具体实施方式

虽然涵盖总体本发明概念的实施方案可以采取各种形式，但是在本文中将描述各个实施方案，其中应理解的是，本公开应仅被认为是示例性的，并且总体本发明概念不旨在限于所公开的实施方案。

在本发明的一些实施方案中，公开了本发明化合物(例如，式(I)、(IA)、(II)和(III)以及尿石素衍生物)。其它实施方案包含包括本发明化合物的组合物(例如，药物组合物)。本发明的仍其它实施方案包含用于使用本发明化合物治疗例如某些疾病的组合物(例如，药物组合物)。一些实施方案包含使用本发明化合物(例如，在组合物中或在药物组合物中)进行施用和治疗(例如，疾病)的方法。另外的实施方案包含用于制备本发明化合物的方法。本文还讨论了本发明的另外的实施方案。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“烷基”意指单价直链或支链烃链(例如，C₁-C₂₄)。例如，术语“C₁-C₇烷基”或“C₁-C₄烷基”分别是指具有1到7个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个)或1到4个(例如，1个、2个、3个或4个)碳原子的直链或支链饱和烃基。C₁-C₇烷基的实例包含但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、正己基和正庚基。C₁-C₄烷基的实例包含但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“烯基”意指包含一个或多个(例如，1个、2个、3个或4个)双键的单价直链或支链的烃链(例如，C₂-C₂₄)。烯基的实例包含但不限于乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基和5-己烯基。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“烷氧基”意指上述烷基中通过氧原子与分子的其余部分连接的任何烷基(烷基-O-)(例如，C₁-C₂₃)。烷氧基的实例包含但不限于甲氧基(有时示出为MeO-)、乙氧基、异丙氧基、丙氧基和丁氧基。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“炔基”意指单价直链或支链烃链(例如，C₂-C₂₄)，其在链中包含一个或多个(例如，1个、2个、3个或4个)三键并且还可以任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个或4个)双键。炔基的实例包含但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基和5-己炔基。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“芳基”意指当未经取代时单价单环或双环5、6、7、8、9、10、11或12元芳香族烃基。芳基的实例包含但不限于苯基、萘基、甲苯基和二甲苯基。对于指定为经取代的双环芳基，一个或两个环可以被取代。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“环烷基”是指单价单环或双环3、4、5、6、7、8、9、10、11或12元烃基。环可以是饱和的或部分不饱和的。环烷基的实例包含但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基和双环烷基(例如，双环辛烷(如[2.2.2]双环辛烷或[3.3.0]双环辛烷、双环壬烷(如[4.3.0]双环壬烷)和双环癸烷(如[4.4.0]双环癸烷(十氢化萘))或螺环化合物)和金刚烷。对于单环环烷基，环不是芳香族的。对于双环环烷基，如果一个环是芳香族的，则另一个环不是芳香族的。对于指定为经取代的双环环烷基，一个或两个环可以被取代。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“卤素”意指单价Cl、F、Br或I。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“杂芳基”意指单价单环或双环5、6、7、8、9、10、11或12元烃基，其中1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子被独立地选自氮、氧或硫原子的杂原子替代，并且单环或双环体系是芳香族的。杂芳基的实例包含但不限于噻吩基(或苯硫基)、呋喃基、吲哚基、吡咯基、吡啶基、吡嗪基、噁唑基、噻唑基、喹啉基、嘧啶基、咪唑基、三唑基、四唑基、1H-吡唑-4-基、1-Me-吡唑-4-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、3,5-二甲基异噁唑基、1H-吡咯-3-基、3,5-二-Me-吡唑基和1H-吡唑-4-基。对于双环杂芳基，如果一个环为芳基，则另一个环为杂芳基。对于双环杂芳基，一个或两个环可以具有一个或多个杂原子。对于指定为经取代的双环杂芳基，一个或两个环可以被取代。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“杂环基”意指单价单环或双环5、6、7、8、9、10、11或12元烃，其中1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子被独立地选自氮原子、氧原子或硫原子的杂原子替代，并且单环或双环体系不是芳香族的。杂环基的实例包含但不限于四氢吡喃、吡咯烷基(例如，吡咯烷-1-基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基或吡咯烷-4-基)、哌嗪基(例如，哌嗪-1-基、哌嗪-2-基、哌嗪-3-基或哌嗪-4-基)、哌啶基(例如，哌啶-1-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基或哌啶-4-基)和吗啉基(例如，吗啉-1-基、吗啉-2-基、吗啉-3-基或吗啉-4-基)。对于双环杂环基，如果一个环是芳香族的(例如，单环芳基或杂芳基)，则另一个环不是芳香族的。对于双环杂环基，一个或两个环可以具有一个或多个杂原子。对于指定为经取代的双环杂环基，一个或两个环可以被取代。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“杂原子”意指选自氮原子、氧原子或硫原子的原子。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”指示存在单价-OH基团。

如本文所使用的(除非另有说明)，术语“经取代的”(例如，如在经取代的烷基中)意味着化学基团(具有一个或多个氢原子)的一个或多个氢原子可以被选自指定选项的一个或多个非氢取代基替代。替代可以在一个或多个位置处发生。术语“任选地经取代的”意味着化学基团(具有一个或多个氢原子)的一个或多个氢原子可以但不必被取代。

本发明的一些化合物可以具有一个或多个手性中心，并且对于所述一个或多个手性中心中的任何手性中心，可以以光学活性形式和外消旋形式存在和分离。一些化合物可以表现出多态性。本发明的化合物(例如，式I)涵盖任何光学活性形式、外消旋体形式、立体异构体形式、多态性或其混合。如果手性中心未提供其在化学结构中的构型(即，R或S)的指示，则应认为其表示R、S或外消旋体。

一些化合物实施方案

本发明的一些实施方案包含式(I)、(II)或(III)的化合物：

在其它实施方案中，X₁与X₂之间的键是单键或双键。在某些实施方案中，X₇与X₈之间的键是单键或双键。在又其它实施方案中，X₁、X₂、X₇和X₈可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH、CH₂、O、S、C-NH₂、C-N＝CH₂、C(H)(NH₂)、C＝O、C＝N-NH₂、C＝NH、C＝N-环烷基(例如，C＝N-金刚烷)、C＝N-S(O)H、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)、N、NH、C-卤素、C(H)(卤素)、C-(卤素)₂、C-环烷基、C-杂环基、C-芳基、C-杂芳基、C(H)(环烷基)、C(H)(杂环基)、C(H)(芳基)或C(H)(杂芳基)，所述CH、CH₂、C-NH₂、C-N＝CH₂、C(H)(NH₂)、C＝N-NH₂、C＝NH、C＝N-环烷基、C＝N-S(O)H、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)、NH、C(H)(卤素)、C-环烷基、C-杂环基、C-芳基、C-杂芳基、C(H)(环烷基)、C(H)(杂环基)、C(H)(芳基)或C(H)(杂芳基)可以任选地被卤素(例如，F、Cl、Br或I)、羟基(-OH)、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、磺基(-SO₃H)、甲基、乙基、全氟甲基或全氟乙基中的一个或多个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个或6个)取代。在某些实施方案中，X₁和X₂可以任选地进一步环化以形成5或6元环烷基、5或6元杂环基、5或6元芳基或5或6元杂芳基，所述5或6元环烷基、5或6元杂环基、5或6元芳基或5或6元杂芳基可以任选地被卤素(例如，F、Cl、Br或I)、羟基(-OH)、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、磺基(-SO₃H)、甲基、乙基、全氟甲基或全氟乙基中的一个或多个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个或6个)取代。在某些实施方案中，X₇和X₈可以任选地进一步环化以形成5或6元环烷基、5或6元杂环基、5或6元芳基或5或6元杂芳基，所述5或6元环烷基、5或6元杂环基、5或6元芳基或5或6元杂芳基可以任选地被卤素(例如，F、Cl、Br或I)、羟基(-OH)、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、磺基(-SO₃H)、甲基、乙基、全氟甲基或全氟乙基中的一个或多个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个或6个)取代。当然，X₁和X₂的选择将取决于X₁与X₂之间是单键还是双键；X₇和X₈的选择将取决于X₇与X₈之间是单键还是双键。

在一些实施方案中，X₁、X₂、X₇和X₈可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH₂、O、C-NH₂、C-N＝CH₂、C(H)(NH₂)、C＝O、C＝N-NH₂、C＝NH、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)、C＝N-S(O)H、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)、C-卤素、C(H)(卤素)、C-(卤素)₂、C-环烷基或C(H)(环烷基)，所述CH₂、C-NH₂、C-N＝CH₂、C(H)(NH₂)、C＝N-NH₂、C＝NH、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)、C＝N-S(O)H、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)、C(H)(卤素)、C-环烷基或C(H)(环烷基)可以任选地被卤素(例如，F、Cl、Br或I)、羟基(-OH)、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、磺基(-SO₃H)、甲基、乙基、全氟甲基或全氟乙基中的一个或多个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个或6个)取代。在一些实施方案中，X₁和X₂可以进一步环化以形成吡嗪基、1,2,5-噻二唑1-氧化物或2H-咪唑-2-酮。在一些实施方案中，X₇和X₈可以进一步环化以形成吡嗪基、1,2,5-噻二唑1-氧化物、2H-咪唑-2-酮。

