阅读说明：本技术 通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物及其制备方法 (Composition for treating gout by regulating gene expression and reducing uric acid and preparation method thereof ) 是由 陈东良 黄伟青 陈泓钰 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物及其制备方法,属于关节炎的治疗技术领域,通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物由以下组分按照质量份制备而成：北虫草提取物4-10份；活性肽2-8份；水果粉1-3份；拮抗剂0.03～0.05份；其中：北虫草提取物由质量份如下的成分制成：北虫草3-10份、土茯苓3-7份、甘草2-5份、枸杞1-5份以及栀子1-3份制成；北虫草、土茯苓、甘草、枸杞、栀子、活性肽以及水果粉相互协同,最终实现从尿酸的产生、排泄以及重吸收等三方面来共同调节机体内的尿酸的含量,使得尿酸的含量降低,从而治疗急性期痛风关节炎。(The invention discloses a composition for treating gout by regulating gene expression and reducing uric acid and a preparation method thereof, belonging to the technical field of arthritis treatment, and the composition for treating gout by regulating gene expression and reducing uric acid is prepared from the following components in parts by mass: 4-10 parts of cordyceps militaris extract; 2-8 parts of active peptide; 1-3 parts of fruit powder; 0.03-0.05 part of antagonist; wherein: the cordyceps militaris extract is prepared from the following components in parts by mass: 3-10 parts of cordyceps militaris, 3-7 parts of glabrous greenbrier rhizome, 2-5 parts of liquorice, 1-5 parts of medlar and 1-3 parts of cape jasmine; the cordyceps militaris, the glabrous greenbrier rhizome, the liquorice, the medlar, the gardenia, the active peptide and the fruit powder are mutually cooperated, and the content of uric acid in a body is adjusted together from three aspects of production, excretion and reabsorption of uric acid, so that the content of uric acid is reduced, and the acute gouty arthritis is treated.)

通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于关节炎的治疗技术领域，具体涉及一种通过调节基因表达降尿 酸治疗痛风的组合物及其制备方法。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高、饮食结构的改变及受不良生活习惯的影响， 高尿酸的人越来越多，呈逐年上升趋势，而血液中尿酸的含量升高引起痛风、 尿酸性肾病、***、心脑血管疾病等疾病的发病率大幅度上升。临床上常 采用别嘌醇、非布司他抑制尿酸生成，丙磺舒、苯溴马隆等促进尿酸***，然 而这些西药都有很多的副作用，如肝肾功能损伤、发热、皮疹、胃肠道反应。

发明内容

为了解决降低尿酸含量的现有西药引起副作用的问题，本发明提供了一种 通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物。

本发明所采用的技术方案为：一种通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组 合物，由以下组分按照质量份制备而成：

北虫草提取物4-10份；活性肽2-8份；水果粉1-3份；拮抗剂0.03～0.05份；

其中：北虫草提取物由质量份如下的成分制成：

北虫草3-10份、土茯苓3-7份、甘草2-5份、枸杞1-5份以及栀子1-3份制 成。

本发明的有益效果或工作原理为：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因， 英文简称为HPRT，亚甲基四氢叶酸还原酶基因，英文简称为MTHFR；现有技 术中已经明确指出：HPRT和MTHFR的表达水平的高低与尿酸的合成有密切的 关系；北虫草中含有多糖、黄酮和苷类化合物，能够调节HPRT和MTHFR的 表达，具体为：HPRT的表达水平明显提高，MTHFR的表达水平明显降低，从 而减少尿酸的生成；土茯苓、甘草、枸杞以及栀子作用于关节处，有通利关节 的作用，能够缓解关节处的疼痛和红肿；活性肽能够消融尿酸结石，促进尿酸 转运，减少尿酸的重吸收，加速尿酸***；水果粉中含有大量的纤维，能够抑 制机体对食物源性嘌呤类物质的吸收；北虫草、土茯苓、甘草、枸杞、栀子、 活性肽以及水果粉相互协同，最终实现尿酸的生成、重吸收以及***三方面来 共同调节机体内的尿酸的含量。

