阅读说明：本技术 一种用于提取微量药用植物样品dna的提取液及其提取方法 (Extracting solution for extracting trace medicinal plant sample DNA and extraction method thereof ) 是由 吕群丹 方洁 程科军 潘俊杰 陈正道 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液及其提取方法,该提取液包括Tris-HCl10～20mmol/L、EDTA0.5～1mmol/L、KCl0.1～0.2mol/L以及RNA酶5～10mg/L。该提取液可用于提取多种药用植物的叶、茎、根及花等多种组织的微量样品基因组DNA,适用性广；使用该方法提取的基因组DNA可以有效地用于目的片段PCR扩增和DNA条形码分子鉴定等用途。与现有技术相比,本发明方法具有适用性广,所需样品量少,不含高毒、剧毒成分,成本低,操作简便、快速,易于掌握等优势,为基于DNA条形码的药用植物微量样本的基因组DNA提取及分子鉴定提供了新的方法,助推了中药分子鉴定技术的发展和普及。(the invention discloses an extracting solution for extracting trace medicinal plant sample DNA and an extracting method thereof, wherein the extracting solution comprises Tris-HCl 10-20 mmol/L, EDTA 0.5.5-1 mmol/L, KCl 0.1-0.2 mol/L and RNase 5-10 mg/L. The extracting solution can be used for extracting trace sample genome DNA of various tissues such as leaves, stems, roots, flowers and the like of various medicinal plants, and has wide applicability; the genomic DNA extracted by the method can be effectively used for PCR amplification of target fragments, DNA barcode molecular identification and the like. Compared with the prior art, the method has the advantages of wide applicability, less required sample amount, no high-toxicity and highly-toxic components, low cost, simple and quick operation, easy mastering and the like, provides a new method for extracting the genome DNA and identifying the molecules of the medicinal plant micro sample based on the DNA bar code, and promotes the development and popularization of the traditional Chinese medicine molecular identification technology.)

一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液及其提取方法

技术领域

本发明涉及DNA提取技术领域，更具体地说，它涉及一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液及其提取方法。

背景技术

中药材品种广泛，且来源复杂，普遍存在多基源的情况，致使中药在生产、流通和临床使用过程中普遍存在药品同名异物、同物异名、鉴定不清、替代混用、以假乱真、以次充好等现象，严重影响了中药临床用药过程中的安全性和有效性。药材的准确鉴定是保证中药质量和临床用药安全有效可控前提和基础。为解决现代中药行业对中药材基原物种鉴定的需求，DNA条形码分子鉴定技术被应用至中药材鉴定领域，在中药基源物种及中药材鉴定等方面均取得了突出成绩，促进了中药标准化鉴定的进程。随着中药材DNA条形码分子鉴定方法研究的深入与普及，国家药典委员会讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则(即以ITS2为核心，psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系)，使中药材DNA条形码鉴定进一步规范化。目前，中国中医科学院陈士林研究团队已经构建了较完备的在线中药材DNA条形码鉴定系统，将目的序列导入该数据库便可快速准确地实现物种鉴定(参照文献：陈士林.中国药典中药材DNA条形码标准序列[M].北京:科学出版社,2015.)。

DNA条形码技术流程通常包括样品处理、样品DNA提取、PCR扩增、DNA测序、序列拼接、鉴定分析六个环节，其中获取高质量的样品DNA被认为是DNA条形码技术的必要前提和关键环节。而药用植物大多含有较多的次生代谢产物，严重影响了基因组DNA的提取效率和质量。

对于药用植物而言，常用基因组DNA提取法包括CTAB法、碱裂解法、高盐低pH法等。前三种提取方法均需在提取试剂和提取过程中通常通过加入NaOH、SDS、Ttiton-X 100、β-巯基乙醇和三氯甲烷等高毒、剧毒试剂提高提取效率和产物质量，对人身健康和环境保护存在较大的安全和环保隐患(参照文献：蒋超,黄璐琦,袁媛,陈敏,林淑芳,吴志刚.使用碱裂解法快速提取药材DNA方法的研究[J].药物分析杂志,2013,33(07):1081-1090；陈璐,王清蓉,敖慧,国锦琳.适合果实类中药的DNA条形码鉴定方法研究[J].辽宁中医杂志,2018,45(05):1028-1030；马敏敏,何芳,杨志刚,蒋丹,仵缘,黄耀江.DNA提取4种中药材方法的筛选[J].中成药,2016,38(08):1776-1781.)。而且添加了SDS或Ttiton-X 100等去垢剂的试剂在剧烈震荡后会产生大量的泡沫，无法使用球磨仪进行磨样，无法适用于批量样品的提取。其中，CTAB法最为繁琐，包括取样、组织破碎、提取缓冲液预处理、裂解缓冲液裂解细胞、去除蛋白质及RNA等杂质、沉淀DNA、漂洗DNA和溶解等环节，程序复杂繁琐、耗时最长，至少需要数小时，对于较难提取的组织甚至需要过夜操作，耗时更大。

