阅读说明：本技术 精氨酸在提高紫色红曲菌产monacolin K上的应用 (Application of arginine in improving monacolin K production by monascus purpureus ) 是由 张婵 王成涛 孙宝国 朱倩倩 张函 李颖慧 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种紫色红曲菌产monacolin K的发酵培养基,成分含有精氨酸,本发明将精氨酸添加到培养基中,当添加量为0.6%时,与原始发酵培养基相比,第8天的monacolin K产量提高了3.65倍,第15天的monacolin K产量提高了2.89倍。(The invention discloses a fermentation culture medium for producing monacolin K by monascus purpureus, which contains arginine as a component, wherein the arginine is added into the culture medium, and when the addition amount is 0.6%, compared with the original fermentation culture medium, the yield of the monacolin K on day 8 is improved by 3.65 times, and the yield of the monacolin K on day 15 is improved by 2.89 times.)

精氨酸在提高紫色红曲菌产monacolin K上的应用

技术领域

本发明涉及精氨酸在提高紫色红曲菌产monacolin K上的应用，属于生物技术制备领域。

背景技术

红曲菌又称“红曲霉”，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌可以产生多种次级代谢产物，如红曲色素、monacolin K、γ-氨基丁酸和桔霉素等，其中许多代谢产物被广泛的应用于食品色素、医药、酿酒等方面，monacolin K又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，monacolin K具有抑制胆固醇合成中关键酶HMG-CoA活性的作用，能够有效的抑制胆固醇合成，因此，monacolin K被国内外视为降胆固醇的理想药。

红曲菌中monacolin K活性成分含量偏低、生产成本高等因素，严重制约了功能性红曲在降脂降压方面作用的发挥，以及功能红曲产品的大规模产业化发展。近年来，为了提高功能红曲的品质，研究人员在优化发酵条件等方面进行了大量深入而细致的研究工作，如RashmiDikshit和LijuanYu等人通过响应面法对培养基发酵条件进行优化来提高monacolin K产量。陈小林、马义芝和赵树欣等人通过在培养基中添加不同的诱导物来促进monacolin K的合成。由于实验菌株、处理方法及检测方法不同，不能很好的确定哪种添加物是最佳诱导物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种紫色红曲菌产monacolin K的发酵培养基，主要是添加精氨酸来刺激诱导monacolin K的产量。

本发明基于前期代谢组学研究结果，发现了上千种物质的含量在monacolin K合成过程中含量变化幅度较大，通过筛选标准FC>2,p<0.05,VIP>1共筛选到800多种，根据superclass分类统计筛选到的差异代谢物的类别约二十余种，从中又筛选出十余种与柠檬酸循环、乙酰-CoA合成等相关的物质，初步拟定将精氨酸、苹果酸、D-葡萄糖、α-酮戊二酸、精氨酸、苯丙氨酸、L-乳酸、黄素单核苷酸、焦磷酸硫胺素、赖氨酸等十种物质添加到普通发酵培养基中，通过观察第8天和第15天的monacolin K产量，从而筛选出对monacolin K产量提高最显著的添加物。通过添加不同浓度的上述物质，发现当精氨酸添加量为0.6%时，与原始发酵培养基相比，第8天的monacolin K产量提高了3.65倍，第15天的monacolin K产量提高了2.89倍。因此本发明主要研究了在培养基中添加不同含量的精氨酸，与原始培养基同步培养，检测其色价，生物量，monacolin K等相关指标。

本发明提供一种紫色红曲菌产monacolin K的发酵培养基，成分含有精氨酸。精氨酸的含量为0.4-1.5%。

进一步的，精氨酸的含量为0.6%。

本发明的有益效果是：

本发明将精氨酸添加到培养基中，当添加量为0.6%时，与原始发酵培养基相比，第8天的monacolin K产量提高了3.65倍，第15天的monacolin K产量提高了2.89倍。

附图说明

下面结合附图对本发明的

具体实施方式

作进一步详细的说明。

图1是不同添加量的精氨酸的monacolin K产量对比图。

图2是精氨酸添加浓度的确定图。

图3不同发酵时间的颜色比对。

图4 普通菌株与添加精氨酸菌株的生物量。

图5 普通菌株与添加精氨酸菌株的pH值。

图6不同培养基中不同放大倍数的红曲菌M1形态。a, b为普通培养基中菌体形态；c, d 为精氨酸培养基中菌体形态；a、c为放大5000×倍；b、d为放大10000×倍； 红箭头为褶皱。

图7a普通菌株与添加精氨酸菌株的红色素产量对比图。

图7b普通菌株与添加精氨酸菌株的橙色素产量对比图。

图7c 普通菌株与添加精氨酸菌株的黄色素产量对比图。

图8 普通菌株与添加精氨酸菌株的monacolin K产量对比图。

图9 添加谷氨酸与添加精氨酸菌株的monacolin K产量对比。

图10 添加谷氨酸与添加精氨酸菌株的红曲色素产量对比。

具体实施方式

实施例1 精氨酸对monacolin K产量影响的实验

实验步骤：

实验前期通过查阅文献，选择精氨酸添加量为0.5%，1%和1.5%，通过红曲菌液态发酵以及HPLC检测monacolin K发现，随着精氨酸添加量的增加，monacolin K产量反而降低，因此又以0.5%为标准，分别选取0.4%, 0.5% 和 0.6%的精氨酸进行添加，发现当精氨酸添加量为0.6%时，monacolin K的产量最高。之后又进一步检测了精氨酸添加后的另外一些生理指标变化，如红曲色素，pH值，生物量以及扫描电镜分析等。

