一种秸秆混合发酵饲料及其生产方法
阅读说明：本技术 一种秸秆混合发酵饲料及其生产方法 (Straw mixed fermentation feed and production method thereof ) 是由 江正兵 宋慧婷 李华南 肖文静 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物发酵领域,尤其涉及一种秸秆混合发酵饲料及其生产方法。秸秆混合发酵饲料的生产方法,包括步骤：(1)配制混合发酵制剂：将全细胞纤维素酶和乳酸菌制剂溶于水中制得混合发酵液,所述全细胞纤维素酶为分泌纤维素酶的重组酿酒酵母菌；(2)将混合发酵液与秸秆混合均匀,混合均匀后装袋密封进行青贮发酵。本发明的秸秆混合发酵饲料能够提高秸秆饲料中纤维素、半纤维素的降解效率,而且能够提高秸秆饲料中单细胞蛋白含量,提升秸秆饲料品质。(The invention relates to the field of biological fermentation, in particular to a straw mixed fermentation feed and a production method thereof. The production method of the straw mixed fermented feed comprises the following steps: (1) preparing a mixed fermentation preparation: dissolving whole-cell cellulase and a lactobacillus preparation in water to prepare a mixed fermentation liquid, wherein the whole-cell cellulase is recombinant saccharomyces cerevisiae for secreting cellulase; (2) and uniformly mixing the mixed fermentation liquor and the straws, bagging and sealing after uniform mixing for ensiling fermentation. The straw mixed fermentation feed can improve the degradation efficiency of cellulose and hemicellulose in the straw feed, can improve the content of single cell protein in the straw feed, and can improve the quality of the straw feed.)
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，尤其涉及一种秸秆混合发酵饲料及其生产方法。
背景技术
我国秸秆资源丰富，据估计我国每年产生3.27亿吨玉米秸秆。大部分玉米秸秆最后都自然腐解或直接焚烧，这不但会破坏土壤表层有机质，还会引起空气污染，对人类健康产生危害。玉米秸秆富含有机质，蛋白质与脂肪也占有一定比例，基本组织构成以纤维素、中纤维素及木质素为主，在饲料、肥料、燃料食用菌集料、加工原料等方面具有很高的开发利用价值。秸秆饲料化是解决秸秆资源过剩及不合理利用的有效途径之一，目前，饲料化的主要处理方法分为化学处理法，物理处理法和生物处理法，生物处理法因其能源消耗少，环境污染小，操作简便无危险等特点而受到广泛关注。
目前，秸秆饲料化的生物处理法主要依靠微生物进行青贮发酵过程来实现秸秆中相关成分的生物降解及生物转化，青贮是将秸秆通过乳酸菌厌氧发酵而获得饲料的过程，确保青贮成功的关键因素是保持乳酸菌持续累积乳酸并维持较低pH值，但乳酸菌繁殖需要有充足的可溶性糖分供给，而秸秆中可溶性碳水化合物较少，无法维持青贮过程的持续性。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种秸秆混合发酵饲料及其生产方法，能够提高秸秆饲料中纤维素、半纤维素的降解效率，而且能够提高秸秆饲料中单细胞蛋白含量，提升秸秆饲料品质。