对于拟南芥、水稻等模式植物及一些次生代谢产物较少的农作物，大量研究团队采用TPS法提取基因组。相比于上述3种方法，TPS法相对简单，但也需要组织破碎、裂解缓冲液裂解细胞、沉淀DNA、漂洗DNA和溶解等环节，耗时至少1个小时。有报道在棉花中采用了改良TPS法可以缩短提取时间，但是提取试剂中需要添加β-巯基乙醇等有毒试剂，对人体有害。对于次生代谢产物含量高的药用植物，较少采用TPS法提取基因组DNA。

为避免出现上述问题，在《中国药典》的中药材DNA条形码分子鉴定指导原则和大量的文献报道中，操作人员大多采用植物基因组DNA提取试剂盒进行提取(参照文献：穆春华,张发军,李文才,孙琦,丁照华,王磊,孟昭东.玉米叶片基因组快速提取方法研究[J].玉米科学,2010,18(03):170-172；张友昌,冯常辉,别墅,王小娇,易先达,张成,秦鸿德.改进的TPS法:一种棉花叶片DNA快速提取方法[J].棉花学报,2016,28(04):413-417.)。但试剂盒价格昂贵，不适宜批量样品操作，鉴定批量样品时耗费大量的人力、物力和时间。另外，一些珍稀濒危药用植物的样品异常稀少，较难获得充足的样品进行基因组DNA的提取工作，目前市面上缺少适宜于稀少样品批量提取试剂和方法。分子鉴定法已成为中药鉴定工作中的一大发展趋势，但上述的多种问题严重制约了分子鉴定方法的使用和推广。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明在于提供一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液及其提取方法，该方法能够高通量、快速高效地提取多种微量药用植物样品的基因组DNA，其操作简便快速且适用性广。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液，包括如下组分：

作为优选，包括如下组分：

作为优选，Tris-HCl的pH值为9.5，EDTA的pH值为8.0。

如上所述的提取液在药用植物鲜样和干样的基因组DNA提取中的应用。

一种DNA提取方法，利用权利要求1中所述的DNA提取液提取药用植物的基因组DNA，具体包括以下步骤：

1)取药用植物样品置于容器中；

2)加入磨样珠和权利要求1中所述的DNA提取液；

3)使用球磨仪研磨药用植物样品；

4)65～70℃孵育5～10min取出，12000转/分钟离心5～10min；取上清液，即得药用植物的基因组DNA。

作为优选，所述孵育温度为70℃，孵育时间为10min。

作为优选，所述的容器为圆底离心管或96孔深孔板。

作为优选，每毫克鲜样样品加入0.2～0.4ml的所述提取液或者按照每毫克干样样品加入0.4～0.8ml所述提取液。

作为优选，所述的药用植物选择药用植物的鲜样0.3～1.0mg或者干样0.15～0.40mg。

如上所述的DNA提取方法在目的片段PCR扩增和DNA条形码分子鉴定中的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：本方法提供的提取液成本低、不含高毒或剧毒成分，适用药用植物的物种范围广，所需植物样品量少，操作过程简便、快速，适用于批量操作，为基于DNA条形码的微量药用植物样品的基因组DNA提取及分子鉴定提供了新的方法，助推中药分子鉴定技术的发展和普及。

附图说明

图1为实施例1样品条带PCR扩增后的电泳图；

图2为实施例1中的华重楼DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图3为实施例1中的车前DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图4为实施例1中的华东覆盆子DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图5为实施例1中的忍冬DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图6为实施例1中的海金沙DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图7为实施例1中的金樱子DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图8为实施例1中的栀子DNA条形码鉴定系统鉴定结果图

图9为实施例1中的茜草DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图10为实施例1中的野葛DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图11为实施例1中的大血藤DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图12为实施例1中的紫花前胡DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图13为实施例1中的射干DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图14为实施例1中的朱砂根DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图15为实施例1中的牛膝DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图16为实施例1中的络石DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图17为实施例1中的杠板归DNA条形码鉴定系统鉴定结果图；