进一步限定，所述活性肽由质量份如下的成分制成：

浓缩乳清蛋白粉4-10份和鸡蛋清粉2-6份。

本发明的有益效果或工作原理为：浓缩乳清蛋白粉和鸡蛋清粉混合制备得 到活性肽的相对平均分子质量在400-1000之间，便于机体的吸收，效果明显且 治疗时间短。

进一步限定，所述水果粉由芒果、水蜜桃以及草莓中的一种或多种的混合 制成。

进一步限定，所述拮抗剂为二氧化硅；二氧化硅的粒径为1000目。

一种通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物的制备方法，包括以下步 骤：

S1：原料的预处理

北虫草提取物的制备

将北虫草、土茯苓、甘草、枸杞以及栀子混合，经超微粉碎、高压差破壁、 超声波辅助水煎提取，得到提取液，提取液依次经过过滤、冷冻干燥、粉碎以 及80目过筛，最终得到北虫草提取物；

活性肽的制备

称取浓缩乳清蛋白粉和鸡蛋清粉，混匀后加入去离子水混合成浆料，向浆 料中加入HCL溶液或NaOH溶液使得浆料的PH值为6～8，随后将浆料置于 48～54℃水浴中预热保温，加入复合蛋白酶定向酶切酶解，酶切酶解的时间为 5～7h，然后在95～105℃下灭酶，冷却后在7800～8200r/min下离心，将离心得 到的上清液依次经过冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到活性肽；

水果粉的制备

将新鲜水果依次经过清洗、去核、制成果浆、巴氏灭菌、冷冻干燥、粉碎 以及80目过筛，最终得到水果粉；

S2：将步骤S1中得到的北虫草提取物、活性肽、水果粉以及抗结剂混合均 匀即可得到所述通过调节基因降尿酸表达治疗痛风的组合物。

本发明的有益效果或工作原理为：该制备方法简单，且能够将各种组分中 的物质尽可能多的提取出来，从而提高疗效。

进一步限定，所述北虫草的含水量、土茯苓的含水量、甘草的含水量、枸 杞的含水量以及栀子的含水量均低于8％。

附图说明

图1是HPRT表达的mRNA经过RT-PCR扩增后得到的产物的电泳图；

图2是β－actin表达的mRNA经过RT-PCR扩增后得到的产物的电泳图；

图3是MTHFR表达的mRNA经过RT-PCR扩增后得到的产物的电泳图；

图4是β－actin表达的mRNA经过RT-PCR扩增后得到的产物的电泳图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步阐述。

本发明的描述中，有的结构或器件未作具体描述的，理解为现有技术中有 能实现的结构或器件。

实施例1

一种通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物的制备方法，包括以下步 骤：

S1：原料的预处理

北虫草提取物的制备

采集新鲜干燥的北虫草、土茯苓、甘草、枸杞以及栀子，根据《药典》要 求进行鉴别后烘干，控制含水量低于8％；

将质量份分别为：北虫草3份、土茯苓3份、甘草2份、枸杞1份以及栀 子1份混合，经超微粉碎、高压差破壁、超声波辅助水煎提取，得到提取液， 提取液依次经过过滤、冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到北虫草提取物；

活性肽的制备

称取质量份分别为：浓缩乳清蛋白粉4份和鸡蛋清粉2份，混匀后加入去 离子水混合成浆料，向浆料中加入HCL溶液或NaOH溶液使得浆料的PH值为 6，随后将浆料置于48～54℃水浴中预热保温，加入复合蛋白酶定向酶切酶解， 酶切酶解的时间为5h，然后在95～105℃下灭酶，冷却后在7800r/min下离心， 将离心得到的上清液依次经过冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到活性肽；

水果粉的制备

将新鲜的芒果、水蜜桃和草莓按照质量比例2:2:1依次经过清洗、去核、制 成果浆、巴氏灭菌，冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到水果粉；

S2：将步骤S1中得到的北虫草提取物4份、活性肽2份、水果粉1份以及 抗结剂0.03份混合均匀即可得到通过调节基因表达治疗痛风的组合物。

实施例2

一种通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物的制备方法，包括以下步 骤：

S1：原料的预处理

北虫草提取物的制备

采集新鲜干燥的北虫草、土茯苓、甘草、枸杞以及栀子，根据《药典》要 求进行鉴别后烘干，控制含水量低于8％；

将质量份分别为：北虫草6份、土茯苓5份、甘草4份、枸杞3份以及栀 子2份混合，经超微粉碎、高压差破壁、超声波辅助水煎提取，得到提取液， 提取液依次经过过滤、冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到北虫草提取物；

活性肽的制备

称取质量份分别为：浓缩乳清蛋白粉8份和鸡蛋清粉5份，混匀后加入去 离子水混合成浆料，向浆料中加入HCL溶液或NaOH溶液使得浆料的PH值为 7，随后将浆料置于48～54℃水浴中预热保温，加入复合蛋白酶定向酶切酶解， 酶切酶解的时间为5h，然后在95～105℃下灭酶，冷却后在8000r/min下离心， 将离心得到的上清液依次经过冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到活性肽；