在其它实施方案中，X₁、X₂、X₇和X₈可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH₂、O、C(H)(NH₂)、C＝O、C＝N-NH₂、C＝NH、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)或C(H)(环烷基)。在仍其它实施方案中，X₁、X₂、X₇和X₈可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH₂、O、C＝O、C＝NH、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)或C(H)(环烷基)。在仍其它实施方案中，X₁、X₂、X₇和X₈可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH₂、O、C＝O、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)或C＝NEtOH。

在一些实施方案中，X₁、X₂、X₇和X₈可以相同。在一些实施方案中，X₁和X₂可以相同。在一些实施方案中，X₁和X₂可以不同。在一些实施方案中，X₇和X₈可以相同。在一些实施方案中，X₇和X₈可以不同。在一些实施方案中，X₁和X₇可以相同。在一些实施方案中，X₁和X₇可以不同。在一些实施方案中，X₂和X₈可以相同。在一些实施方案中，X₂和X₈可以不同。

在一些实施方案中，X₃、X₄、X₅和X₆可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH或N，所述CH可以任选地被卤素(例如，F、Cl、Br或I)、羟基(-OH)、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、磺基(-SO₃H)、甲基、乙基、全氟甲基或全氟乙基中的一个或多个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个或6个)取代。在一些实施方案中，X₃、X₄、X₅和X₆可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH或N。在一些实施方案中，X₃、X₄、X₅和X₆各自可以是CH。

在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅可以相同或不同并且各自可以独立地选自H、OH、卤素(例如，F、Cl、Br或I)、甲酰基(-COH)、-OCF₃、-COCH₃、羰基、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、胺、-NO₂、磺基(-SO₃H)、C₁-C₄烷基(例如，C₁、C₂、C₃或C₄烷基)、C₂-C₄烯基(例如，C₂、C₃或C₄烯基)、C₂-C₄炔基(例如，C₂、C₃或C₄炔基)、C₁-C₃烷氧基(例如，C₁、C₂或C₃烷氧基)、甲基、乙基、全氟甲基、全氟乙基、环烷基(例如，双环烷基)或杂环基(例如，咪唑基)，所述H、OH、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羰基、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、磺基(-SO₃H)、C₁-C₄烷基(例如，C₁、C₂、C₃或C₄烷基)、C₂-C₄烯基(例如，C₂、C₃或C₄烯基)、C₂-C₄炔基(例如，C₂、C₃或C₄炔基)、C₁-C₃烷氧基(例如，C₁、C₂或C₃烷氧基)、甲基、乙基、环烷基或杂环基(例如，咪唑基)可以任选地被卤素(例如，F、Cl、Br或I)、羟基(-OH)、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、磺基(-SO₃H)、甲基、乙基、全氟甲基或全氟乙基中的一个或多个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个或6个)取代。在某些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅可以相同或不同并且各自可以独立地选自H、OH、卤素(例如，F、Cl、Br或I)、甲酰基(-COH)、-OCF₃、-COCH₃、羰基、羧基(-CO₂H)、氰基(-CN)、胺、-NO₂、甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、全氟甲基、全氟乙基、环烷基(例如，双环烷基)或杂环基(例如，咪唑基)。

在其它实施方案中，一种化合物选自式(IA)：

在一些实施方案中，X₁、X₂、R₁和R₂的定义和上文针对式(I)进行的定义一样。在其它实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，X₁和X₂相同。在又其它实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，X₁和X₂不同。在其它实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，R₁和R₂相同。在又其它实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，R₁和R₂不同。在一些实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，X₁和X₂可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH₂、O、C(H)(NH₂)、C＝O、C＝N-NH₂、C＝NH、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)或C(H)(环烷基)，所述CH₂、C(H)(NH₂)、C＝N-NH₂、C＝NH、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)或C(H)(环烷基)可以任选地被卤素(例如，F、Cl、Br或I)、羟基(-OH)、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、磺基(-SO₃H)、甲基、乙基、全氟甲基或全氟乙基中的一个或多个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个或6个)取代。在其它实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，X₁和X₂可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH₂、O、C(H)(NH₂)、C＝O、C＝N-NH₂、C＝NH、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)或C(H)(环烷基)。在仍其它实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，X₁和X₂可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH₂、O、C＝O、C＝NH、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)、C＝NC(EtOH)₃、C＝NCH(EtOH)₂、C＝NEtOH、C(CH₃)(OH)或C(H)(环烷基)。在仍其它实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，X₁和X₂可以相同或不同并且各自可以独立地选自CH₂、O、C＝O、C＝N-环烷基(例如，金刚烷)或C＝NEtOH。

在一些实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，R₁和R₂可以相同或不同并且各自可以独立地选自H、OH、卤素(例如，F、Cl、Br或I)、甲酰基(-COH)、-OCF₃、-COCH₃、羰基、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、胺、-NO₂、磺基(-SO₃H)、C₁-C₄烷基(例如，C₁、C₂、C₃或C₄烷基)、C₂-C₄烯基(例如，C₂、C₃或C₄烯基)、C₂-C₄炔基(例如，C₂、C₃或C₄炔基)、C₁-C₃烷氧基(例如，C₁、C₂或C₃烷氧基)、甲基、乙基、全氟甲基、全氟乙基，所述H、OH、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羰基、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、磺基(-SO₃H)、C₁-C₄烷基(例如，C₁、C₂、C₃或C₄烷基)、C₂-C₄烯基(例如，C₂、C₃或C₄烯基)、C₂-C₄炔基(例如，C₂、C₃或C₄炔基)、C₁-C₃烷氧基(例如，C₁、C₂或C₃烷氧基)、甲基或乙基可以任选地被卤素(例如，F、Cl、Br或I)、羟基(-OH)、甲酰基(-COH)、-COCH₃、羧基(-CO₂H)、乙炔基(-CCH)、氰基(-CN)、磺基(-SO₃H)、甲基、乙基、全氟甲基或全氟乙基中的一个或多个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个或6个)取代。在某些实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，R₁和R₂可以相同或不同并且各自可以独立地选自H、OH、卤素(例如，F、Cl、Br或I)、甲酰基(-COH)、-OCF₃、-COCH₃、羰基、羧基(-CO₂H)、氰基(-CN)、胺、-NO₂、甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、全氟甲基或全氟乙基。在某些实施方案中(例如，在式(I)、(II)、(III)或(IA)中)，R₁和R₂可以相同或不同并且各自可以独立地选自H、OH或甲氧基。

在一些实施方案中，式(I)、(IA)、(II)或(III)的化合物可以选自表1中指定的化合物。所述表包含具有前导零的化合物编号(例如，I-001或I-015)。这些化合物编号有时被标识为没有前导零；在有或没有前导零的情况下，化合物是相同的(例如，化合物I-001与化合物I-1相同；化合物I-015与化合物I-15相同)。

表1

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-3、I-5、I-7、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-57、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121或II-122中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-3、I-5、I-7、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-57、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121和II-122。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-7、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-57、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121或II-122中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-7、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-57、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121和II-122。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121或II-122中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121和II-122。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121或II-122中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121和II-122。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-7、I-20、I-56、I-57、I-59或I-94中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-7、I-20、I-56、I-57、I-59和I-94。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-20、I-56、I-59或I-94中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-20、I-56、I-59和I-94。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3或I-5中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3和I-5。

在某些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1。在某些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-2。

在一些实施方案中，本发明的化合物包括I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-6、I-7、I-8、I-9、I-10、I-11、I-12、I-13、I-14、I-15、I-16或I-17。在一些实施方案中，本发明的化合物包括I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-15、I-16或I-17。

在一些实施方案中，尿石素衍生物涵盖式(I)、式(IA)、(II)或(III)中的一个或多个。在其它实施方案中，式(I)、式(IA)、(II)或(III)或其组合的化合物涵盖尿石素衍生物。在一些实施方案中，尿石素衍生物不涵盖式(I)、式(IA)、(II)或(III)中的一个或多个。在其它实施方案中，式(I)、式(IA)、(II)或(III)或其组合的化合物不涵盖尿石素衍生物。

在一些实施方案中，式(I)、式(IA)、(II)或(III)的化合物可以呈盐、光学和几何异构体以及异构体的盐的形式。在其它实施方案中，化合物可以呈各种形式，如不带电的分子、分子复合物的组分或无刺激性的药理学上可接受的盐，包含但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硼酸盐、乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和水杨酸盐。在一些情况下，对于酸性化合物，盐可以包含金属、胺或有机阳离子(例如，季铵盐)。在又其它实施方案中，可以采用具有期望的保留和释放特性但是容易被人体pH、酶或通过其它合适的方式水解的化合物(例如，醚、酯或酰胺)的简单衍生物。

在一些实施方案中，本发明的化合物具有手性中心并且可以以光学活性形式和外消旋形式存在和分离。在其它实施方案中，化合物可以表现出多态性。本发明的一些实施方案涵盖本文所描述的化合物的任何外消旋形式、光学活性形式、多态形式或立体异构形式或其混合。光学活性形式的制备可以通过任何合适的方法来完成，包含但不限于通过重结晶技术来拆分外消旋形式、由光学活性起始材料进行合成、手性合成或使用手性固定相进行色谱分离。