图18为实施例2样品条带PCR扩增后的电泳图；

图19为实施例3样品条带PCR扩增后的电泳图；

图20为在对比浓度1下样品条带PCR扩增后的电泳图；

图21为在对比浓度2下样品条带PCR扩增后的电泳图。

具体实施方式

参照附图对本发明做进一步说明。

本发明提供了一种不含高毒或剧毒成分的微量药用植物样品基因组DNA的提取液，所述DNA提取液可以简便、快速、高效地提取多种微量药用植物样品的基因组DNA，所提取的基因组DNA可以有效地用于目的条带PCR扩增和DNA条形码分子鉴定。

本实施例公开了一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液，包括如下组分：

在以提取的基因组DNA为模板使用PCR扩增目的条带时，RNA的存在影响PCR扩增效率，在该提取液中加入了RNA酶，在提取过程中去除RNA，可以显著提高后续实验中目的片段的PCR扩增效率。

作为优选，该提取液包括如下组分：

该提取液中的各个组分的浓度对目的片段条带扩增的成功率以及目的片段的扩增影响较大，浓度较高时，目的片段扩增的成功率较低，且目的片段条带出现拖带以及条带弥散现象，而在该浓度下，目的片段条带单一明亮，无拖带。

其中，Tris-HCl的pH值为9.5，EDTA的pH值为8.0。高pH值有利于提高DNA提取效率。

该提取液在药用植物鲜样和干样的基因组DNA提取中的应用。

一种DNA提取方法，利用如上所述的DNA提取液提取药用植物的基因组DNA，具体包括以下步骤：

1)取药用植物样品置于容器中，其中，在提取植物组织鲜样时，取植物组织0.3～1.0mg；或者，在提取植物组织干样时，取植物组织0.15～0.40mg；所述的药用植物干样选择简单干燥样品，如直接阴干、晾干或者烘干的样品。

2)加入磨样珠，并按照每毫克鲜样样品加入0.2～0.4ml的比例加入上述所述的提取液或者按照每毫克干样样品加入0.4～0.8ml的比例加入上述所述的提取液；

3)使用球磨仪研磨药用植物样品；

4)65～70℃孵育5～10min取出，12000转/分钟离心5～10min；取上清液，即得药用植物的基因组DNA。该温度下能够使蛋白变性，但不会导致DNA降解，孵育可以选择金属浴或者水浴锅，在批量操作时可以使用烘箱。

对于一些珍稀濒危药用植物的样品异常稀少，较难获得充足的样品进行基因组DNA的提取工作，目前市面上缺少适宜于稀少样品批量提取试剂和方法，相对于现有的DNA提取方法，本专利所提供的方法仅需要微量的药用植物样品，即可完成提取工作。

作为优选，步骤4)中的孵育温度为70℃，孵育时间为10min。

在DNA提取方法的步骤1)中，对于少量样品的提取可以选择使用2ml圆底离心管，而对于批量样品提取时，可以选择使用96孔深孔板。

该DNA提取方法在目的片段PCR扩增和DNA条形码分子鉴定中的应用。

以下参照具体的实施例来说明本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1

抽取《中国药典》收录的多种药用植物叶片鲜样基因组用于扩增DNA条形码核心序列ITS2，并通过该序列信息鉴定物种。

(1)供试样本

采集《中国药典》收录的不同物种的药用植物叶片鲜样共16份，见表1。

表1样品信息表

其中，华重楼在《中国药典》中名为“七叶一枝花”；掌叶覆盆子在《中国药典》中名为“华东覆盆子”。

(2)提取基因组DNA

按照上述所述的DNA提取方法提取供试样品的DNA。

(3)PCR扩增DNA条形码序列(ITS2)

供试样品均能通过PCR扩增出单一明亮的条带，如图1所示，可以进行后续实验。

(4)PCR片段测序、获取序列信息，通过中药材DNA条形码鉴定系统在线鉴定物种。

将16个样品(B1～B16)的PCR片段进行测序、拼接，得到的序列导入ITS2注释网站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)进行注释得到完整的ITS2序列，再利用注释后的ITS2序列输入中药材DNA条形码鉴定系统完成在线鉴定。各样品的鉴定结如图2-17所示(每个图方框中的序列即为实验获取的ITS2序列具体信息)，所有16个样品均与我们所采取的样品的物种信息相符。

实施例2

抽取《中国药典》收录的多种药用植物叶片干样基因组用于扩增DNA条形码核心序列ITS2，并通过该序列信息鉴定物种。

(1)提供样本

采集《中国药典》收录的不同物种的药用植物叶片干样共16份，见表2。

表2样品信息表

(2)提取基因组DNA

按照上述所述的DNA提取方法提取供试样品的DNA。

(3)PCR扩增DNA条形码序列(ITS2)