为实现上述目的，本发明所设计的一种秸秆混合发酵饲料的生产方法，其特征在于，包括步骤：
(1)配制混合发酵制剂
将全细胞纤维素酶和乳酸菌制剂溶于水中制得混合发酵液，所述全细胞纤维素酶为分泌纤维素酶的重组酿酒酵母菌；
(2)将混合发酵液与秸秆混合均匀，混合均匀后装袋密封进行青贮发酵。
与传统的青贮饲料化的方法相比，本发明添加了全细胞纤维素酶，全细胞纤维素酶为重组酿酒酵母菌，重组酿酒酵母菌分泌纤维素酶，以全细胞为载体的全细胞纤维素酶联合乳酸菌进行秸秆的饲料化处理产生协同效应，全细胞纤维素酶降解秸秆中纤维素，降解产物为乳酸菌提供发酵所需营养成分，维持乳酸菌发酵进程，提高玉米秸秆的处理效果，并同时利用乳酸菌的活动来清除纤维素酶所分解的产物、解除纤维素酶的反馈抑制作用；而且使用全细胞酿酒酵母纤维素酶在发酵的玉米秸秆中自行繁殖，既可促进乳酸菌发酵，又可不受添加量较小的限制，降低纤维素酶成本，且酿酒酵母能提供大量丰富单细胞蛋白，可提高玉米秸秆饲用品质。
作为优选方案，所述混合发酵液与秸秆的质量比为1～2：1～3；所述混合发酵液中全细胞纤维素酶的浓度为40～60g/L，乳酸菌制剂的浓度为10～20g/L。
作为优选方案，所述全细胞纤维素酶的制备方法为：
(1)纤维素酶表达载体pHBM-368-PGK-CBH2构建
利用基因工程技术将具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的目的基因CBH2***到载体pHBM368-PGK中，得到纤维素酶表达载体pHBM-368-PGK-CBH2；
(2)将纤维素酶表达载体pHBM-368-PGK-CBH2转化到酿酒酵母中，通过营养缺陷型培养基筛选得到全细胞酿酒酵母纤维素酶；
(3)以全细胞酿酒酵母纤维素酶为原始制备菌，通过接种活化，摇瓶培养，扩大转接，发酵罐培养，低温干燥质粒过程得到全细胞纤维素酶。
作为优选方案，所述步骤(2)中，将混合发酵液均匀喷洒在秸秆上，并在喷洒过程中反复搅拌秸秆，然后装袋密封进行青贮发酵。
作为优选方案，所述秸秆为剪切到长度为1～3厘米的玉米秸秆。
作为优选方案，所述乳酸菌制剂为生物贮料调制剂。
附图说明
图1为纤维素酶表达载体pHBM-368-PGK-CBH2的基因重组过程示意图；
图2为制备过程中全细胞纤维素酶浓度的变化图；
图3为制备过程中纤维素酶的酶活变化图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对发明进行详细的说明。
实施例1制备全细胞纤维素酶颗粒
全细胞纤维素酶的制备方法，包括步骤：
(1)纤维素酶表达载体pHBM-368-PGK-CBH2构建
利用基因工程技术将目的基因CBH2***到载体pHBM368-PGK中，得到纤维素酶表达载体pHBM-368-PGK-CBH2；
重组过程如图1所示，根据CBH2基因序列设计引物Cbh2f(5'AATTACGTATTTGCTTTGATTGTTTTTGC 3'，下划线为SnaB I酶切位点)和Cbh2r(5'TAACCTGAGGCTAATAAGTGCTATCAATCG 3'，下划线为Eco81I酶切位点)，PCR扩增得到SEQ IDNO.1所示的目的基因CBH2。
将原始质粒368-PGK用SnaB I和Eco81I两个限制性内切酶酶切，暴露出载体上两端粘性末端，将PCR扩增得到的CBH2同样用SnaB I和Eco81I酶切后回收；将酶切处理回收后的CBH2和载体pHBM368-PGK片段混合，在16℃水浴锅中通过T4DNA连接酶反应过夜得到表达载体pHBM-368-PGK-CBH2。
(2)将纤维素酶表达载体pHBM-368-PGK-CBH2转化到酿酒酵母中，通过营养缺陷型培养基筛选得到全细胞酿酒酵母纤维素酶；
