阅读说明：本技术 多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物及其制备方法与应用 (Polycyclic polyisocyanate pentenyl acyl phloroglucinol class compound and the preparation method and application thereof ) 是由 田文静 陈海峰 王光辉 林挺 邱大任 周宓 于 2019-08-13 设计创作，主要内容包括：多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物及其制备方法与应用,涉及医药技术领域。从挺茎遍地金全草中得到,提取分离方法简易,原料容易获得。多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物在制备抗肿瘤药物中应用,可作为以核受体RXRα为靶点的抗癌药物的应用。可以靶向核受体RXRα抑制人乳腺癌细胞株(MCF-7)和宫颈癌细胞株(HeLa)的增殖。因此,化合物有望开发为以核受体RXRα为靶点的抗肿瘤药物或作为抗肿瘤药物开发的先导化合物。(Polycyclic polyisocyanate pentenyl acyl phloroglucinol class compound and the preparation method and application thereof, is related to pharmaceutical technology field.It is obtained from very stem Herba hyperici elodeoidis herb, extraction separation method is simple, and raw material is easy to get.Polycyclic polyisocyanate pentenyl acyl phloroglucinol class compound is applied in the preparation of antitumor drugs, can be used as using nuclear receptor RXR α as the application of the anticancer drug of target spot.The proliferation that nuclear receptor RXR α inhibits Breast cancer lines (MCF-7) and cervical cancer cell lines (HeLa) can be targeted.Therefore, compound is expected to exploitation as using nuclear receptor RXR α as the anti-tumor drug of target spot or the lead compound developed as anti-tumor drug.)

多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

癌症，即恶性肿瘤，是目前危害人类健康的主要疾病之一。乳腺癌和***是常发生在妇女身上的恶性肿瘤，严重地威胁全世界女性的健康，据世界卫生组织国际癌症研究机构对全球184个国家和地区癌症研究报告，2018年全球约有乳腺癌病例210万，在所有1810万新发癌症病例中占11.6％。乳腺癌在860万女性癌症新发病例中占24.2％，并在420万女性癌症死亡病例中占15.0％，均高居第一位(马丹丹.2018年全球癌症统计:乳腺癌发病和死亡人数统计[J].中华乳腺病杂志,2018,12(6):375.)。***新发病例也占到了所有新发癌症病例的5％，其中我国每年新发病例约有13.5万，占世界***新发病例的28％(刘萍.中国大陆13年***临床流行病学大数据评价[J].中国实用妇科与产科杂志,2018,34(1):41-45.)。当今这两种癌症的治疗方法主要为手术和药物，手术治疗对患者的身心会造成一定的损害(韦荣泉,WEIRong-qua.***术后患者性生活质量及其影响因素[J].中华护理杂志,2010,45(9):843-844.)。而药物治疗通常采用化疗方法，虽然可以有效延长患者的生命，但由于其耐药性和毒副作用，一直没有获得满意的效果(鲁亮,刘爱华,张汉群,曹辉,李勇,冯志宇,李杭.培美曲塞联合长春瑞滨治疗一线化疗失败的复发转移性***的疗效研究[J].中国全科医学杂志,2019,7:1-4)。

核受体(nuclear receptor,NR)超家族是一类在生物体内广泛分布的配体依赖性转录因子，在药物开发中占有很重要的地位，目前已获批的小分子药物中有16％都是靶向核受体的。视黄醇受体-α(Retinoid X receptor-α，RXRα)是多种核受体信号转导通路的关键调控者，可与众多核受体形成异源二聚体，参与包括细胞生长、分化、代谢和胚胎发育等许多重要生理过程的调节。恶性肿瘤细胞常伴随RXRα的表达或功能的异常。RXRα具有核受体的经典功能域，包括DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)(方慧,鄢庆枇.靶向核受体RXRα的淫羊藿抗炎活性成分的快速精准鉴定[J].国际检验医学杂志,2017,38(23):3245-3248.)。针对RXRα的配体结合区(LBD)研究开发的第一个以RXRα为分子靶点的药物LGD1069(Targretin)，已由FDA批准用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤。可见，RXRα是抗肿瘤药物研究的一个理想的分子靶点。目前已报道的RXRα的合成配体多具有严重的毒副作用。因此，从天然产物中发现具有高效和低毒性的以核受体RXRα为靶点的抗肿瘤药物具有重要意义。

