阅读说明：本技术 一种植物基因组dna的提取方法及其应用 (Extraction method and application of plant genome DNA ) 是由 郑洪坤 毕经德 骆晨 朱艳荣 王瑞 于 2019-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及分子生物学技术领域,具体涉及一种植物基因组DNA的提取方法及其应用。本发明提供一种植物基因组DNA的提取方法,其为在利用CTAB裂解植物细胞后,加入SDS和EDTA溶液进行抽提,经沉淀获得基因组DNA。该方法采用CTAB裂解试剂进行植物组织细胞裂解、配合SDS和EDTA作为抽提试剂沉淀去除蛋白质等杂质。利用本发明提供的植物基因组DNA提取方法能够获得高浓度、高纯度和高完整性的植物基因组DNA,可满足基因组测序的要求,同时避免了酚/氯仿有毒化学试剂的使用；该方法还具有成本低廉、操作步骤简单、提取耗时短等优势,适用于大量植物样本基因组测序的基因组DNA的提取。(The invention relates to the technical field of molecular biology, in particular to an extraction method of plant genome DNA and application thereof. The invention provides a method for extracting plant genome DNA, which is characterized in that after a CTAB is utilized to crack plant cells, SDS and EDTA solution are added for extraction, and the genome DNA is obtained through precipitation. The method adopts a CTAB lysis reagent to perform plant histiocyte lysis, and adopts SDS and EDTA as extraction reagents to precipitate and remove impurities such as protein and the like. By utilizing the plant genome DNA extraction method provided by the invention, the plant genome DNA with high concentration, high purity and high integrity can be obtained, the requirement of genome sequencing can be met, and the use of phenol/chloroform toxic chemical reagents is avoided; the method also has the advantages of low cost, simple operation steps, short extraction time and the like, and is suitable for extracting the genome DNA of the genome sequencing of a large number of plant samples.)

一种植物基因组DNA的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种植物基因组DNA的提取方法及其应用。

背景技术

随着基因组测序技术的发展，植物基因组的序列、结构和功能研究飞速发展，而获得高纯度、高含量和高完整度的植物基因组DNA是基因组测序技术得以应用的首要前提。由于植物组织中含有大量的多糖、多酚类物质以及其它结构复杂的次级代谢产物，使得植物基因组DNA的提取较微生物、动物组织或血液样品基因组提取面临更大的难度。加之基因组测序文库构建对于基因组DNA的完整性、纯度和浓度的要求较用于检测扩增实验的模板等普通实验更高，使得获得能够满足基因组测序要求的植物基因组DNA更为困难。

利用CTAB法提取植物基因组DNA是目前最经济有效也是应用最普遍的方法。但是在提取过程中会使用到酚、氯仿或者氯仿、异戊醇的抽提步骤，以达到去除蛋白质等杂质的目的，使提取得到的基因组DNA的纯度满足后续NGS测序等应用要求。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考中，氯仿在2B类致癌物清单中。由于传统CTAB法使用的酚、氯仿抽提试剂均具有毒性，使得实验人员的安全性问题受到较大威胁。而现有技术报道的CTAB法的替代方法，或存在成本高、不适合大量样本处理的问题(如磁珠纯化、柱纯化法)，或存在多糖、多酚等杂质去除不彻底，导致DNA纯度较低的问题(如SDS裂解法)。如何利用较为安全的试剂、以简单的提取流程、较低的试剂成本即可获得高纯度、高浓度和高完整性、能够满足基因组测序要求的植物基因组DNA是目前亟需解决的技术问题。

发明内容

为解决现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供一种无需使用酚、氯仿有毒试剂、能够获得高纯度、高浓度和高完整性、满足基因组测序要求的基因组DNA的植物基因组DNA提取方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明通过大量研究和实践，发现采用SDS和EDTA作为抽提试剂可以很好地替代传统CTAB法中的酚/氯仿/异戊醇抽提试剂，获得与传统的CTAB法质量(纯度、浓度和完整性)相当或更优的植物基因组DNA，基于该发现本发明提供以CTAB裂解试剂进行植物组织细胞裂解、配合SDS和EDTA作为沉淀去除蛋白质等杂质的抽提试剂的植物基因组DNA提取方法。