水果粉的制备

将新鲜的芒果、水蜜桃和草莓按照质量比例3:1:2依次经过清洗、去核、制 成果浆、灭菌，冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到水果粉；

S2：将步骤S1中得到的北虫草提取物6份、活性肽7份、水果粉2份以及 抗结剂0.04份混合均匀即可得到通过调节基因降尿酸表达治疗痛风的组合物。

实施例3

一种通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物的制备方法，包括以下步 骤：

S1：原料的预处理

北虫草提取物的制备

采集新鲜干燥的北虫草、土茯苓、甘草、枸杞以及栀子，根据《药典》要 求进行鉴别后烘干，控制含水量低于8％；

将质量份分别为：北虫草10份、土茯苓7份、甘草5份、枸杞5份以及栀 子3份混合，经超微粉碎、高压差破壁、超声波辅助水煎提取，得到提取液， 提取液依次经过过滤、冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到北虫草提取物；

活性肽的制备

称取质量份分别为：浓缩乳清蛋白粉10份和鸡蛋清粉6份，混匀后加入去 离子水混合成浆料，向浆料中加入HCL溶液或NaOH溶液使得浆料的PH值为 8，随后将浆料置于48～54℃水浴中预热保温，加入复合蛋白酶定向酶切酶解， 酶切酶解的时间为6h，然后在95～105℃下灭酶，冷却后在8200r/min下离心， 将离心得到的上清液依次经过冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到活性肽；

水果粉的制备

将新鲜的芒果、水蜜桃和草莓按照质量比例2:1:1依次经过清洗、去核、制 成果浆、灭菌，冷冻干燥、粉碎以及80目过筛，最终得到水果粉；

S2：将步骤S1中得到的北虫草提取物10份、活性肽8份、水果粉3份以 及抗结剂0.05份混合均匀即可得到通过调节基因降尿酸表达治疗痛风的组合 物。

临床实验

1、临床观察和基因研究资料

1.1临床观察和基因研究对象

本次临床观察选取2018年7月至2019年3月期间，在某医院门诊、急诊 就诊的120例急性期痛风性关节炎患者，所有纳入观察的病例均符合以下诊断、 纳入标准。另外，征集5名健康志愿者，作为正常人。本实验得到医学伦理委 员会批准，且所有参与者均知情并签有同意书。

1.2临床观察和基因研究对象选择

1.2.1急性期痛风性关节炎诊断标准

1.2.1.1西医诊断标准

根据1977年美国风湿病协会急性痛风性关节炎诊断标准：以下3项中符合 任意1项者即可明确诊断为痛风性关节炎：(1)滑液检出尿酸盐结晶；(2)经 化学检测证实的痛风石；(3)有以下12条中的6条及6条以上者：A、急性关 节炎发作多于1次；B、在1天内炎症反应达到高峰；C、单关节炎；D、关节 皮肤暗红；E、第1跖趾关节肿痛；F、单侧第1跖趾关节受累；G、单侧跗跖 关节受累；H、有可疑痛风石；I、血尿酸高；J、一个关节肿胀呈非对称性(X 线)；K、无骨质破坏的骨皮质下囊肿(X线)；J、关节炎发作时关节液培养未见 微生物。

1.2.1.2中医诊断标准

痛风系由湿浊瘀阻、留滞关节经络，气血不畅所致。依据中华人民共和国 中医药行业标准《病证诊断疗效标准》(ZY/T001.1-94)进行诊断。

1.2.2急性期痛风性关节炎纳入标准

A、符合上述诊断标准；B、年龄20-70岁，性别不限；C、近1周内未使 用依托考昔、秋水仙碱、非甾体抗炎药、糖皮质激素、抗风湿中成药、中草药； D、对本次实验充分了解，已签订相关知情同意书，能如期完成随访。

1.2.3急性期痛风性关节炎排除标准

A、不符合纳入标准者；B、肾功能不全、放化疗等因服用药物所致的高尿 酸血症及痛风；合并严重的系统性疾病者；C、病情严重，如关节重度畸形或强 直、痛风石溃疡感染；D、由于精神障碍或不清醒，缺乏知情、无法配合的患 者；E、妊娠期或哺乳期妇女。