在一些实施方案中，本发明的化合物(例如式(I)、(IA)、I-1或I-2)可以具有以下作用：(a)抑制单氨基氧化酶(MAO)酶活性；(b)诱导紧密连接蛋白(例如，闭合蛋白家族蛋白(Cldn 1-27)、咬合蛋白、闭锁小带(例如，ZO-1、ZO-2)、紧密连接蛋白(TJP)、连接相关粘附分子(JAM)或黏着小带(adherens junction)蛋白(如血管内皮钙粘蛋白(VE-钙粘蛋白))的表达；(c)诱导AhR的核易位和/或激活，包括(d)诱导Nrf2的核易位和/或激活；(e)诱导Cyp1A1和/或Cyp1A2的表达；或(f)增加细胞(例如，胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞)的自噬(例如，线粒体吞噬)；或(g)其组合。

化合物的其它实施方案-尿石素衍生物

“尿石素”总体上可以描述为包括呈稠合的三环体系的两个芳香族环和含有酯的非芳香族桥连环(即，尿石素的桥连环是“环状酯”)。

如本文所使用的，术语“尿石素衍生物”是指这样的化合物：所述化合物具有衍生自尿石素结构的结构，并且所述化合物的结构与尿石素的结构足够类似，并且基于所述相似性，本领域技术人员将预期所述化合物表现出与尿石素的活性和效用相同或类似的活性和效用或作为前体诱导与尿石素的活性和效用相同或类似的活性和效用的化合物。根据某些实施方案，尿石素衍生物可以具有尿石素环状酯的化学基团取代。在一些实施方案中，与尿石素A相比，尿石素衍生物可以具有改善的效力，或者与尿石素A相比，在酸性pH下和/或在存在酯酶和/或蛋白酶的情况下可以具有提高的稳定性(参见图1A)。尿石素A的结构在本文中示出为PKL-01(表1)。

在各个实施方案中，尿石素衍生物具有代替尿石素环状酯的环状醚。在一些实施方案中，环状醚基团包括一个或多个取代基，如(但不限于)独立地选自卤基、胺、经取代的(例如，被甲基、乙基或其组合取代的)胺、羟基和C5或C6杂环(例如，杂环基或杂芳基)(如具有一个或两个独立地选自O、N或S的杂原子的杂环)的取代基。在一些实施方案中，尿石素衍生物具有代替尿石素环状酯的具有相邻羰基的碳环(例如，环烷基或芳基)。在一些实施方案中，尿石素衍生物具有代替尿石素环状酯的碳环基团(例如，环烷基或芳基)，所述碳环基团任选地具有一个或多个双键并且任选地是芳香族的并且是任选地经取代的(例如，被本文所公开的任何取代基取代)。在一些实施方案中，碳环基团(例如，环烷基或芳基)具有一个或多个取代基(例如，具有本文所公开的任何取代基)。示例性取代基包含独立地选自酮、任选地经取代的亚胺、任选地经取代的(例如，被甲基、乙基或其组合取代的)胺、卤基和羟基的取代基。在一些实施方案中，尿石素衍生物具有代替尿石素环状酯的环状酰胺。在一些实施方案中，尿石素衍生物具有代替环状酯桥的非环状桥。在这些实施方案中，酯基团可以被羧酸和羟基官能团(在非环状结构中)替代。在其它实施方案中，芳香族基团(例如，芳基或杂芳基)(位于桥连环或基团侧翼)可以具有一个或多个取代基。在一些实施方案中，芳香族基团(例如，芳基或杂芳基)是任选地经取代的(例如，被本文所公开的任何取代基取代的)苯基。芳香族基团的示例性取代基独立地选自羟基、烷氧基、卤基、胺、5或6元碳环(例如，环烷基或芳基)或杂环(例如，杂环基或杂芳基)、硝基、腈、烷基、烷基醚和卤代烷基。在一些实施方案中，芳香族环中的至少一个芳香族环是杂环(例如，杂环基或杂芳基)。杂环(例如，杂环基或杂芳基)的杂原子可以独立地选自N、O和S。在一些实施方案中，每个芳香族环的取代基可以一起形成第二桥连环，所述第二桥连环任选地与第一桥连环具有相同或不同的结构。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-3、I-5、I-7、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-57、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121或II-122中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-3、I-5、I-7、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-57、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121和II-122。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-7、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-57、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121或II-122中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-7、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-57、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121和II-122。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121或II-122中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-56、I-59、I-94、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121和II-122。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121或II-122中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-20、I-26、I-27、I-28、I-33、I-53、I-54、I-55、I-98、II-99、II-100、II-101、II-102、II-103、II-118、II-119、II-120、II-121和II-122。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-7、I-20、I-56、I-57、I-59或I-94中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-7、I-20、I-56、I-57、I-59和I-94。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-20、I-56、I-59或I-94中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3、I-5、I-20、I-56、I-59和I-94。

在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3或I-5中的一种或多种化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1、I-2、I-3和I-5。

在某些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-1。在某些实施方案中，本发明的化合物不包含化合物I-2。

在一些实施方案中，本发明的化合物包括I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-6、I-7、I-8、I-9、I-10、I-11、I-12、I-13、I-14、I-15、I-16或I-17。在一些实施方案中，本发明的化合物包括I-1、I-2、I-3、I-4、I-5、I-15、I-16或I-17。

在一些实施方案中，尿石素衍生物涵盖式(I)、式(IA)、(II)或(III)中的一个或多个。在其它实施方案中，式(I)、式(IA)、(II)或(III)或其组合的化合物涵盖尿石素衍生物。在一些实施方案中，尿石素衍生物不涵盖式(I)、式(IA)、(II)或(III)中的一个或多个。在其它实施方案中，式(I)、式(IA)、(II)或(III)或其组合的化合物不涵盖尿石素衍生物。

在一些实施方案中，式(I)、式(IA)、(II)或(III)的化合物或尿石素衍生物可以呈盐、光学和几何异构体以及异构体的盐的形式。在其它实施方案中，化合物可以呈各种形式，如不带电的分子、分子复合物的组分或无刺激性的药理学上可接受的盐，包含但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硼酸盐、乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和水杨酸盐。在一些情况下，对于酸性化合物，盐可以包含金属、胺或有机阳离子(例如，季铵盐)。在又其它实施方案中，可以采用具有期望的保留和释放特性但是容易被人体pH、酶或通过其它合适的方式水解的化合物(例如，醚、酯或酰胺)的简单衍生物。

在一些实施方案中，本发明的化合物具有手性中心并且可以以光学活性形式和外消旋形式存在和分离。在其它实施方案中，化合物可以表现出多态性。本发明的一些实施方案涵盖本文所描述的化合物的任何外消旋形式、光学活性形式、多态形式或立体异构形式或其混合。光学活性形式的制备可以通过任何合适的方法来完成，包含但不限于通过重结晶技术来拆分外消旋形式、由光学活性起始材料进行合成、手性合成或使用手性固定相进行色谱分离。

在一些实施方案中，本发明的化合物(例如式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)可以具有以下作用：(a)抑制单氨基氧化酶(MAO)酶活性；(b)诱导紧密连接蛋白(例如，闭合蛋白家族蛋白(Cldn 1-27)、咬合蛋白、闭锁小带(例如，ZO-1、ZO-2)、紧密连接蛋白(TJP)、连接相关粘附分子(JAM)或黏着小带蛋白(如血管内皮钙粘蛋白(VE-钙粘蛋白))的表达；(c)诱导AhR的核易位和/或激活，包括(d)诱导Nrf2的核易位和/或激活；(e)诱导Cyp1A1和/或Cyp1A2的表达；或(f)增加细胞(例如，胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞)的自噬(例如，线粒体吞噬)；或(g)其组合。

包含药物组合物的组合物

在某些实施方案中，本发明的一种或多种化合物(例如，式(I)或尿石素衍生物)可以是组合物的一部分并且可以以以下量(按组合物的总重量计)存在：至少约0.0001％、至少约0.001％、至少约0.10％、至少约0.15％、至少约0.20％、至少约0.25％、至少约0.50％、至少约0.75％、至少约1％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约99.99％、不超过约75％、不超过约90％、不超过约95％、不超过约99％或不超过约99.99％、约0.0001％到约99％、约0.0001％到约50％、约0.01％到约95％、约1％到约95％、约10％到约90％或约25％到约75％。

在一些实施方案中，可以以以下量(按组合物的总重量计)纯化或分离本发明的一种或多种化合物(例如，式(I)或尿石素衍生物)：至少约0.0001％、至少约0.001％、至少约0.10％、至少约0.15％、至少约0.20％、至少约0.25％、至少约0.50％、至少约0.75％、至少约1％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约99.99％、不超过约75％、不超过约90％、不超过约95％、不超过约99％、不超过约99.99％、约0.0001％到约99％、约0.0001％到约50％、约0.01％到约95％、约1％到约95％、约10％到约90％或约25％到约75％。