本发明提供一种植物基因组DNA的提取方法，其为在利用CTAB裂解液裂解植物细胞后，加入抽提剂进行抽提，经沉淀获得基因组DNA；所述抽提剂包含SDS和EDTA。

作为优选，所述抽提剂的添加量为使得抽提体系中SDS的质量体积比g：ml为0.9～1.1％，EDTA的浓度为4～6mM。

本发明发现，采用上述浓度的SDS和EDTA进行抽提能够在更好地发挥沉淀去除蛋白质等杂质的作用的同时保证基因组DNA的完整性。

进一步优选地，所述抽提剂为SDS和EDTA的水溶液。

进一步优选地，所述抽提为在-15～-20℃放置5～10min后，低温离心收集下层溶液。在上述低温条件下抽提能够使得SDS和EDTA更好地发挥沉淀去除蛋白质等杂质的作用的同时保证基因组DNA的完整性。

本发明中，所述CTAB裂解液包含CTAB、NaCl、PVP40、Tris-HCl、EDTA、D-Sorbitol、无水亚硫酸钠和β-巯基乙醇。

作为优选，所述CTAB裂解液的添加量为使得裂解体系中NaCl的浓度为1.8～2.2M。采用上述CTAB裂解液中NaCl的浓度，能够更好地与SDS和EDTA的抽提步骤配合，促进蛋白质与SDS络合形成复合物，更好地实现分离去除蛋白质等杂质的目的。

进一步优选地，所述裂解液的添加量为使得裂解体系中CTAB的质量体积比g：ml为1.8～2.2％，PVP40的质量体积比g：ml为1.8～2.2％，Tris-HCl的浓度为90～110mM，EDTA的浓度为22.5～27.5mM，D-Sorbitol的浓度为315～385mM，NaCl的浓度为1.8～2.2M，无水亚硫酸钠的浓度为90～110mM，β-巯基乙醇的体积百分比为1.5～3％。采用上述CTAB裂解方法能够在保证充***解植物组织细胞的同时，更好地与SDS和EDTA的抽提步骤配合，更有利于高质量基因组DNA的获得。

进一步优选地，所述CTAB裂解为在60～65℃处理30～50min。

本发明中，所述沉淀优选采用异丙醇沉淀。

所述异丙醇沉淀优选为在抽提得到的下层溶液中加入醋酸钠和异丙醇在-20℃放置20～30min。

进一步优选地，所述醋酸钠的添加量为使得其在沉淀体系中的浓度为150～200mM；所述异丙醇的添加量为沉淀体系总体积的35～40％。

作为本发明的优选方案，所述的植物基因组DNA的提取方法包括如下步骤：

(1)在液氮中充分研磨植物组织，得到植物组织粉末；

(2)在步骤(1)的植物组织粉末中加入所述CTAB裂解液至裂解体系中CTAB的质量体积比g：ml为1.8～2％，PVP40的质量体积比g：ml为1.8～2％，Tris-HCl的浓度为90～100mM，EDTA的浓度为22.5～25mM，D-Sorbitol的浓度为315～350mM，NaCl的浓度为1.8～2M，无水亚硫酸钠的浓度为90～100Mm，β-巯基乙醇的体积百分比为1.5～2％，于65℃处理30～50min；

(3)室温放置3～5min后低温离心收集上清；在收集的上清中加入所述抽提剂，于-20℃放置5～10min进行抽提；所述抽提剂的添加量为使得抽提体系中SDS的质量体积比g：ml为0.9～1％，EDTA的浓度为4～5mM；

(4)低温离心，收集下层溶液；在收集的下层溶液中加入醋酸钠和异丙醇，于-20℃沉淀20～30min；所述醋酸钠的添加量为使得其在沉淀体系中的浓度为150～200mM；所述异丙醇的添加量为沉淀体系总体积的35～40％；

(5)低温离心弃去上清后，采用乙醇洗涤沉淀2次，干燥、溶解基因组DNA，加入RNA酶去除RNA。

作为本发明的更优选方案，所述的植物基因组DNA的提取方法包括如下步骤：

(1)在液氮中充分研磨植物组织，得到植物组织粉末；

(2)在步骤(1)的植物组织粉末中加入预热的CTAB裂解液至裂解体系中CTAB的质量体积比g：ml为2.0％，PVP40的质量体积比g：ml为2.0％，Tris-HCl的浓度为100mM，EDTA的浓度为25mM，D-Sorbitol的浓度为350mM，NaCl的浓度为2M，无水亚硫酸钠的浓度为100mM，β-巯基乙醇的体积百分比为2％，于65℃处理40min；