供试样品均能通过PCR扩增出单一明亮的条带，如图18所示，可以进行后续实验。

(4)PCR片段测序、获取序列信息，通过中药材DNA条形码鉴定系统在线鉴定物种。

将16个样品(C1～C16)的PCR片段进行测序、拼接，得到的序列导入ITS2注释网站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)进行注释得到完整的ITS2序列，再利用注释后的ITS2序列输入中药材DNA条形码鉴定系统完成在线鉴定，所有16个样品均与我们所采取的样品的物种信息相符。

实施例3

抽取实施例1和实施例2种多种药用部位非叶片的药用植物的不同部位鲜样(选取药用部位相同的组织)基因组用于扩增DNA条形码核心序列ITS2，并通过该序列信息鉴定物种。

(1)提供样本

采集《中国药典》收录的不同物种的药用植物不同部位鲜样共16份，具体见表3。

表3样品信息表

(2)提取基因组DNA

按照上述所述的DNA提取方法提取供试样品的DNA。

(3)PCR扩增DNA条形码序列(ITS2)。

供试样品均能通过PCR扩增出单一明亮的条带，如图19所示，可以进行后续实验。

(4)PCR片段测序、获取序列信息，通过中药材DNA条形码鉴定系统在线鉴定物种。

将16个样品(D1～D16)的PCR片段进行测序、拼接，得到的序列导入ITS2注释网站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)进行注释得到完整的ITS2序列，再利用注释后的ITS2序列输入中药材DNA条形码鉴定系统完成在线鉴定，各样品的鉴定结果均与均与我们所采取的样品的物种信息相符。

实施例4

本专利方法提取试剂组分不同浓度提取效果比较

本实施例供试样本同实施例1(样品信息见表1)，组分浓度差异见表4，提取步骤同实施例1内容。提取的DNA用于ITS2条形码片段扩增，扩增效果比较见表4，目的片段条带情况参照图20和图21。

表4本专利方法提取液不同浓度组分提取效果比较

从表中可以看到，在Tris-HCl、EDTA和KCl的浓度较高时，目的片段扩增的成功率严重降低，在对比浓度2下，即1mol/L Tris-HCl、100mmol/L和2mol/L KCl，目的片段扩增成功率为0。同时，Tris-HCl、EDTA和KCl的浓度对目的片段条带具有重要的影响，在实施例1浓度下，其条带单一明亮，无拖带，Tris-HCl、EDTA和KCl的浓度较高时，如在对比浓度1下，大部分条带单一，小部分(≤44％)条带较明亮，部分有拖带，参照图20所示；在对比浓度2下，未扩增出目的片段，有大量杂带且条带弥散，参照图21所示。

使用本专利方法、CTAB法和试剂盒提取方法比较，具体见表5所示，

表5本专利方法、CTAB法和试剂盒提取方法比较

CTAB法的具体内容参照文献：

黄国文,管天球,赵雨云,陈莫林,刘宏辉.一种快速高效的油茶叶片DNA提取方法[J].分子植物育种,2018,16(13):4350-4354.

试剂盒法的具体内容参考文献：

李军,张燃,于淑萍,王晓敏,冷晓红,石林春.中药材银柴胡及其混伪品的DNA条形码鉴定研究[J].药学学报,2019,54(05):937-943.

鹿江南,成航,樊佳佳,韩宗贤,高翰,王永红,刘霞.基于ITS2序列的5种鬼臼类中药材DNA条形码鉴定研究[J].中草药,2018,49(16):3907-3911.

使用本专利方法、TPS法和改良TPS法比较，具体见表6所示，

表6本专利方法、TPS法和改良TPS法比较

TPS法的具体内容参照文献：穆春华,张发军,李文才,孙琦,丁照华,王磊,孟昭东.玉米叶片基因组快速提取方法研究[J].玉米科学,2010,18(03):170-172.

TPS改良法的具体内容参照文献：张友昌,冯常辉,别墅,王小娇,易先达,张成,秦鸿德.改进的TPS法:一种棉花叶片DNA快速提取方法[J].棉花学报,2016,28(04):413-417.

综上所述，本发明提供的一种用于提取微量药用植物样品DNA的提取液及其提取方法，可用于提取多种药用植物的叶、茎、根及花等多种组织的微量样品基因组DNA，适用性广；使用该试剂提取基因组DNA的方法简便，显著缩短了操作时间；本发明提供的方法兼适用于少量和批量样本的基因组DNA提取；使用本方法提取的基因组DNA可以有效地用于目的片段PCR扩增和DNA条形码分子鉴定等用途。与现有技术相比，本发明方法具有适用性广，所需样品用量少，不含高毒、剧毒成分，成本低，操作简便、快速，易于掌握等优势。