多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物(Polycyclic PolyprenylatedAcylPhloroglucinols，简称PPAPs)是一类具有酰基间苯三酚母核，其上连有多个异戊烯基，经不同的氧化、环合、裂环等方式形成的一系列复杂的笼状骨架结构。由于酰基的种类，异戊烯基的取代位置、个数及氧化程度，不同类型的分子内环合等多个变化位点造就了PPAPs的结构复杂性和多样性。该类成分不仅结构新颖多样且具有广泛的生物活性，是藤黄科金丝桃属植物的特有成分。(郭洁茹,朱虎成,唐芳,张锦文.天然多环多异戊烯基间苯三酚衍生物研究进展[J].中草药,2017(10):2129-2145.)挺茎遍地金(Hyperiumelodeoides)为藤黄科金丝桃属植物，民间用于治疗腹泻和蛇咬伤，其提取物具有抑制核受体RXRα转录的活性。因此，为了寻找到更多靶向RXRα的抗肿瘤活性化合物，对挺茎遍地金的化学成分进行研究。

发明内容

：

本发明的第一目的在于提供多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物。

本发明的第二目的在于提供多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物的制备方法。

本发明的第三目的在于提供多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明的第四目的在于提供多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物作为以核受体RXRα为靶点的抗癌药物的应用。

所述多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物的结构式如下：

其中，R为异丙基(–CH(CH₃)₂)、仲丁基(–(CH₃)CHCH₂CH₃)、正丙基(–(CH₂)₂CH₃)等烷基或苯基。

所述多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物的结构式可为：

所述多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将挺茎遍地金全草切碎后用体积分数60％～99％的乙醇-水溶液冷浸提取2～4次，每次12～24h，收集滤液并减压浓缩得到浸膏，用水混悬，再用等体积石油醚萃取后减压浓缩得到石油醚萃取浸膏；

在步骤1)中，所述乙醇-水溶液体积分数可为70％～95％，所述冷浸提取可2～3次，每次18～24h。

2)将步骤1)得到的石油醚萃取浸膏通过硅胶柱层析法，用环己烷与乙酸乙酯梯度洗脱，得到8个馏分(Fr.1～Fr.8)；

在步骤2)中，所述环己烷与乙酸乙酯的体积比可分别为1︰0，50︰1，25︰1，10︰1，5︰1，2︰1，1︰1，0︰1。

3)将步骤2)中的馏分Fr.3再次进行硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱，得到8个馏分(Fr.3A～Fr.3H)；

在步骤3)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比可分别为1︰0，400︰1，200︰1，100︰1，50︰1，25︰1，0︰1。

4)将步骤3)中的馏分Fr.3E通过硅胶柱层析法，用石油醚和丙酮梯度洗脱，得到6个馏分(Fr.3E1～Fr.3E6)；

在步骤4)中，所述石油醚和丙酮的体积比可分别为200︰1，150︰1，100︰1，15︰1，0︰1。

5)将步骤4)中的馏分Fr.3E4通过硅胶柱层析法，用石油醚和丙酮梯度洗脱，得到5个馏分(Fr.3E4A～Fr.3E4E)；

在步骤5)中，所述石油醚和丙酮的体积比可分别为1︰0，1000︰1，500︰1，250︰1，100︰1，15︰1，0︰1。

6)将步骤5)中的馏分Fr.3E4C通过葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析法，甲醇和二氯甲烷作为流动相洗脱，合并为2个馏分(Fr.3E4C1～Fr.3E4C2)；

