阅读说明：本技术 一种利用角蛋白酶提取dna的方法 (method for extracting DNA by using keratinase ) 是由 张丹 侯庆唐 夏冬景 何凤琴 于 2019-09-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用角蛋白酶提取DNA的方法,该发明通过分解角蛋白获得DNA,指纹中含有皮肤角质层细胞脱落的物质,角质层细胞是一些角化死亡的细胞,含有少量尚未完全降解的基因组DNA和大量角蛋白,与角质层细胞类似,指甲、毛发也含有少量尚未完全降解的基因组DNA和大量角蛋白,而角蛋白分子内部含有丰富的二硫键,使得肽链内部和肽链之间发生交联,形成立体网状结构,使角蛋白难以溶解以及分解,加入角蛋白酶利用酶的专一性使得样品中的角蛋白被角蛋白酶分解为可溶性的多肽,从而释放样品中的DNA,并经过一系列裂解、结合、漂洗、洗脱等DNA提取步骤,实现DNA提取的目的,提取得到的DNA纯度高,方法便捷,具有很好的推广前景。(the invention discloses a method for extracting DNA by keratinase, which obtains DNA by decomposing keratin, a fingerprint contains substances shed by skin stratum corneum cells, the stratum corneum cells are cells with keratinized death, contain a small amount of genomic DNA which is not completely degraded and a large amount of keratin, are similar to the stratum corneum cells, nails and hairs also contain a small amount of genomic DNA which is not completely degraded and a large amount of keratin, keratin molecules contain rich disulfide bonds, the inside of peptide chains and peptide chains are crosslinked to form a three-dimensional network structure, the keratin is difficult to dissolve and decompose, the keratin in a sample is decomposed into soluble polypeptide by the keratinase by the specificity of enzyme by adding the keratinase, thereby releasing the DNA in the sample, and the purpose of DNA extraction is realized by a series of DNA extraction steps of cracking, combining, rinsing, eluting and the like, the extracted DNA has high purity, and the method is convenient and has good popularization prospect.)

一种利用角蛋白酶提取DNA的方法

技术领域

本发明属于提取DNA技术领域，具体涉及一种利用角蛋白酶提取DNA的方法。

背景技术

嫌疑人在犯罪现场残留的生物物证中，指纹、毛发、指甲等占有非常大的比例，而案件侦查人员想要从这些物证中获取嫌疑人遗传信息，就必须解决指纹、毛发、指甲等的DNA提取问题，指纹中含有皮肤角质层细胞脱落的物质，角质层细胞是一些角化死亡的细胞，含有少量尚未完全降解的基因组DNA和大量角蛋白，与角质层细胞类似，指甲、毛发也含有少量尚未完全降解的基因组DNA和大量角蛋白，如何消化角蛋白，释放其中的微量DNA，是从指纹、毛发、指甲中成功提取DNA的关键；

现阶段常用的DNA提取方法为有机法，有机法利用DNA易溶于水，不溶于有机溶液的特性，进行提取使用有机溶剂将样品与纯水混合，样品中蛋白质分子与水进行水合作用，在表面形成一层水化层，使蛋白质分子进入水溶液中形成稳定胶体溶液，通过加入有机溶剂进行离心提取DNA,其提取DNA特点为双链，纯度高，但在提取DNA的过程中加入一定量的有毒有机试剂，进行DNA提取时会挥发，对人体造成伤害，同时造成环境污染，且需要平凡的更换DNA离心管，导致在DNA的提取过程中DNA易受到污染，影响检测效果，同时多次更换DNA离心管，易造成容器的编码混乱，无法准确检测DNA序列；

中国发明专利CN102382821A公开了一种提取DNA的方法，该发明通过将样品经无水乙醇和蒸馏水洗涤干燥后，在加有SDS和蛋白酶K的PCR缓冲液中消化后，加入RNA酶去除RNA，然后在高盐环境下加入CTAB结合蛋白质，最终经过氯仿异戊醇抽提，异丙醇沉淀，使用乙醇溶液进行洗涤，得到DNA样品，该发明进行DNA抽取使得样品内的DNA释放充分，抽提效果好，但该发明在提取DNA的过程中，使用了一定量的有毒有机溶剂，易造成操作人员健康损害和对环境造成污染，加入过多的有机试剂，在DNA链进行放大扩增时会造成一定影响，影响后续对DNA序列的测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用角蛋白酶提取DNA的方法，先进行取样，再对样品进行处理，将处理后的样品加入离心管中，加入角蛋白酶和裂解液,角蛋白酶是一种能够专一降解天然角蛋白的酶，能将不溶解于水的角蛋白分解为可溶性的多肽，而指纹含有皮肤角质层细胞脱落的物质，角质层细胞是一些角化死亡的细胞，含有少量尚未完全降解的基因组DNA和大量角蛋白，头发和指甲含有少量尚未完全降解的基因组DNA和大量角蛋白，通过角蛋白酶使得角蛋白分解，裂解液从样品中抽取的可溶性蛋白，通过离心使得蛋白质脱离，加入结合液通过硅胶膜离心柱进行离心得到DNA，加入漂洗液使得DNA沉淀出来，多次离心使得DNA附着在硅胶膜上，使用脱洗液将DNA从硅胶膜上分理出来，获得DNA溶液；该方法未使用大量的有毒有溶剂，在提取过程中不会危害操作人员的人生安全且不会对环境造成污染，未使用大量的有毒有溶剂也不会对后续DNA序列测定造成影响，更换DNA装取容器次数较少不会对DNA造成污染，操作简便，提取DNA纯度高。