表达载体pHBM-368-PGK-CBH2产物以E.coli DH5α-Gold感受态为宿主常转后涂布在含Ampicillin的LB平板中，37℃培养过夜，挑取重组子单菌落，挑取重组子单菌落，酶切鉴定后测序验证。将测序正确的pHBM368-PGKCBH2质粒经HpaI酶切线性化，将线性DNA电转化到酿酒酵母中，涂布于营养缺陷型SC平板上，长出单菌落后挑取至YPD平板，28℃培养过夜，挑取重组的单菌落，转接至含有1％CMC的YPD平板，加入刚果红染色液，重组菌株出现水解圈而野生菌株没有，表明重组菌株获得了纤维素降解能力。
(3)以全细胞酿酒酵母纤维素酶为原始制备菌，通过接种活化，摇瓶培养，扩大转接，发酵罐培养，低温干燥质粒过程得到全细胞酿酒酵母纤维素酶颗粒。其中发酵罐培养的具体过程为，制备使用为100L微生物发酵罐，配备自动监控系统监控制备过程中的各项参数，同时外接补料添加口和进风排气口，以便在制备过程中不断添加补料维持正常运转。补料成分为：葡萄糖500g，生物素1g，烟酸1g，添加水至5000mL，每4h通过蠕动泵添加一次，通过取样测定发酵罐中液体酶制剂的OD600，可以反应出其中的全细胞纤维素酶浓度，由图2可知，全细胞纤维素酶在制备第20-41h期间增殖最为迅速，此后缓慢增长，在第65h时达到峰值，71h时OD600出现小幅下降，说明此时已取得最高含量的纤维素酶制剂，因此在72h进行低温干燥制粒制备纤维素酶制剂。
(4)酶活力检测：
取制备中的纤维素酶液体样品2mL，12000rpm离心5min，取上清液0.5mL加入CMC-Na溶液0.5mL，混匀；在50℃水浴锅中反应30min；反应完成后迅速加入2mL的2mol·L-1的氢氧化钠溶液灭活，再加入3ml DNS溶液，混匀，放入100℃金属浴5min，迅速冷却至室温；取1mL的反应溶液加入4mL无菌水，混匀，测定OD540值。根据标准曲线换算还原糖浓度，由酶活力定义计算全细胞纤维素酶的酶活力，计算方法为：
EA纤维素酶＝[(a+0.0865)/3.2527]*5*6*2*1000
EA木聚糖酶＝[(a+0.0382)/3.8491]*5*6*2*1000
乘5指测吸光度时稀释5倍；乘6表示0.5mL酶液反应并灭活后体积增至3mL；乘2因30min为0.5h，即半个酶活测定时长；乘1000为mg换算为μg。结果见图3，酶制剂制备过程中酶活力总体上呈现提高趋势，从第40h测定酶活力开始可划分为三个阶段，在制备的第40-48h，全细胞纤维素酶制剂的纤维素酶活力提升幅度并不明显，甚至木聚糖酶活力有下降的趋势。第二阶段从制备第48至第64h，纤维素酶活力由4178U提高至7996U，而木聚糖酶活力小幅提高后(2667U提升至3841U)又出现下降(3841U下降至3493U)。第三阶段从第64h至制备结束，纤维素酶活出现降低，而木聚糖酶活显著提高。由图可见纤维素酶活力的快速提高可能会抑制木聚糖酶活力的提高。在纤维素酶活力保持稳定后，木聚糖酶活力有了较大提升。
实施例2秸秆混合发酵饲料的小规模生产方法
为研究在乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合使用情况下是否与其单独使用发酵效果有所差异，应用效果实验设置为5个发酵组合，结合表1，分别是：A组(乳酸菌制剂发酵)、B组(全细胞酿酒酵母纤维素酶发酵)、C组(乳酸菌制剂与全细胞酿酒酵母纤维素酶混合发酵)、D组(商用青贮剂发酵)、E组(自然发酵)，另用相同来源而未发酵的秸秆设置为F组，每个组各设置3个平行样品，实验组添加玉米秸秆原料均为50g，添加发酵添加剂液体均为100mL(生物量通过OD600标定)。但乳酸菌制剂活化使用的LB培养基相关培养原料(主要成分为1％蛋白胨、0.5％酵母抽提物和1％葡萄糖)中氮源含量只有全细胞纤维素酶制剂活化使用的YPD培养基(主要成分为2％蛋白胨、1％酵母抽提物和2％葡萄糖)的一半，为确保各实验组额外氮源添加量的一致，使用LB培养基活化的乳酸菌制剂取100mL，而使用YPD培养基的全细胞纤维素酶制剂取50mL，以此推算混合发酵组取25mL全细胞纤维素酶制剂与50mL乳酸菌制剂混合，商用青贮剂按使用方法需50mL，各实验组都稀释至100mL使用。处理体系见表1。将烘干后的玉米秸秆倒入1000mL容量烧杯中，将菌液与水按表1中的量混合后倒入喷壶中，均匀喷洒在秸秆上，并不断搅拌，直至喷洒完毕后静置15分钟使秸秆充分吸收菌液，将处理好的样品倒入真空包装袋中，使用真空封口机封口后于28℃恒温培养箱中恒温发酵14天。