在步骤6)中，所述甲醇和二氯甲烷的体积比可为1︰1。

7)将步骤6)中的馏分Fr.3E4C1经HPLC高效液相色谱法制备分离得到化合物2；

在步骤7)中，所述HPLC高效液相色谱法可为ODS Rp-18，5μm，250×10mm，97％MeOH/H₂O，5mL/min；所述化合物2的结构式可为：

8)将步骤5)中的馏分Fr.3E4D经HPLC高效液相色谱法得到4个馏分(Fr.3E4D1～Fr.3E4D4)；。

在步骤8)中，所述HPLC高效液相色谱法可为ODS Rp-18,5μm,250×10mm,100％MeOH,5mL/min。

9)将步骤8)中馏分Fr.3E4D3经HPLC高效液相色谱法制备分离得到化合物1和化合物3。

在步骤9)中，所述HPLC高效液相色谱法可为ODS Rp-18,5μm,250×10mm,95％MeOH/H₂O,5mL/min；所述化合物1的结构式可为：

所述化合物3的结构式可为：

所述多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物在制备抗肿瘤药物中应用，所述抗肿瘤药物可为抗乳腺癌药物、抗***药物等。

所述多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物可作为以核受体RXRα为靶点的抗癌药物的应用。

本发明从挺茎遍地金全草中得到，提取分离方法简易，原料容易获得。该类化合物可以靶向核受体RXRα抑制人乳腺癌细胞株(MCF-7)和***细胞株(HeLa)的增殖。因此，本发明化合物有望开发为以核受体RXRα为靶点的抗肿瘤药物或作为抗肿瘤药物开发的先导化合物。

附图说明

图1为不同浓度化合物1～3与核受体RXRα结合的荧光猝灭实验结果图。在图中1，(a)为化合物1与核受体RXRα结合的荧光猝灭实验结果，(b)为化合物2与核受体RXRα结合的荧光猝灭实验结果，(c)为化合物3与核受体RXRα结合的荧光猝灭实验结果。

图2为不同浓度(0,12.5,25μΜ)化合物1～3的RXRα转录抑制活性结果图。

图3为不同浓度(0,3.125,6.25,12.5,25,50μΜ)化合物1～3抑制MCF-7和HeLa细胞增殖的MTT实验结果(药物作用48h)；在图3中，(a)为化合物1～3抑制MCF-7细胞增殖的MTT实验结果，(b)为化合物1～3抑制HeLa细胞增殖的MTT实验结果。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

本发明所涉及多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物的制备及结构鉴定

1、化合物的制备：

步骤一：将材料挺茎遍地金(12.9kg)全草切碎后用体积分数60％～99％的乙醇-水溶液冷浸提取2～4次，每次12～24h。优选体积分数70％～95％乙醇-水溶液冷浸提取2～3次，每次18～24h。回收浸泡液并减压浓缩得到乙醇粗提物949.68g，并用等体积的石油醚萃取后减压浓缩得到萃取粗提物。

步骤二：将步骤一中石油醚萃取粗提物150.7g通过硅胶柱层析法，环己烷与乙酸乙酯作为流动相(1︰0，50︰1，25︰1，10︰1，5︰1，2︰1，1︰1，0︰1)系统梯度洗脱，并通过薄层色谱TLC以及高效液相色谱分析最终合并为8个馏分(Fr.1～Fr.8)，

步骤三：将步骤二中馏分Fr.3(29.5g)通过硅胶柱层析法，石油醚和乙酸乙酯作为流动相(1︰0，400︰1，200︰1，100︰1，50︰1，25︰1，0︰1)系统梯度洗脱，最终合并为8个馏分(Fr.3A～Fr.3H)。

步骤四：将步骤三中馏分Fr.3E(9.9g)通过硅胶柱层析法，石油醚和丙酮作为流动相(200︰1，150︰1，100︰1，15︰1，0︰1)系统梯度洗脱，最终合为6个馏分(Fr.3E1～Fr.3E6)。