本发明的一些实施方案包含包括本发明的一种或多种化合物(例如，式(I)或尿石素衍生物)的组合物。在某些实施方案中，组合物是药物组合物，如适于施用于动物(例如，哺乳动物、灵长类动物、猴子、人、犬、猫、猪、小鼠、兔子或大鼠)的组合物。在一些情况下，药物组合物是无毒的，不会引起副作用，或两者兼而有之。在一些实施方案中，可能存在固有的副作用(例如，其可能伤害患者或在一些患者中可能具有某种程度的毒性或有害性)。

“治疗有效量”意指有效达到期望和/或有益效果的量。可以以一次或多次施用来施用有效量。为了本发明的一些目的，治疗有效量是适于治疗适应症的量。治疗适应症意指达到任何期望的效果，如减轻、改善、稳定、逆转、减缓或延迟疾病进展、提高生活质量或延长寿命中的一种或多种。可以通过任何合适的方法来测量这种实现，如测量肿瘤大小。

在一些实施方案中，本发明的一种或多种化合物(例如，式(I)或尿石素衍生物)可以是药物组合物的一部分并且可以以以下量存在：至少约0.0001％、至少约0.001％、至少约0.10％、至少约0.15％、至少约0.20％、至少约0.25％、至少约0.50％、至少约0.75％、至少约1％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约99.99％、不超过约75％、不超过约90％、不超过约95％、不超过约99％、不超过约99.99％、约0.001％到约99％、约0.001％到约50％、约0.1％到约99％、约1％到约95％、约10％到约90％或约25％到约75％。在一些实施方案中，药物组合物可以以适于局部、皮下、鞘内、腹膜内、口服、肠胃外、直肠、皮肤、鼻、阴道或眼施用途径的剂型存在。在其它实施方案中，药物组合物可以以适于肠胃外施用、粘膜施用、静脉内施用、皮下施用、局部施用、皮内施用、口服施用、舌下施用、鼻内施用或肌内施用的剂型存在。药物组合物可以呈例如片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒剂、悬浮液、乳剂、溶液、凝胶(包含水凝胶)、糊剂、软膏、乳膏、膏药、灌服药、递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂、气雾剂形式或其它合适形式。

在一些实施方案中，药物组合物可以包含一种或多种配方成分。“配方成分”可以是任何合适的成分(例如，适于一种或多种药物、适于一种或多种药物的剂量、适于一种或多种药物的释放定时、适于疾病、适于疾病状态或适于递送途径)，包含但不限于水(例如，开水、蒸馏水、过滤水、无热原水或含氯仿的水)、糖(例如，蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇或由其制得的糖浆剂)、乙醇、甘油、二醇(例如，丙二醇)、丙酮、醚、DMSO、表面活性剂(例如，阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯))、油(例如，动物油、植物油(例如，椰子油或花生油)或矿物油)、油衍生物(例如，油酸乙酯、单硬脂酸甘油酯或氢化甘油酯)、赋形剂、防腐剂(例如，半胱氨酸、甲硫氨酸、抗氧化剂(例如，维生素(例如，A、E或C)、硒、棕榈酸视黄酯、柠檬酸钠、柠檬酸、氯仿或对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)或其组合。

在某些实施方案中，药物组合物可以调配成在施用时基本上立即或在施用后的任何基本上预定时间或任何时间释放活性成分(例如，本发明的一种或多种化合物，如式(I))。这种调配物可以包含例如控释调配物(如各种控释组合物)和包衣。

在某些实施方案中，其它调配物(例如，药物组合物的调配物)可以包含将药物(或控释调配物)掺入食物、食物原料、饲料或饮料中的调配物。

本发明的其它实施方案可以包含施用方法或治疗生物体的方法，所述方法可以涉及用有效治疗生物体患有或疑似患有或易患的疾病、病状或病症或产生期望的生理作用的量的本发明的至少一种化合物(例如，式(I)或尿石素衍生物)进行治疗。在一些实施方案中，组合物或药物组合物包括本发明的至少一种化合物(例如，式(I)或尿石素衍生物)，所述至少一种化合物可以以以下量施用于动物(例如，哺乳动物、灵长类动物、猴子或人)：约0.005到约50mg/kg体重、约0.01到约15mg/kg体重、约0.1到约10mg/kg体重、约0.5到约7mg/kg体重、约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg或约15mg/kg。关于一些病状，剂量可以是约0.5mg/kg人体重或约6.5mg/kg人体重。在一些情况下，可以向一些动物(例如，哺乳动物、小鼠、兔子、猫、猪或犬)施用以下剂量：约0.005到约50mg/kg体重、约0.01到约15mg/kg体重、约0.1到约10mg/kg体重、约0.5到约7mg/kg体重、约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约80mg/kg、约100mg/kg或约150mg/kg。当然，本领域的技术人员应理解，可以在本发明的方法中采用许多浓度，并且部分地使用本文所提供的指导将能够调节和测试任何数量的浓度，以找到在给定情况下达到期望结果的浓度。在其它实施方案中，对于给定疾病、病状或病症，本发明的化合物(例如，式(I)或尿石素衍生物)可以与一种或多种其它治疗剂组合施用。

在一些实施方案中，组合物可以包含单位剂量的本发明的一种或多种化合物(例如，式(I)或尿石素衍生物)与药学上可接受的载体的组合，并且另外可以包含其它药用剂、药剂、载体、佐剂、稀释剂和赋形剂。在某些实施方案中，载体、媒剂或赋形剂可以有助于组合物的施用、递送和/或改善保存。在其它实施方案中，所述一种或多种载体包含但不限于如生理盐水等盐溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)、PBS(磷酸盐缓冲盐水)以及通常具有或不具有如葡萄糖等糖添加剂的各种盐(包含钾盐和磷酸盐)的混合物。载体可以包含：水性和非水性无菌注射溶液，所述注射溶液可以含有使调配物与预期接受者的体液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、杀菌抗生素和溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，所述悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。在其它实施方案中，所述一种或多种赋形剂可以包含但不限于水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等和其组合。如润湿剂、缓冲液或乳化剂等无毒辅助物质也可以添加到组合物。口服调配物可以包含通常采用的赋形剂，如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。

在某些实施方案中，组合物或药物组合物进一步包括本文所公开的量或剂量中的任何量或剂量的5-氟尿嘧啶(例如，用于癌症治疗或化学抗性癌症治疗)。

施用途径、疾病治疗以及其它用途

本发明的化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)可以通过任何数量的合适的施用途径或调配物施用于动物。本发明的化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)还可以用于治疗动物的各种疾病。动物包含但不限于哺乳动物、灵长类动物、猴子(例如，猕猴、恒河猴或猪尾猕猴)、人、犬、猫、牛、猪、禽类(例如，鸡)、小鼠、兔子和大鼠。如本文中所使用的，术语“受试者”是指人类受试者和动物受试者两者。

本发明化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)的施用途径可以是任何合适的途径。施用途径可以是但不限于口服途径、肠胃外途径、皮肤途径、鼻腔途径、直肠途径、阴道途径和眼途径。在其它实施方案中，施用途径可以是肠胃外施用、粘膜施用、静脉内施用、皮下施用、局部施用、皮内施用、口服施用、舌下施用、鼻内施用或肌内施用。施用途径的选择可以取决于化合物特性(例如，化合物的物理和化学性质)以及动物的年龄和体重、具体的疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)以及疾病的严重程度。当然，可以根据需要施用施用途径的组合。

本发明的一些实施方案包含一种用于向受试者提供包括本文所描述的本发明的一种或多种化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)的组合物(例如，药物组合物)的方法，所述方法包括一次或多次施用一种或多种此类组合物；如果存在多于一次施用，则所述组合物可以相同或不同。

可以使用本发明的化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)治疗的动物(例如，哺乳动物、猪、犬、禽类(例如，鸡)、牛、猫、灵长类动物、啮齿动物、猴子、兔子、小鼠、大鼠和人)的疾病包含但不限于酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肠道通透性(例如，漏肠，如金属诱导性肠漏、应激诱导性肠漏或辐射诱导性肠通透性)、结肠炎、局部炎症(例如，脑、口腔、食道、胃和小肠中)、全身性炎症、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克罗恩病)、感染诱导性炎性疾病(例如，败血症或败血症诱导性肾损伤或败血症诱导性肺损伤)、神经炎性病症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、焦虑、抑郁症、代谢应激、心血管疾病、肌少症、肌肉退行性疾病、杜氏肌营养不良症、非酒精性脂肪性肝病、药物诱导性肝损伤、α-抗胰蛋白酶缺乏症、缺血/再灌注损伤、肥胖症、代谢综合征、II型糖尿病、高脂血症、骨关节炎、神经退行性疾病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)、认知障碍、应激、情绪障碍或纤维化。在一些实施方案中，可以治疗的疾病包含但不限于酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肠道通透性(例如，漏肠，如金属诱导性肠漏、应激诱导性肠漏或辐射诱导性肠通透性)、结肠炎、局部炎症(例如，脑、口腔、食道、胃和小肠中)、全身性炎症、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克罗恩病)、感染诱导性炎性疾病(例如，败血症或败血症诱导性肾损伤或败血症诱导性肺损伤)、神经炎性病症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化。在一些实施方案中，可以治疗的疾病包含但不限于酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、结肠炎、肠道通透性、漏肠、金属诱导性肠漏、应激诱导性肠漏、辐射诱导性肠通透性、局部炎症、全身性炎症、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、感染诱导性炎性疾病、败血症、败血症诱导性肾损伤、败血症诱导性肺损伤、硬皮病、血管炎、药物诱导性血管炎、神经炎性病症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化。可以治疗的动物包含但不限于哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物、猴子(例如，猕猴、恒河猴或猪尾猕猴)、人、犬、猫、猪、禽类(例如，鸡)、牛、小鼠、兔子和大鼠。如本文中所使用的，术语“受试者”是指人类受试者和动物受试者两者。在一些情况下，动物需要治疗(例如，由于表现出疾病或癌症的迹象，或由于患有癌性肿瘤)。