表1玉米秸秆发酵处理体系
实施例3饲料化处理后效果评价
一，饲料化处理后玉米秸秆感官评价
发酵玉米秸秆的感官评价是进行饲料化应用中的基础评价指标。青贮等方法进行秸秆饲料化处理的目的之一就是改善秸秆适口性、柔软度、气味等指标，提高禽畜进食量，以此减少外购饲料的使用。如果不能改善秸秆适口性差的问题，后续饲料化的目的均不能达成。根据评价标准进行感官评价，结果见表2，乳酸菌发酵与全细胞纤维素酶混合发酵的玉米秸秆在气味和形态上均有较大改善，相比而言酸香味适中且有淡淡酒香，形态上糜烂程度减轻，结块现象减少，混合发酵的玉米秸秆总体上优于其它处理组合。
表2发酵玉米秸秆感官评价表
二，饲料化处理对玉米秸秆蛋白含量的影响
粗蛋白含量是评价饲料营养价值的重要指标，见表3，发酵处理对玉米秸秆粗蛋白含量无显著影响(P＞0.5)，乳酸菌发酵、全细胞纤维素酶发酵及混合发酵样品中粗蛋白含量分别达到115.01、117.06mg·g-1及109.53mg·g-1。商用青贮剂发酵粗蛋白含量为99.26mg·g-1，其明显低于其他实验组及对照组，可能是由于商用青贮剂中含有导致氮源损失的微生物类群存在。
表3发酵后玉米秸秆的粗蛋白含量
三，饲料化处理对玉米秸秆氮含量的影响
铵态氮含量是衡量秸秆发酵效果的重要指标，是由腐败菌分解饲料中的蛋白生成，铵态氮含量越高，发酵饲料的营养价值和品质就越低，因此铵态氮含量可以反映出不同发酵添加剂对玉米秸秆饲料化处理的效果。乳酸菌发酵、全细胞纤维素酶发酵、混合发酵、商用青贮剂发酵均对玉米秸秆铵态氮含量有显著影响，见表4，乳酸菌发酵、全细胞纤维素酶发酵、混合发酵引起铵态氮含量显著上升(P＜0.01)，商用青贮剂发酵引起铵态氮含量显著下降(P＜0.01)。采用乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵的玉米秸秆铵态氮含量为3.651mg·g-1，且其铵态氮与总氮比值为0.21，与乳酸菌单独发酵、全细胞纤维素酶单独发酵对比后发现与其铵态氮与总氮比值相差不大，说明乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵不会引起铵态氮与总氮比值的大幅上升，也即二者用于混合发酵时不会造成饲料中的蛋白过量分解。
表4发酵后玉米秸秆的铵态氮，总氮含量及总氮与铵态氮比值
三，纤维素降解效率
纤维素对非瘤胃动物来说是无法直接消化利用的成分，也是玉米秸秆用作饲料时的一个重要评价指标，纤维素的降解率直接影响青贮过程中能被青贮乳酸菌所利用的可溶性糖的量。乳酸菌单独发酵对玉米秸秆纤维素比例无显著影响(P＞0.05)、全细胞纤维素酶单独发酵对纤维素比例有影响(P＜0.05)、混合发酵和商用青贮剂发酵引起纤维素比例显著下降(P＜0.01)。见表5，对比A、B、C三组样品的纤维素比例，乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵的玉米秸秆纤维素比例最低，为28.41％，相比未发酵玉米秸秆降低34.61％，与商业青贮剂发酵效果相当，其纤维素含量比全细胞纤维素酶制剂单独发酵和乳酸菌单独发酵明显降低。
表5发酵后玉米秸秆纤维素比例及纤维素平均降低率
四，半纤维素降解效率
半纤维素与纤维素合称膳食纤维，且在膳食纤维中占50％以上，饲料中充足的膳食纤维可以提供饱腹感，但其消化率较低，不能被非瘤胃动物充分消化吸收。将半纤维素进行降解可提高玉米秸秆饲料的消化吸收率。乳酸菌、全细胞纤维素酶单独发酵、商用青贮剂发酵对玉米秸秆半纤维素比例无显著影响(P＞0.05)、混合发酵引起纤维素比例下降(P＜0.05)。见表6，比较A、B、C组可发现：乳酸菌发酵的玉米秸秆和全细胞纤维素酶制剂发酵的半纤维素含量与空白样品没有明显差异，说明乳酸菌用于秸秆发酵时不能很好地降解半纤维素，乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵的玉米秸秆半纤维素比例为19.50％，相比空白对照下降了17.02％，说明乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵可以提高发酵玉米秸秆的半纤维素降解效果。