步骤五：将步骤四中馏分Fr.3E4(5.8g)通过硅胶柱层析法，石油醚和丙酮作为流动相(1︰0，1000︰1，500︰1，250︰1，100︰1，15︰1，0︰1)系统梯度洗脱，最终合为5个馏分(Fr.3E4A～Fr.3E4E)。

步骤六：将步骤五中馏分Fr.3E4C(2.8g)通过葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析法，甲醇和二氯甲烷(1︰1)作为流动相洗脱，最后合并为2个馏分(Fr.3E4C1～Fr.3E4C2)。

步骤七：将步骤六中馏分Fr.3E4C1(2.5g)经HPLC高效液相色谱法(ODS Rp-18,5μm,250×10mm,97％MeOH/H₂O,5mL/min)得到化合物2(4.5mg)。

所述化合物2的结构式为：

步骤八：将步骤五中馏分Fr.3E4D(400.1mg)经HPLC高效液相色谱法(ODS Rp-18,5μm,250×10mm,100％MeOH,5mL/min)得到4个馏分(Fr.3E4D1～Fr.3E4D4)。

步骤九：将步骤八中馏分Fr.3E4D3(40.1mg)经HPLC高效液相色谱法(ODS Rp-18,5μm,250×10mm，95％MeOH/H₂O,5mL/min)得到化合物1(4.9mg)和化合物3(8.8mg)。

所述化合物1的结构式为：

所述化合物3的结构式为：

2、化合物的结构鉴定：

化合物1，浅黄色油状；UV(CH₃OH)λmax(logε)202(4.06),216(3.96),228(3.98),234(3.97),244(4.00),244(4.00),300(3.76),326(3.82)nm；HR-ESI-MSm/z 413.2671[M+H]⁺(cacld for C₂₆H₃₇O₄,413.2686).¹H-NMR(CDCl₃-d,600MHz)δ(ppm):6.09(d,J＝3.0Hz,1H,H-15),4.77(m,1H,H-18),3.97(qui,J＝6.6Hz；7.2Hz,1H,H-2’),3.28(s,1H,H-7),2.71(dd,J＝5.4Hz；8.4Hz,1H,H-17a),2.49(dd,J＝4.8Hz；9.0Hz,1H,H-17b),1.98(m,1H,H-13a),1.89(dd,J＝4.8Hz；12.0Hz,1H,H-13b),1.80(m,1H,H-12a),1.25(m,1H,H-12b),1.67(s,3H,H-8),1.59(s,3H,H-21),1.53(s,3H,H-20),1.40(s,3H,H-10),1.26(s,3H,H-11),1.25(s,3H,H-22),1.17(d,J＝6.6Hz,3H,H-4’),1.11(d,J＝6.6Hz,3H,H-3’)；¹³C-NMR(CDCl₃-d,150MHz)δ(ppm):207.2(C-1’),196.4(C-6),190.1(C-2),170.3(C-4),134.9(C-14),133.6(C-19),121.6(C-15),120.3(C-18),107.9(C-3),106.2(C-1),80.0(C-9),53.2(C-5),40.0(C-8),35.7(C-17),35.4(C-2’),30.3(C-7),30.1(C-13),25.9(C-20),25.83(C-10),25.78(C-22),25.1(C-11),23.8(C-16),19.9(C-12),19.4(C-4’),19.0(C-3’),18.3(C-21)。