(3)室温放置5min后，于4℃、15000×g离心10min，收集上清；在收集的上清中加入所述提取剂，于-20℃放置10min进行抽提；所述提取剂的添加量为使得抽提体系中SDS的质量体积比g：ml为1％，EDTA的浓度为5mM；

(4)于4℃、15000×g离心10min，收集下层溶液(避开上层固态蛋白层)；在收集的下层溶液中加入1/10体积的3M醋酸钠和0.7倍体积的异丙醇，于-20℃沉淀30min；

(5)低温离心弃去上清后，采用乙醇洗涤沉淀2次，干燥、采用含有10ng/μl的RNA酶的TE溶液溶解基因组DNA，37℃孵育30min，得到基因组DNA。

本发明还提供一种植物基因组DNA提取试剂盒，其包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A包含CTAB质量体积比g：ml 1.8～2.2％，PVP40质量体积比g：ml 1.8～2.2％，Tris-HCl 90～110mM，EDTA 22.5～27.5mM，D-Sorbitol 315～385mM，NaCl 1.8～2.2M，无水亚硫酸钠90～110mM；所述试剂B包含β-巯基乙醇；所述试剂C包含SDS质量体积比g：ml 9～11％和45～55mM EDTA。

优选地，所述试剂A和试剂C的溶剂为水。

本发明还提供所述植物基因组DNA的提取方法或所述植物基因组DNA提取试剂盒在植物基因组测序文库构建中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种植物基因组DNA的提取方法，该方法采用CTAB裂解试剂进行植物组织细胞裂解、配合SDS和EDTA作为抽提试剂沉淀去除蛋白质等杂质。利用本发明提供的植物基因组DNA提取方法能够获得高浓度、高纯度和高完整性的植物基因组DNA，可满足基因组测序的要求。

利用本发明提供的植物基因组DNA提取方法，在保证提取的基因组DNA质量的同时避免了酚/氯仿有毒化学试剂的使用，有效降低了对实验人员身体健康潜在的伤害及实验废液对生态环境的破坏。同时，本发明提供的植物基因组DNA提取方法还具有成本低廉、操作步骤简单、提取耗时短等优势，与柱纯化法、磁珠法等基因组DNA提取方法相比具有优异的成本和时间优势，适用于大量植物样本基因组测序的基因组DNA的提取。

附图说明

图1为本发明实施例1中的植物基因组DNA的提取方法的流程示意图。

图2为本发明实验例1中利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性；其中，M代表Marker(λDNA的HindIII消化产物)，CK是作为对照的λDNA，泳道1是实施例1的方法提取得到的小麦叶片基因组DNA样品，泳道2是对比例1的方法提取得到的小麦叶片基因组DNA样品。

图3为本发明实验例2中利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性；其中，M代表Marker(λDNA的HindIII消化产物)，泳道1-7依次是利用实施例1的方法提取得到的水稻、棉花、高粱、大豆、花生、谷子和玉米的叶片基因组DNA样品。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一种植物基因组DNA的提取方法

本实施例提供一种植物基因组DNA的提取方法，具体如下(流程图如图1所示)：

1、将研钵和研磨棒于液氮中彻底冷却后，将植物组织样品放入研钵中，立即将液氮注入研钵中，用研钵棒将组织充分研磨成粉末状(期间保证样品不能融化，需要一直保持在低温状态)；充分研磨后用液氮预冷的药匙分别将100mg组织粉末立即装入提前预冷好已标记样品名称的2.0ml进口离心管中，盖紧管盖后放入液氮中保存备用(装管前需将离心管中液氮挥发充分以防止炸管)。

2、在步骤1的装有组织粉末的离心管中加入1mL 65℃预热的不含β-巯基乙醇的CTAB裂解液和20μL的β-巯基乙醇，盖上离心管盖后快速涡旋几秒，使裂解液和组织粉末充分混合，于65℃温浴40min，期间每10min缓慢轻摇五下，使沉淀在下方的组织粉末重新分散至溶液中；CTAB裂解液的组成如下：CTAB的质量体积比(g：ml)为2.0％，PVP40的质量体积比(g：ml)为2.0％，Tris-HCl的浓度为100mM，EDTA的浓度为25mM，D-Sorbitol的浓度为350mM，NaCl的浓度为2M，无水亚硫酸钠的浓度为100mM。