表6玉米秸秆发酵后半纤维素比例
综上所述：
(1)在蛋白含量方面，单独应用纤维素酶、乳酸菌和混合发酵处理的玉米秸秆的粗蛋白含量相差不大，在铵态氮与总氮比值方面，单独应用纤维素酶、乳酸菌和混合发酵的玉米秸秆比值分别为0.18、0.21、0.21.说明在传统青贮用乳酸菌基础上添加纤维素酶不会引起单细胞蛋白的过量分解，即二者适合于混合发酵。
(2)在纤维素降解率方面，单独应用纤维素酶、乳酸菌和混合发酵的玉米秸秆纤维素降低率分别为21.41、16.97、34.61％。说明纤维素酶与乳酸菌混合发酵处理玉米秸秆拥有更高的纤维素降解率，其处理的玉米秸秆营养价值更高、消化吸收率更好。
(3)在半纤维素降解率方面，混合发酵对半纤维素含量具有显著影响，降低率为17.02％其它实验组无显著影响。说明乳酸菌与纤维素酶混合发酵有利于提高半纤维素降解率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种秸秆混合发酵饲料及其生产方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 948
<212> DNA
<213> Reticulitermes flavipes
<400> 1
tttgctttga ttgtttttgc cattcagctg ctgcatgcac agggaaatca ggatttcacc 60
tacacgatta atggtactaa agttactggg caaatagtga ttgatcaaga gtggagaggc 120
aacaataccc caactgcaac tgtgaatctt tctagttttg gtgtaactgt gaatggagat 180
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ccagggggaa aagcgtatga gaagttcaag ttggtgaact ctgagctgac gtttgatgtt 300
gatattagcc agattccatg cggaatgaat gctgccattt acactgccga attgcctgca 360
gacggtgtaa cacctggtca cgaagctgga gcagcgtatg gtggcggata ctgtgatgca 420
aactatgttg gaggagttgg atgtgcagaa tttgatattg gtgaaagcaa tgcacgtgca 480
acagtttata caagtcatgg atgcagcccg acgactggct ttgcaaaaca gggcagcatt 540
agctgtgaca caggtggaac tggagccaac ccgtaccgtg tggacaagaa cttctatggc 600
aatggttcat cattcactgt caatactgca cagaaattca ctgtggtgac gcaattcaaa 660
ggaaacccac tgacttcgat tgatcgtatc tacatccaag gtaataaaca aacaaaacag 720
ccgaacaaca ttaataacaa cttggatcgt atcagcccat cgcttgcggc aggacatgtt 780
ctgatattct cgatctgggc ttcggatgga gatatgtctt ggatggactg caatgacaac 840
ggaccttgca atgcaggcca ggaaagttca cgttatttgg gaacaaaact atccgatgct 900
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