菌株活化:将 M1 菌株在PDA培养基上30℃培养3d，活化2代。

种子液的制备:用接种环从培养基上的菌中刮取1环菌液到普通液体种子培养基中，30 ℃、200 r/min 培养 2 d。

发酵液的制备:按 10% 的接种量将种子液接种到普通液体发酵培养基中，30 ℃、150 r/min 培养2d,然后25℃，150 r/min培养12d。

添加精氨酸的液体发酵培养基，精氨酸的添加量为0.6%。具体见图1-2。

普通液体发酵培养基(g/L)的成分：甘油 90 g，ZnSO₄ .7H₂O 2 g，大米粉 20 g，KH₂PO₄ 2.5 g，蛋白胨 10 g，NaNO₃ 5 g，MgSO₄ .7H₂O 1 g。

将精氨酸的添加量为0.6%，进行下列实验：

（1）发酵液颜色对比

具体见图3。

（2）生物量检测

采用干重法测菌丝体生物量。取5 mL发酵液用3层纱布过滤，再用蒸馏水洗涤2-3次，拧干水分，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，即为菌丝体干重。

生物量(g/L)=干物质质量/发酵液体积。结果见图4

（3）pH值检测

首先将pH计校准。先用蒸馏水清洗电极，再用发酵液清洗一次，用玻璃棒搅拌溶液，使溶液均匀，把电极浸入被测溶液中，读出其pH值。每次检测时，用蒸馏水进行冲洗并擦干。结果见图5。

（4）扫描电镜处理

培养8 d的红曲菌菌体，12000 r/min 离心5 min收集菌体细胞，将细胞重悬（用枪头吹打，吹打时注意不要将细胞吸入枪头造成细胞损失）于2.5%戊二醛溶液（PBS缓冲溶液稀释）固定12 h。用0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）漂洗细胞两次（两次重悬离心）弃去上清液。依次用不同浓度的乙醇溶液（30%，50%，70%，80%，90%，100%）对细胞进行脱水，每种浓度静置10 min，12000 r/min 离心5 min（每种浓度重复两次），弃去上清液。先把菌体重悬于醋酸异戊酯与乙醇（v : v=1:1）中，再重悬与醋酸异戊酯溶液中，以对细胞进行乙醇置换。将细胞重悬于每种溶剂中静置10 min，12000 r/min 离心5 min，弃去上清液。加入溶剂六甲基二硅胺(HexamethylDisilazane，HMDS)，用量没过样品即可，用脱脂棉将离心管口塞上，置于60˚C 烘箱干燥直至样品成粉末状，留待观察。结果见图6。

（5）色价检测

发酵液的预处理：取发酵液1 mL，加入8 mL 70%的乙醇溶液，于恒温水浴锅60 ℃浸提1h，4000 rpm离心15 min，避光放置。

色价的检测：用紫外分光光度计测定410 、448、505 nm处吸光值。

定量公式：红曲色素色价（U/mL）= 吸光值 × 稀释倍数。

结果见图7a、7b、7c。

（6）Monacolin K检测

发酵液的预处理：取发酵液5 mL，加入15 mL 75%的甲醇，超声波萃取30 min，静置过夜。

monacolin K的检测：采用HPLC法，色谱柱：InertsilODS-3 C18 (150 mm×4.6 mm×5μm)，流动相：0.1%磷酸：甲醇=1：3，流速1 mL/min，检测器为紫外检测器(PDA)，检测波长237 nm，检测温度30 ℃，进样量10 μL。结果见图8。

具体实验结果如下：

1.添加精氨酸后monacolin K的产量相较于野生型菌株提高了2-3倍。

2.与原始菌株相比，添加精氨酸后第15天的红曲红色素，橙色素以及黄色素分别提高了2.50,2.27和2.01倍。

实施例2：谷氨酸和精氨酸的效果对比：

现有技术中，《十种添加物对红曲菌monacolin K 产量的促进效果分析》一文中，在实验室原培养基成分中添加山药粉、桔皮粉、酵母菌液、酵母上清液、酵母破壁液、破壁后的酵母菌液、亮氨酸、谷氨酸、乙醇等物质，对不同培养基中红曲菌的次级代谢产物产量进行测定。结果表明:添加谷氨酸可以极显著( p ＜ 0.01) 提高monacolin K 产量，提高了5.60倍。

谷氨酸和精氨酸的区别在于：虽然谷氨酸的效果比精氨酸好，但是，谷氨酸的缺点是：虽能显著提高monacolin K的产量，但是红曲色素产量相较于原培养基降低，而精氨酸在提高monacolin K产量的同时，对红曲色素的产量也有提高效果。

谷氨酸发酵培养基（g/L）：甘油90 g，大米粉 20 g，蛋白胨 10 g，KH₂PO₄ 2.5 g，NaNO₃ 5 g，MgSO₄.7H₂O 1 g，ZnSO₄.7H₂O 2 g，谷氨酸0.15 g。

结果如图9添加谷氨酸与添加精氨酸菌株的monacolin K产量对比所示，第2天不产monacolin K，图9a中，添加谷氨酸后monacolin K产量达到203.8 mg/L,相较于原始培养基提高了5.60倍，图9b中添加精氨酸后的产量达到了358.0 mg/L，提高了3.34倍。

结果如图10添加谷氨酸与添加精氨酸菌株的红曲色素产量对比所示，通过红曲色素结果比较发现，添加谷氨酸后对于红曲色素的产生具有抑制作用，而精氨酸的添加则有效促进了红曲色素的产生，红曲红，橙，黄色素产量分别提高了2.50, 2.27和2.01倍。