在一些实施方案中，可以使用本发明的化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)治疗的动物(例如，哺乳动物、猪、犬、禽类(例如，鸡)、牛、猫、灵长类动物、啮齿动物、猴子、兔子、小鼠、大鼠和人)的癌症包含但不限于胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)、肺癌、肝癌、结肠直肠癌(例如，结肠癌或直肠癌)、黑色素瘤(例如，皮肤恶性黑色素瘤、黑色素瘤肿瘤发生)、膀胱癌、前列腺癌、恶性神经鞘瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、鳞状细胞癌(例如，头颈部鳞状细胞癌)、淋巴瘤、白血病、骨髓癌、非霍奇金淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)、多形性胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、基底细胞癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、肾细胞癌、肝细胞癌、结肠癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病、横纹肌肉瘤、脑膜瘤、胃癌(gastric cancer)、神经胶质瘤、口腔癌、鼻咽癌、直肠癌、胃癌(stomach cancer)、子宫癌、成神经管细胞瘤、可能导致转移的癌症、由转移引起的癌症或其癌性肿瘤。在一些实施方案中，可以治疗的癌症包含但不限于乳腺癌、结肠癌或其癌性肿瘤。可以治疗的动物包含但不限于哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物、猴子(例如，猕猴、恒河猴或猪尾猕猴)、人、犬、猫、猪、禽类(例如，鸡)、牛、小鼠、兔子和大鼠。如本文中所使用的，术语“受试者”是指人类受试者和动物受试者两者。在一些情况下，动物需要治疗(例如，由于表现出疾病或癌症的迹象，或由于患有癌性肿瘤)。

在一些实施方案中，可以治疗的疾病包含但不限于血管炎、药物诱导性血管炎、硬皮病、血管内出血、药物诱导性内出血、特应性皮炎、与灌注有关的损伤、与灌注有关的炎症、糖尿病性视网膜病变、乳糜泻、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、代谢应激、心血管疾病、肌少症、肌肉退行性疾病、杜氏肌营养不良症、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、药物诱导性肝损伤、慢性肾病、α-抗胰蛋白酶缺乏症、缺血/再灌注损伤、炎症、炎性肠病、克罗恩病、肥胖症、代谢综合征、II型糖尿病、高脂血症、骨关节炎、神经退行性疾病、神经炎性病症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性肺损伤、与输血有关的急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、癌症、认知障碍、应激或情绪障碍。

在一些实施方案中，可以使用本发明的化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)治疗的动物(例如，哺乳动物、猪、犬、禽类(例如，鸡)、牛、猫、灵长类动物、啮齿动物、猴子、兔子、小鼠、大鼠和人)的疾病包含但不限于可以通过以下治疗的疾病：(a)增强肠屏障完整性；(b)增强血管屏障完整性；(c)增强肺的气道屏障完整性；(d)改善或增加动物(例如，人)的组织或器官(例如，动物的选自由以下组成的组的组织或器官中：脑、眼、皮肤、骨、骨髓、软骨、心脏、肺、胃、肠、肝、胰腺、肾、肌肉和脂肪)或细胞(例如，成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、内皮细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞)中的自噬；(e)抑制单氨基氧化酶(MAO，如MAO-A或MAO-B)酶活性；(f)诱导紧密连接蛋白(例如，闭合蛋白家族蛋白(Cldn 1-27)、咬合蛋白、闭锁小带(例如，ZO-1、ZO-2)、紧密连接蛋白(TJP)、连接相关粘附分子(JAM)或黏着小带蛋白(如血管内皮钙粘蛋白(VE-钙粘蛋白))的表达；(g)诱导AhR的核易位和/或激活；(h)诱导Nrf2的核易位和/或激活；(i)诱导Cyp1A1和/或Cyp1A2的表达；(j)增加细胞(例如，胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞或生殖细胞)的自噬(例如，线粒体自噬)；或(k)其组合。

如本文所使用的，术语“治疗(treating)”(和其变化形式，如“治疗(treatment)”)应在其最广泛的背景下考虑。具体地，术语“治疗”并不一定意味着对动物进行治疗，直至完全恢复。因此，“治疗”包含症状的减轻、与病状相关的症状或影响的缓解、病状严重程度的降低或者预防、预防性地减轻症状或以其它方式降低患上特定病状的风险。如本文所使用的，提及“治疗”动物包含但不限于预防性治疗和治疗性治疗。本文所描述的组合物(例如，药物组合物)中的任何组合物都可以用于治疗动物。

与治疗疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)有关的治疗可以包含但不限于预防性治疗和治疗性治疗。如此，治疗可以包含但不限于：预防疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)；降低疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)的风险；减轻或缓解疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)的症状；引起对疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)的身体应答；抑制疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)的发展或进展；抑制或预防与疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)相关的症状的发作；降低疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)的严重程度；引起疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)或与疾病相关的症状中的一种或多种症状的消退(例如，炎症减少)；引起疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)的缓解；或者预防疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)的复发。在一些实施方案中，治疗不包含疾病的预防性治疗(例如，预防或改善未来的疾病)。

可以使用任何合适的施用方法(如本文所公开的施用方法)并且使用任何合适量的本发明的化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)治疗动物。在一些实施方案中，治疗方法包括治疗动物的疾病(例如，酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)。本发明的一些实施方案包含一种用于用包括本发明的化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)的组合物(例如，药物组合物)治疗受试者(例如，动物，如人或灵长类动物)的方法，所述方法包括一次或多次使用一种或多种此类组合物；如果存在多于一次施用，则所述组合物可以相同或不同。

在一些实施方案中，所述治疗方法包含施用有效量的包括本发明的化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)的组合物。如本文所使用的，术语“有效量”是指足以在动物中影响治疗(例如，治疗疾病，如但不限于酒精性肝病(ALD)、肠道通透性(例如，漏肠)、炎症(例如，局部或全身性)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、败血症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癌症(例如，癌性肿瘤、乳腺癌或结肠癌)或纤维化)的剂量或一系列剂量。在一些实施方案中，有效量可以涵盖如本文所公开的治疗有效量。在某些实施方案中，有效量可以根据受试者和受影响的特定治疗而变化。例如，取决于受试者的年龄和总体状况、所使用的特定佐剂(如果适用的话)、施用方案等，所需的确切量可以例如因受试者而异。如此，有效量可以例如基于具体情况而变化，并且可以在特定情况下确定适当的有效量。有效量可以例如包含本文所公开的任何剂量或组合物量。在一些实施方案中，本发明的至少一种化合物(例如，式(I)，如但不限于化合物I-1或I-2或尿石素衍生物)(其可以施用于动物，如哺乳动物、灵长类动物、猴子或人)的有效量可以为以下量：约0.005到约50mg/kg体重、约0.01到约15mg/kg体重、约0.1到约10mg/kg体重、约0.5到约7mg/kg体重、约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg或约15mg/kg。关于一些实施方案，剂量可以是约0.5mg/kg人体重或约6.5mg/kg人体重。在一些情况下，本发明的至少一种化合物(例如，式(I)，如但不限于化合物I-1或I-2或尿石素衍生物)(其可以施用于动物，如哺乳动物、啮齿动物、小鼠、兔子、猫、猪或犬)的有效量可以为以下量：约0.005到约50mg/kg体重、约0.01到约15mg/kg体重、约0.1到约10mg/kg体重、约0.5到约7mg/kg体重、约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约80mg/kg、约100mg/kg或约150mg/kg。在一些实施方案中，本发明的至少一种化合物(例如，式(I)，如但不限于化合物I-1或I-2或尿石素衍生物)(其可以施用于动物，如哺乳动物、灵长类动物、猴子或人)的有效量可以为以下量：约1到约1000mg/kg体重、约5到约500mg/kg体重、约10到约200mg/kg体重、约25到约100mg/kg体重、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约25mg/kg、约50mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约300mg/kg、约400mg/kg、约500mg/kg、约600mg/kg、约700mg/kg、约800mg/kg、约900mg/kg或约1000mg/kg。关于一些病状，剂量可以是约20mg/kg人体重或约100mg/kg人体重。在一些情况下，本发明的至少一种化合物(例如，式(I)，如但不限于化合物I-1或I-2或尿石素衍生物)(其可以施用于动物，如哺乳动物、啮齿动物、小鼠、兔子、猫、猪或犬)的有效量可以为以下量：约1到约1000mg/kg体重、约5到约500mg/kg体重、约10到约200mg/kg体重、约25到约100mg/kg体重、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约25mg/kg、约50mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约300mg/kg、约400mg/kg、约500mg/kg、约600mg/kg、约700mg/kg、约800mg/kg、约900mg/kg或约1000mg/kg。