化合物2,浅黄色油状；UV(CH₃OH)λmax(logε)201(3.95),215(3.82),244(3.88)nm；HR-ESI-MS m/z 427.2846[M+H]⁺(cacld for C₂₇H₃₉O₄,428.2921).¹H-NMR(CDCl₃-d,600MHz)δ(ppm):6.09(s,1H,H-15),4.77(m,1H,H-18),3.83(m,1H,H-2’),3.28(s,1H,H-7),2.70(dd,J＝6.6Hz；7.8Hz,1H,H-17a),2.49(m,1H,H-17b),1.98(m,1H,H-13a),1.90(m,1H,H-13b),1.81(m,1H,H-12a),1.26(m,1H,H-12b),1.80(m,2H,H-4’),1.68(s,3H,H-16),1.59(s,3H,H-21),1.54(s,3H,H-20),1.40(s,3H,H-10),1.26(s,3H,H-11),1.25(s,3H,H-22),1.09(d,J＝6.6Hz,3H,H-3’),0.96(t,J＝7.8Hz,3H,H-5’)；¹³C-NMR(CDCl₃-d,150MHz)δ(ppm):206.8(C-1’),196.5(C-6),190.2(C-2),170.2(C-4),134.8(C-14),133.6(C-19),121.7(C-15),120.2(C-18),107.9(C-3),106.7(C-1),80.0(C-9),53.1(C-5),41.7(C-2’),40.0(C-8),35.9(C-17),30.3(C-7),30.1(C-13),27.0(C-4’),25.9(C-20),25.75(C-10),25.66(C-22),25.2(C-11),23.8(C-16),20.0(C-12),18.3(C-21),16.4(C-3’),12.0(C-5’)。

化合物3，浅黄色油状，[α]²⁰ _D–23.0(c 0.66,CH₃OH)；UV(CH₃OH)λmax(logε)201(4.12),227(4.02),243(4.03),324(3.87)nm；HR-ESI-MS m/z 413.2678[M+H]⁺(cacld forC₂₆H₃₇O₄,413.2686).¹H-NMR(CDCl₃-d,600MHz)δ(ppm):6.09(d,J＝4.8Hz,1H,H-15),4.76(m,1H,H-18),3.28(s,1H,H-7),2.97(m,2H,H-2’),2.71(dd,J＝4.8Hz；9.0Hz,1H,H-17a),2.50(dd,J＝4.8Hz；9.0Hz,1H,H-17b),1.97(m,1H,H-13a),1.90(dd,J＝4.8Hz；12.6Hz,1H,H-13b),1.80(m,1H,H-12a),1.23(m,1H,H-12b),1.67(s,3H,H-16),1.66(m,2H,H-8),1.66(m,1H,C-8),1.60(s,3H,H-21),1.54(s,3H,H-20),1.41(s,3H,H-10),1.27(s,3H,H-11),1.25(s,3H,H-22),1.00(t,J＝7.2Hz,3H,H-4’)；¹³C-NMR(CDCl₃-d,150MHz)δ(ppm):202.8(C-1’),196.6(C-6),189.9(C-2),170.4(C-4),134.9(C-14),133.6(C-19),121.6(C-15),120.2(C-18),107.8(C-3),107.2(C-1),80.0(C-9),53.0(C-5),41.7(C-2’),40.0(C-8),35.8(C-17),30.3(C-7),30.1(C-13),25.84(C-20),25.84(C-10),25.80(C-22),25.1(C-11),23.8(C-16),19.9(C-12),18.9(C-3’),18.3(C-21),14.3(C-4’)。