本发明要解决的技术问题：

1、常用的提取DNA的方法为有机法和Chelex100法，有机法是经典DNA提取方法，其提取DNA特点为双链，纯度高，但在提取DNA的过程中加入一定量的有毒有机试剂，进行DNA提取时会挥发，对人体造成伤害，同时造成环境污染，在提取DNA的过程中需要多次更换DNA装取容器，易对DNA造成污染，导致影响后续DNA序列测定结果；

2、常用的提取DNA的方法在提取过程中需要消耗大量试剂，且提取方法较为复杂，提取时间较长且提取出的DNA纯度不高，提取的DNA会受到RNA、蛋白质、酚的污染，无法准确测得DNA序列；

3、Chelex100法进行DNA提取，该方法提取DNA的样品需要进行多次清洗，因此造成样品中的部分DNA流失，导致完成DNA提取工作，进行DNA序列测定时无法准确测定到DNA序列，严重影响DNA测定的工作效率。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种利用角蛋白酶提取DNA的方法,包括以下步骤：

A、取样，对样品进行处理，往样品中加入角蛋白酶和裂解液，混匀后加热消化裂解；

B、将高速离心后的上清液转移至新的离心管中，往离心管中加入结合液，通过DNA结合载体结合DNA；

C、用乙醇溶液漂洗DNA结合载体；

D、用脱洗液洗脱DNA。

进一步，步骤A中所述的样品为头发、指甲、指纹的一种，具体由如下方法处理：

1)头发：取头发一根，去除毛囊部位，剪取靠近毛囊端3-4厘米长部位放入离心管中；

2)指甲：取指甲一块，剪成小块放入离心管中；

3)指纹：用沾有纯化水的拭子擦拭指纹，折断拭子头放入离心管中。

进一步，步骤B中所述的DNA结合载体为磁珠、硅珠、硅胶模中的一种。

进一步，通过磁珠提取DNA的具体步骤如下：

1.1:进行取样，对样品进行处理，将处理后的样品加入离心管中，往离心管加入角蛋白酶和裂解液,进行搅拌5-15min，在温度为50℃的条件下，进行水浴加热3-6h，制得第一混合溶液；

1.2：将步骤1.1装有第一混合溶液的离心管，放入离心机中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将上清液转移至新的离心管内，加入结合液和磁珠，将离心管放置在振荡器上，在转速为1300rpm的室温条件下，震荡5-15min，将离心管放置在磁力架上静置5-10min，去除上清液得到第一中间体；

1.3：漂洗液加入步骤1.2装有磁珠的离心管中，将离心管放置在振荡器上，在转速为1300rpm的室温条件下，震荡5-10min，将离心管放置在磁力架上静置5-10min，去除上清液，再次加入漂洗液在转速为1300rpm的室温条件下，震荡5-10min，将离心管放置在磁力架上静置5-10min，去除上清液，得到含有第二中间体的磁珠；

1.4：步骤1.3制得的含有第二中间体的磁珠放入新的离心管中，在温度为65℃，转速为1300rpm的条件下，震荡10-15min，去除磁珠制得DNA溶液。

进一步，通过硅珠提取DNA的具体步骤如下：

2.1:进行取样，对样品进行处理，将处理后的样品加入离心管中，往离心管加入角蛋白酶和裂解液,进行搅拌5-15min，在温度为50℃的条件下，进行水浴加热3-6h，制得第一混合溶液；

2.2：将步骤2.1装有第一混合溶液的离心管，放入离心机中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将上清液转移至新的离心管内，加入结合液和硅珠，将离心管放置在振荡器上，在转速为1300rpm的室温条件下，震荡5-15min，再将离心管放入离心机中，在转速为8000rpm的室温条件下，离心1-2min，去除上清液得到第三中间体；