1.2.4急性期痛风性关节炎剔除标准

A、治疗过程中出现严重的并发症；B、对治疗药物过敏导致终止治疗；C、 治疗时间不足、无法按时复诊者；D、由于患者个人原因自行退出实验。

2、临床观察、服用实施例1中所制备得到的通过调节基因表达降尿酸治疗 痛风的组合物

2.1临床分组

2.1.1临床观察分组。将符合本次临床观察要求120例患者，按入院顺序依 次编号，随机分为治疗组和对照组，并通过配平调整各组病例例数，使得治疗 组、对照组各60例。

治疗组和对照组的急性期痛风患者的基本资料比较，男性病例67人，女性 病例53人，治疗组60例(男性35人，女性25人)，对照组60例(男性32人， 女性28人)，所有患者均完成整个临床观察研究，无病例脱落。经SPSS检验， 结果见表1、表2。

表1、治疗组和对照组的患者治疗前基本资料比较

表2、治疗组和对照组的患者治疗前相关指标比较

表1和表2结果显示：治疗组和对照组的患者的性别、年龄、病史及治疗 前的VAS评分、WBC(白细胞计数)、ESR(血沉)、CRP(C反应蛋白)以及 BUA(血尿酸)指标的p值均大于0.5，因此差异无统计学意义。

2.1.2基因表达分析分组。A、正常人，征集的5位正常志愿者；B、模型组， 符合本次临床观察要求120例患者就诊当天列为模型组；C、治疗组和对照组， 将120位患者，按入院顺序依次编号，随机分为治疗组和对照组，并通过配平 调整各组病例例数，使得治疗组、对照组各60例。

2.2治疗方法

治疗组：采用实施例1所制备得到的通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的 组合物(本实验中，通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物的规格为：10 克/袋)，联合依托考昔片(默沙东，规格：60mg/片)治疗。该组合物，每次1袋， 2次/天，早、晚各一次，用200ml温开水冲饮；依托考昔片，口服，60mg/ 次，1次/天；共服用2周。

对照组：依托考昔片，口服，60mg/次，1次/天；共服用2周。

2.3临床观察和实验指标

2.3.1临床观察指标。两组患者分别于门诊当天、治疗第8天、治疗第14 天由同一主任中医师进行VAS评分判定，并由本院临床检验中心测定白细胞计 数(WBC)、血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、血尿酸(BUA)。

2.3.2以HPRT/β－actin和MTHFR基因C677T/β－actin比值分别代表 HPRTmRNA和MTHFR基因C677TmRNA表达式平。

模型组：120例急性期痛风关节炎患者门诊当天的血样；治疗组和对照组 的急性期痛风关节炎患者服药14天后抽取外周血样；正常人组，正常人一次抽 取外周血样。所有参与HPRT和MTHFR基因测定的人，均采集9ml外周静脉 血，5ml置于2％EDTA抗凝管中，4ml于普通管中，经3000rpm离心10分钟分 离血浆和血清，分装于0.5mlEppendorf管，置于-80℃超低温冰箱保存。

用常规方法制备外周血样品DNA，运用RT-PCR法检测急性期痛风关节炎 患者血清HPRTmRNA和MTHFR基因C677TmRNA表达，计算提取总RNA量， 进行RNA逆转录双链cDNA，运用DNA聚合酶链反应(PCR)扩増cDNA，扩增 产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳分离后凝胶图像分析系统(Tanon2500R) 进行观察并拍照分析，分别测量HPRTmRNA、β－ac-tin、MTHFRC677TmRNA、 β－actin电泳条带的光密度和面积，以MTHFRC677T/β－actin比值代表MTHF RC677T表达水平，以HPRT/β－ac-tin比值分别代表HPRT表达水平。K扩增 产物回收，将回收的PCR产物与Pgem－TEnsy载体16℃连接过夜，转化 E.coliTOP菌株。从含有IPTG/X-gal的氨苄青霉素的平板上挑选白色菌落，按 常规方法提取质粒。

2.4统计分析

采集数据，记录数据库，使用SPSS 20.0软件进行统计分析。

3、实验结果和HPRTmRNA和MTHFR基因C677TmRNA表达分析结果

3.1治疗组和对照组患者治疗前后各指标的比较，如表3所示，

表3、两组患者治疗前后各时点VAS评分的组间比较(单位为：分)

	治疗前	治疗第8天	治疗第14天
				治疗组	7.63±0.882	3.24±0.942	1.42±0.682
对照组	7.69±0.801	4.11±0.816	1.94±0.927
				P值	0.762	<0.01	0.028

表4、两组患者治疗前后各时点WBC组间比较(单位为：10⁹/L)

