维复杂组织器官的模型构建中，局部缺氧环境的设计较为困难，且其引入的其他材料及局部特殊结构设计也会对模拟体内肿瘤微环境的准确性造成一定程度的负面影响，所以本发明使用葡萄糖作为诱导侵袭因子。模型底部由加入0.005-0.02g/ml(优选-0.02g/ml)葡萄糖的生物墨水打印的实心四边形薄膜状的结构构成，用作肿瘤细胞发生侵袭过程的诱导。葡萄糖向模型上方扩散形成的浓度梯度的设计可有效诱导接种在模型表面的GBM球状体中的肿瘤细胞向下发生侵袭，以此模拟体内神经胶质瘤细胞的侵袭过程。
附图说明
图1是体外GBM侵袭模型支架结构示意图。
图2是体外GBM侵袭模型构建方法示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
如图1-2所示，本实施例中基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法，包括如下步骤：
1)配制含有人脑胶质细胞的生物墨水；所述生物墨水的溶剂为纯净水，生物墨水成分包括透明质酸、藻酸盐和明胶；所述透明质酸在所述生物墨水中的选用含量为0.02g/ml，所述藻酸盐在所述生物墨水中的选用含量为0.02g/ml，所述明胶在所述生物墨水中的选用含量为0.010g/ml。所述生物墨水中还包括作为诱导侵袭因子的葡萄糖，葡萄糖的加入量为0.02g/ml。
2)将所述生物墨水加载到多喷头的微挤出式生物三维打印机的供料系统中，按照指定路径打印支架结构；得到的支架结构用氯化钙溶液浸渍，如图1所示；
3)在步骤2)得到的支架结构中均匀接种GBM细胞团；
4)将接种了GBM的支架结构置于细胞培养箱持续培养，每隔2天换液，获得具有高细胞存活率的体外GBM侵袭模型。
为了得到GBM微肿瘤球状体，本发明使用悬滴法。当培养瓶底部贴壁的U87细胞生长增殖到约占90％体积时，离心并用培养基吹打混匀，计算细胞浓度，稀释到100-200万个/毫升，吸取若干10μl左右的含U87细胞的培养液滴，滴在直径60mm的培养皿盖反面，注意每滴之间留出一定间隔以防相互碰到，在培养皿内加入5毫升的PBS用来形成水合环境腔，最后盖上培养皿盖，用封口膜包裹，置入37摄氏度细胞培养箱。悬滴内分散的细胞在重力作用下逐渐聚集形成若干片状聚集体，片状体逐渐相互靠近聚合，经过6-8天的培养后，最终形成直径约为200-300μm的球体，即为GBM微肿瘤球状体。
本发明可应用于药物筛选等领域，通过设置多组对照实验，可研究GBM侵袭性生长的分子机制以及在药物作用下BM侵袭性生长的分子机制。三维对照组可包括单独培养的GBM球状体、支架中不含人脑胶质细胞的GBM侵袭模型以及不接种GBM球状体的只含人脑胶质细胞的模型支架；二维对照组包括只含有神经胶质瘤细胞U87和人脑胶质细胞HEB中的一种进行单独二维培养的对照组，以及将两种细胞按实验组中相同的比例进行混合二维培养的对照组。分别在培养的第1,7,14天将实验组和对照组的模型剪碎，采用标准提取RNA步骤提取模型中所有细胞的RNA，进行RNA测序，分析测序结果。通过基因测序的结果比对，可以获得多种细胞三维共培养与单一细胞三维或二维培养情况下基因表达的差异，为研究GBM侵袭性生长的分子机制积累更多有效的实验数据。
平面肿瘤模型与体内环境有着明显的差异，尤其是在药物反应上。这种差异是由于这些二维模型缺乏能够行使功能的3D肿瘤微环境，从而导致细胞之间和细胞与外基质之间的相互作用不足。此外，在塑料表面培养(单独二维培养的对照组)的过程中，细胞更倾向于表现出能够使它们附着在坚硬基底上的表现型。因此，平面肿瘤模型的利用度和有效性都受到了限制。本发明获得的体外GBM侵袭模型通过模拟体内的GBM侵袭过程，可以用来研究如侵袭前后的基因表达差异、在不同诱导侵袭因子作用下GBM的侵袭特性等生物学问题，为研究神经胶质瘤侵袭性生长的分子机制奠定理论和实验基础。同时，此模型的构建方法也可适用于其他生物系统，为模拟细胞间相互作用及微环境控制提供新的方法和手段。