“治疗有效量”意指有效达到期望和/或有益效果(例如，减少炎症)的量。可以以一次或多次施用来施用治疗有效量。为了本发明的一些目的，治疗有效量是适于治疗适应症(例如，治疗疾病)的量。治疗适应症意指达到任何期望的效果，如减轻、改善、稳定、逆转、减缓或延迟疾病进展、提高生活质量或延长寿命中的一种或多种。可以通过任何合适的方法来测量这种实现，如但不限于炎症程度。

在一些实施方案中，治疗还可以包含外科手术干预、化学疗法、放射疗法、激素疗法、免疫疗法和辅助性全身性疗法中的一种或多种。佐剂可以包含但不限于化学疗法(例如，替莫唑胺(temozolomide))、放射疗法、抗血管生成疗法(例如，贝伐单抗(bevacizumab))和激素疗法，如施用LHRH激动剂；抗雌激素，如他莫昔芬(tamoxifen)；高剂量孕激素；芳香酶抑制剂；和/或肾上腺切除术。化学疗法可以以单一药剂或与已知或新疗法的组合的方式使用。

在一些实施方案中，本文所公开的治疗可以包含使用其它药物(例如，抗生素或5-氟尿嘧啶(例如，用于癌症治疗或化学抗性癌症治疗))或疗法来治疗疾病。例如，可以将本发明的化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2或尿石素衍生物)与5-氟尿嘧啶组合以治疗癌症(例如，结肠癌肿瘤、乳腺癌肿瘤或化学抗性癌症)。例如，抗生素可以用于治疗感染，并且可以与本发明的化合物组合以治疗疾病(例如，与炎症相关的感染)。在其它实施方案中，静脉用免疫球蛋白(IVIG)疗法可以用作治疗方案的一部分(即，作为施用本发明的一种或多种化合物的补充)。

在某些实施方案中，治疗可以：(a)增强肠屏障完整性；(b)增强血管屏障完整性；(c)增强肺的气道屏障完整性；(d)改善或增加动物(例如，人)的组织或器官(例如，动物的选自由以下组成的组的组织或器官中：脑、眼、皮肤、骨、骨髓、软骨、心脏、肺、胃、肠、肝、胰腺、肾、肌肉和脂肪)或细胞(例如，成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、内皮细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞)中的自噬；(e)抑制单氨基氧化酶(MAO，如MAO-A或MAO-B)酶活性；(f)诱导紧密连接蛋白(例如，闭合蛋白家族蛋白(Cldn1-27)、咬合蛋白、闭锁小带(例如，ZO-1、ZO-2)、紧密连接蛋白(TJP)、连接相关粘附分子(JAM)或黏着小带蛋白(如血管内皮钙粘蛋白(VE-钙粘蛋白))的表达；(g)诱导AhR的核易位和/或激活；(h)诱导Nrf2的核易位和/或激活；(i)诱导Cyp1A1和/或Cyp1A2的表达；(j)增加细胞(例如，胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞或生殖细胞)的自噬(例如，线粒体自噬)；或(k)其组合。

用于制备本发明的化合物的方法

本发明的一些实施方案包含用于制备式(I)化合物(例如，式(IA)或尿石素衍生物)的方法。式(I)化合物可以使用任何合适的方法制备或者可以购买获得(如果可获得的话)。在某些实施方案中，可以制备式(I)(例如，式(IA)或尿石素衍生物)的化合物，包括使式(V)化合物与式(VI)化合物反应以产生式(VII)的步骤，所述式(VII)然后被制备成式(I)(例如，式(IA)或尿石素衍生物)(例如，使用一个或多个合成步骤)。

在某些实施方案中，式(V)可以是

在一些实施方案中，R₂₀可以是卤素(例如，F、Cl、Br、或I)或在其它实施方案中，R₂₀可以是Cl或在某些实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅与本文所公开的那些相同。在其它实施方案中，X₁和X₂与本文所公开的那些相同。式(V)可以使用任何合适的方法制备或者如果可获得的话，可以购买获得。式(VI)可以使用任何合适的方法制备或者如果可获得的话，可以购买获得。

在一些实施方案中，式(V)可以在以下条件下与式(VI)反应：式(V)可以处于包括溶剂(例如，THF)、溴化铜和溴化锂的混合物中。可以将混合物冷却(例如，使用干冰丙酮混合物)到一定温度(例如，约-78℃)，持续一定时间量(例如，约2小时)。可以将式(VI)(例如，缓慢地)添加到经过冷却的混合物中。可以搅拌混合物和/或使其达到室温(例如，过夜)。然后，可以将混合物冷却到0℃，并任选地(例如，用氯化铵水溶液)淬灭。然后，可以任选地回收式(VII)(例如，如本文所公开的)。

式(VII)可以使用任何合适的方法(例如，参见上文)制备或者如果可获得的话，可以购买获得。

在一些实施方案中，式(VII)可以处于包括溶剂(例如，二氯甲烷)的混合物中。可以将混合物冷却(例如，到约0℃)。然后，可以添加(例如，缓慢地)氯化钛(IV)和/或氯化钼(V)。然后，可以将混合物在室温下搅拌(例如，过夜)。然后，可以将混合物冷却到0℃，并任选地(例如，用甲醇缓慢)淬灭。然后，可以任选地回收式(I)(例如，式(IA))(例如，如本文所公开的)。

在一些实施方案中，可以使式(I)(例如，式(IA))可以进一步以改变R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、X₁或X₂中的一个或多个的特性。此类进一步的反应可以包含但不限于以下中的一个或多个：(a)与氯化铝(例如，无水)反应；或(b)与乙酸和乙醇胺反应(例如，在110℃下回流过夜)。

在一些实施方案中，可以回收式(I)(例如，式(IA))(或上文叙述的任何其它式)。可以使用任何合适的方法进行回收，包含但不限于HPLC(例如，反相)、LC、沉淀、过滤、离心、柱色谱法(例如，尺寸排阻色谱法或离子交换色谱法)、使用硅胶或其组合。

在一些实施方案中，一种用于制备式(I)化合物(例如，式(IA))的方法可以包括上文所提及的步骤中的一个或多个步骤。在某些实施方案中，一种用于制备式(I)化合物(例如，式(IA))的方法包括

(a)使式(V)化合物与式(VI)化合物反应，以得到包括式(VII)化合物的混合物；

(b)使式(VII)化合物与合适的化合物(例如，氯化钛(IV)和/或氯化钼(V))反应，以得到包括式(I)化合物(例如，式(IA))的混合物；

(c)任选地使所述式(I)化合物(例如，式(IA))进一步反应以得到不同的式(I)化合物(例如，式(IA))，使得R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、X₁或X₂中的一个或多个的特性通过所述进一步反应而改变；以及

(d)回收式(I)(例如，式(IA))。

另外的实施方案-A

1.一种尿石素衍生物，其具有尿石素环状酯的化学基团取代，所述化学基团取代使所述衍生物的效力相比尿石素A有所提高，或者使所述衍生物在酸性pH下和/或在存在酯酶和/或蛋白酶的情况下的稳定性相比尿石素A有所提高。

2.根据实施方案1所述的尿石素衍生物，其中尿石素环状酯被环状醚替代。

3.根据实施方案2所述的尿石素衍生物，其中所述尿石素环状醚包括一个或多个取代基。

4.根据实施方案3所述的尿石素衍生物，其中所述环状醚取代基独立地选自卤基、胺、经取代的胺、羟基和具有一个或两个独立地选自O、N或S的杂原子的C5或C6杂环。

5.根据实施方案1所述的尿石素衍生物，其中尿石素环状酯被具有相邻羰基的碳环替代。

6.根据实施方案1所述的尿石素衍生物，其中尿石素环状酯被环状烯基替代，所述环状烯基任选地是芳香族的并且是任选地经取代的。

7.根据实施方案6所述的尿石素衍生物，其中所述环状烯基具有一个或多个取代基。

8.根据实施方案7所述的尿石素衍生物，其中所述环状烯基取代基独立地选自酮、任选地经取代的亚胺、任选地经取代的胺、卤基和羟基。

9.根据实施方案1所述的尿石素衍生物，其中尿石素环状酯被环状酰胺替代。

10.根据实施方案1所述的尿石素衍生物，其中尿石素环状酯被非环状桥替代。

11.根据实施方案1到10中任一项所述的尿石素衍生物，其中所述尿石素芳香族基团具有一个或多个取代基。

12.根据实施方案11所述的尿石素衍生物，其中所述芳香族基团是任选地经取代的苯基。

13.根据实施方案11或12所述的尿石素衍生物，其中所述一个或多个芳香族取代基独立地选自羟基、烷氧基、卤基、胺、5或6元碳环或杂环、硝基、腈、烷基、烷基醚和卤代烷基。