	治疗前	治疗第8天	治疗第14天
				治疗组	9.41±1.115	7.53±1.241	6.39±0.921
对照组	9.83±1.134	8.26±1.052	6.82±0.891
				P值	0.618	0.026	<0.01

表5、两组患者治疗前后各时点ESR组间比较(单位：mm/h)

表6、两组患者治疗前后各时点CRP组间比较(单位：mg/L)

	治疗前	治疗第8天	治疗第14天
				治疗组	31.21±3.257	24.22±2.643	15.14±2.134
对照组	30.93±3.381	26.84±1.982	24.86±3.102
				P值	0.714	0.014	<0.01

表7、两组患者治疗前后各时点BUA组间比较(单位：umoI/L)

	治疗前	治疗第8天	治疗第14天
				治疗组	562.12±24.532	458.2±41.763	399.2±32.234
对照组	560.39±28.628	513.4±38.383	498.6±38.312
				P值	0.881	<0.01	<0.01

由表3-7各个时间点两组之间的VAS评分、白细胞计数、血沉、C反应 蛋白、血尿酸结果比较，结果显示：治疗前，治疗组与对照组各指标的P值均 大于0.5，两组之间无统计学差异；治疗第8天及治疗第14天各指标的P值均 小于0.05，两组之间均有显著统计学差异。

3.2HPTRmRNA和MTHFR C677TmRNA、β－actinRT-PCR产物电泳条带 亮度比较

图1为HPRTmRNA RT-PCR电泳条带：在琼脂糖电泳凝胶上紫外灯下观察, 均可见653bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异。

其中，图1中M为梯度标记；1：正常；2：模型组；3：治疗组；4： 对照组；

图2为β－actin mRNA RT-PCR产物电泳条带：β－actin电泳条带亮度在 各组之间是相同的，扩增片段均为432bp。

其中，图2中M为梯度标记；1：正常；2：模型组；3：治疗组；4： 对照组；

表8、HPRT mRNA RT-PCR电泳灰度扫描值

	人数	HPRT/β－actin
			正常组	5	0.8213±0.0081★
模型组	120	0.1841±0.0051
			治疗组	60	0.8113±0.0034★▲
对照组	60	0.5238±0.0321★

注：与模型组相比，★P<0.01，治疗组与对照组比较，▲P<0.01

图3为MTHFR C677T mRNA RT-PCR电泳条带：在琼脂糖电泳凝胶上紫 外灯下观察,均可见476bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异。

其中，图3中M为梯度标记；1：模型组；2：正常人组；3：对照组； 4：治疗组；

图4为β－actin RT-PCR电泳条带：β－actin电泳条带亮度在各组之间是相 同的，扩增片段均为432bp；

其中，图4中M为梯度标记；1：模型组；2：正常人组；3：对照组； 4：治疗组；

图2和图4中的电泳条件不相同。

表9、血清MATHFR C677T mRNA RT-PCR电泳灰度扫描值

注：与正常组比较，□P<0.01；与模型组相比，☆P<0.01；与对照组比较， ☆P<0.01；

由图1-4以及表8和表9可知，急性期痛风性关节炎的患者经该组合物联 合依托考昔片治疗后，VAS评分、WBC、ESR、CRP、BUA显著下降，有统计 学差异；对照组患者仅用依托考昔治疗，VAS评分下降明显，WBC、ESR、CRP 有所下降，但是下降幅度均低于治疗组，而BUA的下降不明显，无统计学差异。 依托考昔片是一种选择性COX-2抑制剂，仅具有抗炎、镇痛和解热作用，不具 有降尿酸作用。因此可以得出：通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物能 够降低患者体内的尿酸含量，从而达到治疗痛风的作用。

根据对HPRT和MTHFR基因表达分析结果表明：与正常人相比，痛风性 关节炎患者治疗前血清HPRTmRNA水平表达明显下降(P＜0.01)，MTHFR 基因C677TmRNA水平表达明显上升(P＜0.01)；痛风性关节炎患者经本发明 的通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物通过降低尿酸含量来治疗后 HPRTmRNA表达比治疗前明显升高(P＜0.01)，MTHFR基因C677TmRNA 表达比治疗前明显下降化P＜0.01)；治疗组与对照组相比，血清HPRTmRNA 表达升高的更明显(P＜0.01)，血清MTHFR基因C677TmRNA表达下降的更 明显(P＜0.01)；由此可见，该通过调节基因表达降尿酸治疗痛风的组合物可 以调节HPRT和MTHFR基因表达，减少尿酸生成，降低血尿酸，治疗痛风。

本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其 他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权 利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。