3、温浴结束后取出离心管，于室温放置5min后，15000×g，4℃离心10min。

4、用1.0mL枪头将上清转入一个新的进口2.0mL离心管中，加入1/10体积的抽提剂，于-20℃放置10min后，15000×g，4℃离心10min。避开上层固态蛋白层用1.0mL枪头将下层溶液转入一个新的进口2.0mL离心管中；抽提剂的组成如下：10％SDS(质量体积比g：ml)、50mM EDTA溶液。

5、在步骤4得到的下层溶液中加入下层溶液1/10体积3M NaAc和0.7倍体积的异丙醇，于-20℃放置30min。

6、15000×g，4℃离心15min后，轻轻倒弃溶液(不要碰到沉淀)用1mL 75％乙醇清洗沉淀2次。

7、最后再15000×g，离心2min弃上清，瞬时离心后，用10μl枪头将残留溶液吸弃，室温干燥10min。

8、向干燥后的沉淀中加入50μl含10ng/μl RnaseA的TE溶液，37℃温育30min，即得基因组DNA。

对比例1

本对比例提供一种植物基因组DNA的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤4为：用1.0mL枪头将上清转入一个新的进口2.0mL离心管中，加入与上清等体积氯仿-异戊醇(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，缓慢轻摇混匀，室温静置2min后，15000×g、4℃离心10min；用1.0mL枪头将上层溶液转入一个新的进口2.0mL离心管中(轻轻吸取，避免触碰中间蛋白层及下层有机溶液层)，再次加入与上清等体积氯仿-异戊醇(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，缓慢轻摇混匀，室温静置2min后，15000×g、4℃离心10min，用1.0mL枪头将上层溶液转入一个新的进口2.0mL离心管中。

实验例1小麦基因组DNA的提取和质量分析

分别利用实施例1和对比例1的方法提取小麦叶片的基因组DNA，并利用Nanodrop、Qubit和琼脂糖凝胶电泳对利用实施例1和对比例1提供的方法提取得到的小麦叶片基因组DNA进行浓度、纯度和完整性分析。

小麦叶片基因组DNA的浓度和纯度的检测结果如表1所示，结果显示，实施例1的提取方法和对比例1的提取方法提取得到的小麦叶片基因组DNA在浓度和纯度方面基本相当，表明采用本发明实施例1的方法提取小麦基因组DNA的得率高，纯度高，能够满足NGS测序对DNA样品纯度和总量的要求。

表1小麦基因组DNA的质量检测

利用1％琼脂糖凝胶电泳进一步检测利用实施例1和对比例1提供的方法提取得到的小麦叶片基因组DNA的完整性，电泳的具体条件为：70V，电泳45min。电泳检测结果如图2所示，结果表明，利用实施例1的提取方法和对比例1的提取方法提取得到的小麦叶片基因组DNA，胶孔无杂质、主带清晰，无拖尾降解现象，完整性非常好，能够满足NGS测序对DNA样品完整性的要求。

实验例2其他农作物基因组DNA的提取和质量分析

利用实施例1的方法分别提取水稻、棉花、高粱、大豆、花生、谷子和玉米共七种植物叶片的基因组DNA，并利用Nanodrop、Qubit和琼脂糖凝胶电泳对利用实施例1的方法提取得到的水稻、棉花、高粱、大豆、花生、谷子和玉米叶片基因组DNA进行浓度、纯度和完整性分析。

水稻、棉花、高粱、大豆、花生、谷子和玉米基因组DNA的浓度和纯度的检测结果如表2所示，结果显示，采用本发明实施例1的方法提取水稻、棉花、高粱、大豆、花生、谷子和玉米叶片的基因组DNA的得率高，纯度好，能够满足NGS测序对DNA样品纯度和总量的要求。

表2七种农作物基因组DNA的质量检测

利用1％琼脂糖凝胶电泳进一步检测利用实施例1的方法提取得到的水稻、棉花、高粱、大豆、花生、谷子和玉米基因组DNA的完整性，电泳的具体条件为：70V，电泳45min。电泳检测结果如图3所示，结果表明，利用实施例1的提取方法提取得到的水稻、棉花、高粱、大豆、花生、谷子和玉米基因组DNA，胶孔无杂质、主带清晰，无拖尾降解现象，完整性非常好，能够满足NGS测序对DNA样品完整性的要求。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。