实施例2：本发明所涉及化合物以核受体RXRα为靶点的抗乳腺癌和***作用

1材料与仪器

1.1实验细胞：人乳腺癌MCF-7和***HeLa细胞

1.2实验仪器

倒置显微镜日本Olympus Leica公司

细胞培养箱美国Thermo公司

Millipore超纯水仪美国Millipore公司

高速冷冻离心机美国beckMan Coulter有限公司

微量移液器美国Eppendorf公司

蛋白垂直电泳仪美国Bio-Rad公司

湿式转移槽美国Bio-Rad公司

一次性培养皿比利时Orange Scientific公司

48孔培养板比利时Orange Scientific公司

96孔培养板比利时Orange Scientific公司

立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂

电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司

酶标仪上海精宏实验设备有限公司

WH-3涡旋仪上海沪西分析仪器有限公司

超净工作台苏州安泰空气技术有限公司

1.3主要试剂

DMEM(High glucose)Hyclone

胎牛血清Hyclone

胰酶消化液Hyclone

Opti-MEM Hyclone

BCA Kit Thermo Scientific

1.4溶液的配置

①RIPA细胞裂解液：

50mMTris-HCl(pH 7.4),150mMNaCl,1mM EDTA,1％Triton,1％脱氧胆酸钠,0.1％SDS,1mM PMSF,5μg/mL Aprotenin,5μg/mL Leupeptasin。

②PBS缓冲溶液：

137mMNaCl,2.7mMKCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,用盐酸调pH至7.4。

③蛋白质电泳相关试剂：

1)1.0M Tris-HCl缓冲液

取Tris 12.12g，滴加盐酸将pH调至6.8，加入去离子水，定容至100mL，再次将pH调至6.8，高温灭菌后室温保存。

2)1.5M Tris-HCl缓冲液

取Tris 18.2g，滴加盐酸将pH调至8.8，加入去离子水，定容至100mL，再次将pH调至8.8，高温灭菌后室温保存。

3)电泳缓冲液

分别取Tris-HCl 3.03g，甘氨酸18.77g，SDS 1g溶于1000mL蒸馏水中。

4)2×SDS loading buffer

dd H₂O 6mL,0.5M Tris pH 6.8 5mL,20％SDS 4mL，溴酚蓝(bromophenol blue)

4mg，50％甘油4mL，β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)1mL

5)1×TBST

10mMTris-HCl(pH 7.5),150mMNaCl,0.1％Tween-20

6)封闭液

5％(W/V)脱脂奶粉溶于1×TBST中。

7)电转液

Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，溶于900mL蒸馏水中，最后加入100mL甲醇溶液，混匀。

8)10％SDS

10g SDS，加蒸馏水至100mL，50℃水浴下溶解，室温保存。

9)10％过硫酸铵(AP)

0.1g过硫酸铵，加超纯水1.0mL，溶解后，4℃保存。

2.化合物1～3与RXRα-LBD的结合实验

视黄酸核受体α(RXRα)是核受体超家族的关键成员。作为配体依赖性转录因子，RXRα可以通过与小分子调节剂相互作用调节广泛的生物学过程，包括细胞分化，增殖和凋亡。RXRα具有核受体的经典功能域，包括DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)。

荧光猝灭实验已广泛应用于蛋白和小分子间相互作用的研究。蛋白中的络氨酸、色氨酸、苯丙氨酸残基可以使蛋白具有荧光吸收，若蛋白与其配体小分子发生相互作用，则会使荧光发生猝灭。图1给出不同浓度化合物1～3与核受体RXRα结合的荧光猝灭实验结果图。

2.1实验过程：

①将RXRα-LBD蛋白用PBS配置成5uM的蛋白溶液，取1mL置于比色皿中，于荧光分光光度计Cary Eclipse Fluorescence spectrophotometer(Varian)中测定荧光吸收曲线。

②将化合物1～3分别用PBS配成5mM的样品溶液，逐步向蛋白溶液中滴加1μL配置好的样品溶液，使样品终浓度分别为5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM，分别测定荧光吸收曲线。应用origin软件拟合其Kd值。

2.化合物1～3对RXRα转录活性评价

2.1实验过程

①细胞的培养：将人胚肾细胞293T复苏并孵育在含有10％胎牛血清DMEM培养基中，37℃，含有5％CO₂培养箱中培养；传代时用PBS清洗细胞2次，并用胰酶消化2min；传代至细胞状态良好。