14.根据实施方案1到13中任一项所述的尿石素衍生物，其中一个或多个尿石素芳香族环为杂环。

15.根据实施方案14所述的尿石素衍生物，其中所述杂环的杂原子独立地选自N、O和S。

16.根据实施方案1到15中任一项所述的尿石素衍生物，其中每个芳香族环的取代基一起形成第二桥连环。

17.根据实施方案16所述的尿石素衍生物，其中所述第二桥连环在结构上与第一桥连环相同。

18.根据实施方案16所述的尿石素衍生物，其中所述第二桥连环在结构上与所述第一桥连环不同。

19.一种诱导组织中的紧密连接蛋白的表达的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的包括尿石素结构类似物的药物组合物。

20.一种诱导组织中的紧密连接蛋白的表达的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的包括根据实施方案1到18中任一项所述的尿石素衍生物的组合物(或包括本文所公开的任何化合物的组合物)。

21.根据实施方案19或20所述的方法，其中所述受试者表现出胃肠通透性或炎症的症状，并且所述组合物施用于小肠和/或大肠。

22.根据实施方案21所述的方法，其中所述受试者患有炎性肠病。

23.根据实施方案22所述的方法，其中所述炎性肠病是克罗恩病或溃疡性结肠炎。

24.根据实施方案21所述的方法，其中所述受试者患有乳糜泻。

25.根据实施方案24所述的方法，其中所述炎性肠病包括结肠炎症。

26.根据实施方案19或20所述的方法，其中所述组合物以有效改善器官中的内皮或血管屏障完整性的量全身施用。

27.根据实施方案26所述的方法，其中所述器官选自肝、肾、胰腺、心脏、肺、皮肤、肌肉、脂肪、脑、眼、骨和肠中的一种或多种。

28.根据实施方案27所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的病状：血管炎、药物诱导性血管炎、硬皮病、血管内出血、药物诱导性内出血、特应性皮炎、与灌注有关的损伤、与灌注有关的炎症和糖尿病性视网膜病变。

29.一种治疗全身性炎症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括根据实施方案1到18中任一项所述的尿石素衍生物的组合物(或包括本文所公开的任何化合物的组合物)。

30.根据实施方案29所述的方法，其中所述组合物肠内或肠胃外施用。

31.根据实施方案30所述的方法，其中所述受试者患有或有风险患有败血症或感染诱导性炎性疾病。

32.根据实施方案30所述的方法，其中所述受试者患有或有风险患有酒精性肝病(ALD)。

33.根据实施方案30所述的方法，其中所述受试者患有或有风险患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性脂肪性肝炎(ASH)。

34.根据实施方案29所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的一种或多种器官或组织的炎症：肝、肾、胰腺、心脏、肺、皮肤、肌肉、脂肪、脑、眼、骨、骨髓、肠和软骨。

35.一种用于治疗神经炎性病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括根据实施方案1到18中任一项所述的尿石素衍生物的组合物(或包括本文所公开的任何化合物的组合物)。

36.根据实施方案35所述的方法，其中所述神经炎性病症是阿尔茨海默氏病。

37.根据实施方案35所述的方法，其中所述神经炎性病症是帕金森氏病。

38.根据实施方案35所述的方法，其中所述神经炎性病症是神经退行性疾病，所述神经退行性疾病任选地是多发性硬化症。

39.一种用于治疗焦虑或抑郁症的方法，所述方法包括以有效抑制有需要的受试者的单胺氧化酶的量向所述受试者施用有效量的包括根据实施方案1到18中任一项所述的尿石素衍生物的组合物(或包括本文所公开的任何化合物的组合物)。

40.根据实施方案39所述的方法，其中所述组合物全身施用或局部施用于脑。

41.根据实施方案39所述的方法，其中所述组合物肠内、肠胃外或鼻内施用。

42.一种增强肺的气道屏障完整性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的包括根据实施方案1到18中任一项所述的尿石素衍生物的组合物(或包括本文所公开的任何化合物的组合物)。

43.根据实施方案42所述的方法，其中所述受试者患有肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性肺损伤、与输血有关的急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征或哮喘。

44.一种改善或增加受试者的自噬的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的包括根据实施方案1到18中任一项所述的尿石素衍生物的组合物(或包括本文所公开的任何化合物的组合物)。

45.根据实施方案44所述的方法，其中所述受试者的选自以下的组织或器官中的自噬得到改善或增加：脑、眼、皮肤、骨、骨髓、软骨、心脏、肺、胃、肠、肝、胰腺、肾、肌肉和脂肪。

46.根据实施方案45所述的方法，其中所述受试者的选自以下的细胞中的自噬得到改善或增加：成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、内皮细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞。

47.根据实施方案44或45中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或病状：代谢应激、心血管疾病、肌少症、肌肉退行性疾病、杜氏肌营养不良症、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、药物诱导性肝损伤、慢性肾病、α-抗胰蛋白酶缺乏症、缺血/再灌注损伤、炎症、炎性肠病、克罗恩病、肥胖症、代谢综合征、II型糖尿病、高脂血症、骨关节炎、神经退行性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、癌症、认知障碍、应激和情绪障碍，借此所述施用治疗或改善所述疾病或病状。

48.一种增加受试者的寿命的方法，所述方法包括向受试者施用有效增加动物的寿命的包括根据实施方案1到18中任一项所述的尿石素衍生物的组合物(或包括本文所公开的任何化合物的组合物)的方案。

49.根据实施方案19到48中任一项所述的方法，其中所述受试者是脊椎动物。

50.根据实施方案49所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物，所述哺乳动物任选地是灵长类动物。

51.根据实施方案50所述的方法，其中所述受试者是人。

52.根据实施方案48所述的方法，其中所述受试者是兽医患者。

53.一种增加细胞中的自噬的方法，所述方法包括使细胞与有效量的包括根据实施方案1到18中任一项所述的尿石素衍生物的组合物(或包括本文所公开的任何化合物的组合物)接触。

54.根据实施方案53所述的方法，其中所述自噬是线粒体自噬。

55.根据实施方案53所述的方法，其中所述细胞选自：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞。

56.一种在体外增加真核细胞的寿命的方法，所述方法包括使所述细胞与有效增加所述细胞的寿命的包括根据实施方案1到18中任一项所述的尿石素衍生物的组合物(或包括本文所公开的任何化合物的组合物)接触。

57.根据实施方案56所述的方法，其中所述真核细胞是原代培养的真核细胞。

58.根据实施方案56或57所述的方法，其中所述真核细胞是细胞系的一部分。

59.根据实施方案56到58中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是选自以下的细胞：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞。

60.根据实施方案59所述的方法，其中所述真核细胞是选自以下的细胞：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞和成体干细胞。

另外的实施方案-B

1.一种具有表2中所示结构的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物。

61.本文所公开的任何药物组合物，其适于通过选自肠内、肠胃外、直肠、吸入、鼻内和局部的途径施用。

62.根据实施方案61所述的药物组合物，其被调配用于静脉内施用。

63.根据实施方案61所述的药物组合物，其中所述组合物是被调配用于肺部施用的气雾剂或雾剂。

64.根据实施方案61所述的药物组合物，其中所述组合物被调配用于局部施用于皮肤、眼或粘膜。

65.根据实施方案61所述的药物组合物，其中所述组合物被调配用于施用于胃肠道。

66.根据实施方案65所述的药物组合物，其中所述组合物被调配用于将有效量的所述衍生物或化合物递送到口腔、食道、胃、小肠、大肠和/或结肠。

67.根据实施方案61所述的药物组合物，其中所述组合物被调配用于全身施用。

68.根据实施方案67所述的药物组合物，其中所述衍生物或化合物被调配用于肠内或肠胃外施用。

69.根据实施方案60所述的药物组合物，其中所述组合物施用于受试者的中枢神经系统。

70.根据实施方案69所述的药物组合物，其中所述组合物被调配用于全身施用。

71.根据实施方案69所述的药物组合物，其中所述组合物被调配用于鞘内施用。

另外的实施方案-C

1.一种预防或治疗炎性肠病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

2.根据实施方案2所述的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。

3.一种诱导紧密连接蛋白的表达的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

4.根据实施方案3所述的方法，其中所述紧密连接蛋白是闭合蛋白家族蛋白(Cldn1-27)、咬合蛋白、闭锁小带(例如，ZO-1、ZO-2)、紧密连接蛋白(TJP)、连接相关粘附分子(JAM)或黏着小带蛋白(如血管内皮钙粘蛋白(VE-钙粘蛋白)。