2.3：漂洗液加入步骤2.2装有硅珠的离心管中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将离心管内的上层清液去除，再次加入漂洗液在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将离心管内的上层清液去除，在转速为12000rpm的条件下，进行离心3min，得到含有第四中间体的硅珠；

2.4：将步骤2.3含有第四中间体的硅珠放入新的离心管中，加入洗脱液，在室温的条件下，放置3min，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，取出离心柱，制得DNA溶液。

进一步，通过硅胶膜提取DNA的具体步骤如下：

3.1:进行取样，对样品进行处理，将处理后的样品加入离心管中，往离心管加入角蛋白酶和裂解液,进行搅拌5-15min，在温度为50℃的条件下，进行水浴加热3-6h，制得第一混合溶液；

3.2：将步骤3.1装有第一混合溶液的离心管，放入离心机中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将上清液转移至新的离心管内，加入结合液进行搅拌5-15min，制得第二混合溶液，将第二混合溶液加入放入收集管的硅胶膜离心柱中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心2min，将收集管内的液体去除，得到第五中间体；

3.3：将漂洗液加入步骤3.2装有第五中间体的收集管中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将收集管内的液体去除，再次加入漂洗液在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将收集管内的液体去除，在转速为12000rpm的条件下，进行离心3min，得到含有第六中间体的硅胶膜离心柱；

3.4：将步骤3.3含有第六中间体的硅胶膜离心柱放入新的离心管中，往离心柱中央的硅胶膜上滴入洗脱液，在室温的条件下，放置3min，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，取出离心柱，制得DNA溶液。

进一步，步骤A中所述的角蛋白酶的浓度为5Units/ul，角蛋白酶的用量为10ul。

进一步，步骤A中所述的裂解液成分为：10mmol/l Tris-HCl，0.1％(m/v)十二烷基硫酸钠，1mmol/lEDTA，裂解液pH值为10.0，裂解液的用量为300ul。

进一步，步骤B中所述的结合液成分为：4.5mol/l异硫氰酸胍，100mmol/l柠檬酸钠，结合液的pH值5.5，结合液的用量为450ul。

进一步，步骤C中所述的漂洗液为75％(v/v)乙醇，漂洗液的用量为500ul。

进一步，步骤D中所述的洗脱液为水或pH值8.0的TE缓冲液的一种，洗脱液的用量为30ul。

本发明的有益效果：

1、通过向样品中加入角蛋白酶和裂解液使得样品中含有的蛋白质溶解，使得DNA与蛋白质分离，加入结合液使得DNA与蛋白质分布在不同介质中，进行离心去除蛋白质，加入漂洗液多次离心或震荡后使得DNA从结合液中沉淀出来附着在吸附载体上，加入洗脱液使得DNA脱离DNA结合载体，获得DNA溶液，该方法在提取DNA的过程中未加入大量有毒有机试剂，不会影响操作人员健康且不会对环境造成污染，不会影响后续DNA的扩增，进一步保证了DNA测序的效果，不需要多次进行DNA离心管的更换，减少了DNA被污染的风险；

2、样品包括指纹、指甲、头发，指纹中含有皮肤角质层细胞脱落的物质，角质层细胞是一些角化死亡的细胞，含有少量尚未完全降解的微量基因组DNA和大量角蛋白，指甲、毛发也含有少量尚未完全降解的微量基因组DNA和大量角蛋白，角蛋白可以分成软角蛋白和硬角蛋白两类，软角蛋白存在于皮肤和其他一些细胞组织中，硬角蛋白是构成毛发、指甲等的主要成分，角蛋白分子内部含有丰富的二硫键，使得肽链内部和肽链之间发生交联，形成立体网状结构，使天然角蛋白难以溶解以及分解，加入角蛋白酶利用酶的专一性使得样品中的角蛋白分解为可溶性的多肽，从而释放样品中的微量DNA,再通过DNA结合载体进行离心或震荡，将DNA有吸附作用的官能基团固定在DNA结合载体上，加入结合液、漂洗液、洗脱液反复离心或震荡，使得DNA与杂质分离，该方法获得DNA纯度高，样品需求量小，在操作过程不需要进行多次清洗，使得样品中含有的DNA可以完全提取出来,操作简便，成本较低，对后续DNA序列的测定没有影响。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种利用角蛋白酶提取DNA的方法，具体步骤如下：

步骤S1：取头发一根，去除毛囊部位，剪取靠近毛囊端3-4厘米长部位，并将其剪成小段放入离心管中，往离心管加入角蛋白酶和裂解液,进行搅拌5-15min，在温度为50℃的条件下，进行水浴加热3-6h至头发完全溶解，制得第三混合溶液；