②转染：取对数生长期的细胞，于转染前一h更换新鲜含血清DMEM培养基4ml；配置转染溶液，A₁管：pGL3-Promoter-RXRE+RXRα+p-Relina；B₁管：脂质体+Opti-MEM；A₂管：pBind-RXRα-LBD+pG5luc+Opti-MEM；B₂管：脂质体+Opti-MEM。A管和B管分别用振荡器混匀后，室温下静置5min，然后将A管和B管对应转移至同一管中，震荡混匀，室温下静置20min-30min。将混合液分别加入到293T细胞的培养皿中，10％胎牛血清DMEM培养基中，37℃，含有5％CO₂培养箱中培养。

③铺板：转染14h后，弃去培养液，用PBS洗2次，加入2ml胰酶消化液，消解细胞2min后，用含有血清的DMEM培养基终止胰酶的消解反应，用移液枪反复吹打细胞，使其脱壁，制成均匀的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，放入37℃，含有5％CO₂培养箱中培养。

④加药：铺板后6～8h后，显微镜下观察细胞是否己经贴壁。加入不同浓度的化合物，设置单独加药孔和联合9-cis-RA加药孔，药物持续作用12h。

⑤双荧光素酶报告基因检测分析：细胞裂解：除去培养细胞中的培养基；用1×PBS清洗培养细胞，去除清洗液；每孔加入1×PLB 50μL；在室温轻缓晃动培养板30min，取20μL裂解液置于避光的检测试管中待测。使用荧光免疫分析仪检测：加入20μL的LARⅡ溶液，混合均匀后，检测萤火虫荧光素酶的活性；再向检测管中加入20μLStop&Reagent，混合均勾，检测海肾荧光素酶活性。

荧光强度值(％)＝OD萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶×100％

2.2实验结果

化合物1～3分别在12.5μΜ和25μΜ浓度下都表现出明显的RXRα转录抑制活性，其中在同等浓度下化合物3的抑制活性强于化合物1和2。图2给出不同浓度(0,12.5,25μΜ)化合物1～3的RXRα转录抑制活性结果图。

3、化合物1～3抑制MCF-7和HeLa癌细胞增殖

外源性MTT可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶——甲瓒(Formazan)并在细胞中沉积，而死细胞则无此功能。利用酶联免疫检测仪在490nm波长处检测其吸光度值，可间接反映活细胞数量。

3.1实验方法

①实验细胞：MCF-7(人乳腺癌细胞)HeLa(人***细胞)

②实验操作：

1)收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，制成细胞浓度为10⁵个/mL的细胞悬液，按照10⁴个/孔的细胞量接种于96孔板中，每孔100μL，(边缘孔用无菌PBS填充，每孔100μL培养基)，然后放于37℃含5％CO₂培养箱中培养。

2)待确认细胞贴壁后弃去培养基，加入含药培养基，每孔100μL,设3个复孔。在37℃含5％CO₂培养箱中孵育48h。

3)倒置显微镜下观察细胞状态，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。

4)小心弃去孔内溶液。每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪492nm波长处测量各孔的吸光值。实验设置空白组(培养基、MTT、二甲基亚砜)和对照组(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。肿瘤细胞生长率计算公式如下：

生长率(Growth rate,RT,％)＝[(OD_sample-OD_blank)/(OD_DMSO-OD_blank)]×100％

3.2实验结果

MTT比色法的实验结果显示，化合物1～3具有明显的MCF-7和HeLa细胞的生长抑制作用，且呈浓度依赖性，其中化合物3具有对MCF-7和HeLa细胞生长抑制作用最强，其IC₅₀值分别为26.33和24.39μΜ。化合物1对MCF-7和HeLa细胞生长抑制活性IC₅₀值分别为44.37和37.80μΜ；化合物2对MCF-7和HeLa细胞生长抑制活性IC₅₀值分别为61.66和51.44μΜ(图3)。提示化合物1～3通过抑制MCF-7和HeLa细胞增殖而分别表现出抗乳腺癌和***活性，其中化合物3有更强的抗乳腺癌和***活性。