步骤S2：将步骤S1装有第三混合溶液的离心管，放入离心机中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将上清液转移至新的离心管内，加入结合液进行搅拌5-15min，制得第四混合溶液，将第四混合溶液加入放入收集管的硅胶膜离心柱中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心2min，将收集管内的液体去除，得到含有第七中间体的硅胶膜；

步骤S3：将漂洗液加入步骤S2装有硅胶膜的收集管中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将收集管内的液体去除，再次加入漂洗液在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将收集管内的液体去除，在转速为12000rpm的条件下，进行离心3min，得到含有第八中间体的硅胶膜离心柱；

步骤S4：将步骤S3含有第八中间体的硅胶膜离心柱放入新的离心管中，往离心柱中央的硅胶膜上滴入洗脱液，在室温的条件下，放置3min，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，取出离心柱，制得DNA溶液。

实施例2

一种利用角蛋白酶提取DNA的方法，具体步骤如下：

步骤S1：取指甲一块，剪成小块放入离心管中，往离心管加入角蛋白酶和裂解液,进行搅拌5-15min，在温度为50℃的条件下，进行水浴加热3-6h至指甲完全溶解，制得第五混合溶液；

步骤S2：将步骤S1装有第五混合溶液的离心管，放入离心机中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将上清液转移至新的离心管内，加入结合液进行搅拌5-15min，制得第四混合溶液，将第六混合溶液加入放入收集管的硅胶膜离心柱中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心2min，将收集管内的液体去除，得到含有第九中间体的硅胶膜；

步骤S3：将漂洗液加入步骤S2装有硅胶膜的收集管中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将收集管内的液体去除，再次加入漂洗液在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将收集管内的液体去除，在转速为12000rpm的条件下，进行离心3min，得到含有第十中间体的硅胶膜离心柱；

步骤S4：将步骤S3含有第十中间体的硅胶膜离心柱放入新的离心管中，往离心柱中央的硅胶膜上滴入洗脱液，在室温的条件下，放置3min，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，取出离心柱，制得DNA溶液。

实施例3

一种利用角蛋白酶提取DNA的方法，具体步骤如下：

步骤S1：手指在干净的玻璃表面按压5秒，用沾有纯化水的拭子擦拭指纹，折断拭子头，将拭子头、角蛋白酶、裂解液加入离心管中,进行搅拌5-15min，在温度为50℃的条件下，进行水浴加热3-6h，制得第七混合溶液；

步骤S2：将步骤S1装有第七混合溶液的离心管，放入离心机中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将上清液转移至新的离心管内，加入结合液进行搅拌5-15min，制得第八混合溶液，将第八混合溶液加入放入收集管的硅胶膜离心柱中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心2min，将收集管内的液体去除，得到含有第十一中间体硅胶膜；

步骤S3：将漂洗液加入步骤S2装有硅胶膜的收集管中，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将收集管内的液体去除，再次加入漂洗液在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，将收集管内的液体去除，在转速为12000rpm的条件下，进行离心3min，得到含有第十二中间体的硅胶膜离心柱；

步骤S4：将步骤S3含有第十二中间体的硅胶膜离心柱放入新的离心管中，往离心柱中央的硅胶膜上滴入洗脱液，在室温的条件下，放置3min，在转速为12000rpm的条件下，进行离心1min，取出离心柱，制得DNA溶液。

对比例1

本对比例为Chelex100法测定上述样品。

对比例2

本对比例为有机法测定上述样品。

对实施例1-3和对比例1-2进行DNA纯度检测，检测结果如下表1所示；

DNA纯度：将实施例1-3和对比例1-2提取的DNA溶液进行稀释制成相应试样，分别将试样加入光程为0.5cm的石英比色皿中，分别在紫外分光光度计上测定试样在OD260和OD280的值,计算DNA浓度，得到OD260值与OD280值的比。

表1

OD260/OD280的值≈1.8时，DNA的纯度高，OD260/OD280的值>1.9时表明提取的DNA中含有RNA污染，纯度不高，OD260/OD280的值<1.6时表明提取的DNA中含有，蛋白质、酚等污染，纯度不高，从上表1中可以看出实施例1-3提取的DNA纯度高，且提取DNA的纯度较稳定，对比例1提取的DNA虽然出现纯度高的试样，但出现多例试样出现受到RNA、蛋白质、酚的污染，导致提取的DNA纯度不高，对比例2提取的DNA纯度高，但为有机法提取DNA，在提取DNA的过程中需要加入大量的有毒有机试剂，影响操作人员健康和造成环境污染，且在提取过程中需要多次更换DNA装取容器造成其它污染；所以本发明一种利用角蛋白酶提取DNA的方法提取的DNA纯度高，更换DNA离心管次数较少，操作简单，不需要加入有毒的有机溶剂，保护了人员安全防止了环境污染。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。