5.一种诱导AhR的核易位和激活的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

6.一种诱导Nrf2的核易位和激活的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

7.一种诱导Cyp1A1或/和Cyp1A2的表达的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

8.一种减少口腔、食道、胃和小肠的炎症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

9.一种减少全身性炎症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

10.一种减少神经炎症或脑炎症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

11.一种预防或治疗感染性疾病和感染诱导性炎性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

12.根据实施方案11所述的方法，其中所述感染性疾病或感染诱导性炎性疾病是败血症或败血症诱导性肾损伤或败血症诱导性肺损伤。

13.一种减少结肠的中性粒细胞浸润的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

14.一种减少血管组分浸润到器官或组织中的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

15.一种减少中性粒细胞浸润到器官或组织中的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

16.一种减少细胞因子浸润到器官或组织中的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

17.根据实施方案14到16中任一项所述的方法，其中所述器官或组织选自由以下组成的组：脑、眼、皮肤、骨、骨髓、软骨、心脏、肺、胃、肠、肝、胰腺、肾、肌肉和脂肪。

18.一种增强肠屏障完整性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

19.一种增强血管屏障完整性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

20.一种增强肺的气道屏障完整性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

21.一种治疗神经炎性病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

22.根据实施方案21所述的方法，其中所述神经炎性病症是阿尔茨海默氏病。

23.根据实施方案21所述的方法，其中所述神经炎性病症是帕金森氏病。

24.一种抑制单氨基氧化酶(MAO)酶活性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

25.一种治疗神经退行性病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物。

26.根据实施方案25所述的方法，其中所述神经退行性病症是焦虑。

27.根据实施方案25所述的方法，其中所述神经退行性病症是抑郁症。

28.一种增加细胞中的自噬的方法，所述方法包括使细胞与有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物接触，由此增加所述细胞中的自噬。

29.根据实施方案28所述的方法，其中所述自噬是线粒体自噬。

30.根据实施方案28所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞。

31.一种增加动物的寿命的方法，所述方法包括向有需要的动物施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)或其前体的组合物，由此增加所述动物的寿命。

32.根据实施方案31所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。

33.根据实施方案32所述的方法，其中所述动物是人。

34.一种在体外增加真核细胞的寿命的方法，所述方法包括使真核细胞在体外与有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)的组合物接触，由此在体外增加所述真核细胞寿命。

35.根据实施方案34所述的方法，其中所述真核细胞是原代培养的真核细胞。

36.根据实施方案34或35所述的方法，其中所述真核细胞是细胞系的一部分。

37.根据实施方案34到36中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是选自由以下组成的组的细胞：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞。

38.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是选自由以下组成的组的细胞：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞和成体干细胞。

39.一种改善或增加动物的自噬的方法，所述方法包括向有需要的动物施用有效量的包括本文所公开的任何化合物(例如，式(I)、(IA)、I-1或I-2)或其前体的组合物，由此改善或增加所述动物的自噬。

40.根据实施方案39所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。

41.根据实施方案40所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

42.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述动物的选自由以下组成的组的组织或器官中的自噬得到改善或增加：脑、眼、皮肤、骨、骨髓、软骨、心脏、肺、胃、肠、肝、胰腺、肾、肌肉和脂肪。

43.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述动物的选自由以下组成的组的细胞中的自噬得到改善或增加：成体干细胞、分化细胞、血细胞、造血细胞、内皮细胞、上皮细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、结缔组织细胞、脂肪细胞、骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、神经细胞、感觉细胞、心脏细胞、肝细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肾细胞和生殖细胞。

44.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述动物患有选自由以下组成的组的疾病或病状：代谢应激、心血管疾病、肌少症、肌肉退行性疾病、杜氏肌营养不良症、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、药物诱导性肝损伤、α-抗胰蛋白酶缺乏症、缺血/再灌注损伤、炎症、炎性肠病、克罗恩病、肥胖症、代谢综合征、II型糖尿病、高脂血症、骨关节炎、神经退行性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、癌症、认知障碍、应激和情绪障碍，借此所述施用治疗所述疾病或病状。

45.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物通过口服摄取施用。

46.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。

47.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物腹膜内施用。

48.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物通过吸入剂或气雾剂施用。

49.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物局部施用。

通过以下具体但非限制性的实例进一步说明当前公开的主题。以下实例可以包含表示在与本发明有关的开发和实验过程期间的不同时间收集的数据的数据汇编。

实施例

实施例组A

材料：从西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))购买一般实验室化学品和试剂溶液。从百进生技公司(Bio-legend)购买用于IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒。从R&D系统公司(R&D systems)购买用于CXCL1的ELISA试剂盒。除非另有说明，从圣克鲁斯公司(Santacruz)购买所有抗体。从西格玛奥德里奇公司购买LPS。从MP生物医药公司(MP Bio)购买结肠炎级DSS(36,000-50,000M.W)。如前所述定制合成UroA(SAHA等人,(2016)“肠道微生物群将饮食中的鞣花酸转化成具有生物活性的植物性尿石素A会抑制血红素过氧化物酶(Gut Microbiota Conversion of Dietary Ellagic Acidinto Bioactive Phytoceutical Urolithin A Inhibits Heme Peroxidases)”,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》,第11卷,文章e0156811)。

小鼠：在动物设施中育种或从杰克逊实验室(Jackson Laboratories)购买C57BL/6小鼠。从杰克逊实验室购买Nrf2^-/-小鼠育种对(B6.129x1-Nfe2/2^tm1Ywk/J，库存编号0170009)，并在路易斯维尔大学(U of L)动物设施处育种以产生实验动物。从泰康利实验室(Taconic Laboratories)购买AhR^-/-小鼠(型号9166)。利用年龄在7-9周龄之间的小鼠进行结肠炎实验。将小鼠在具有交替的12小时黑暗和光照循环的温度受控的房间内保持在无特定病原体(SPF)的屏障条件下。允许动物随意自由获取饲料和水。根据美国肯塔基州路易斯维尔路易斯维尔大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)(Institutional AnimalCare and Use Committee(IACUC),University of Louisville,Louisville,KY,USA)的批准方案进行所有研究。

用于合成UAS03的合成程序：化学上，UroA(3,8-二羟基-6H-二苯并[b,d]吡喃-6-酮)结构具有桥酯、内酯和两个苯环上的两个羟基。UroA具有连接两个苯基环并产生平面结构的内酯(环状酯)键。胃pH或消化酶可以水解内酯键，从而使环打开。这将使其失去平面结构，变成螺旋桨结构，并可能失去活性。为了产生更稳定且更强效的化合物，通过以下程序合成了不可水解的环状醚衍生物UAS03(图10)。

将硼氢化钠(0.165g，4.38mmol)添加到干燥的THF(10ml)中，并将混合物冷却到10℃，然后经1小时时段逐滴添加醚合三氟化硼(0.80g，5.7mmol)。然后，经10分钟的时段添加含3,8-二羟基-6H-苯并[c]色烯-6-酮(Uro-A)(0.5g，2.19mmol)的THF(5ml)。将混合物在50℃下搅拌5小时。通过薄层色谱法(TLC)监测反应的完成。将反应用甲醇淬灭。添加3N HCl水溶液(10ml)，并将混合物温和加热到50℃，持续30分钟。将反应混合物用10％NaOH溶液调节到中性，并将挥发物在减压下蒸发。将粗产物使用含50％乙酸乙酯的己烷用60-120目硅胶通过柱色谱法纯化，以得到纯的6H-苯并[c]色烯-3,8-二醇产物。

MS(M+1)＝215.2.¹H-NMR(DMSO-d₆):δ:9.49(2H,s),7.51-7.50(1H,d,J＝6.6Hz),7.48-7.47(1H,d,J＝6.6Hz),6.75-6.73(1H,m),6.61(1H,s),6.48-6.46(1H,m),6.32(1H,s),4.96(2H,s)。¹³C-NMR(DMSO-d₆):δ:158.10,156.71,154.93,131.88,123.86,122.79,121.66,115.72,114.89,111.84,110.07,103.95,68.18。

细胞培养：将人结肠上皮癌细胞系HT29(ATCC编号：HTB-38^TM)和Caco2细胞(ATCC编号：HTB-37^TM)分别维持在潮湿气氛中(5％CO₂，95％空气，37℃)在补充有10％胎牛血清、1X青霉素-链霉素溶液(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；西格玛奥德里奇公司)的DMEM高葡萄糖和EMEM高葡萄糖(康宁公司(Cornings)；10-009CV)中。将小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)使用以下程序来分离和培养(KUROWSKA-STOLARSKA等人,(2009)“IL-33增强导致气道炎症的交替激活的巨噬细胞的极化(IL-33amplifies the polarization ofalternatively activated macrophages that contribute to airway inflammation)”,《免疫学期刊(Journal of immunology)》,第183卷,第6469-6477页)。简而言之，将小鼠通过CO₂麻醉处死，在70％乙醇中冲洗，并从胫骨和股骨中分离出骨髓。将骨髓细胞平板接种(2×10⁶细胞/ml)在补充有10％FBS、1％谷氨酰胺、1X青霉素-链霉素溶液和50ng/mL小鼠M-CSF(明尼苏达州明尼阿波利斯市(Minneapolis,MN)的R&D系统公司)的DMEM高葡萄糖(海可隆公司(HyClone))中，持续7天以进行分化。

测量BMDM中IL-6和TNF-α：将BMDM平板接种在96孔板(10,000个细胞/孔)和12孔板(0.1×10⁶个细胞/孔)中，以进行ELISA和RNA分离。为了评估抗炎性质，将BMDM仅用大肠杆菌源性脂多糖(LPS；O55:B5；西格玛公司)以50ng/mL的浓度刺激六小时或用大肠杆菌源性脂多糖与UroA或UAS03的组合以所指示的浓度(0.01、0.1、1、10、25、50μM)一式四份地刺激六小时。为了通过ELISA产生细胞因子，将上清液收集并在4℃下以10,000x g离心10分钟以沉淀出任何细胞，并将细胞因子按照制造商的说明使用IL-6和TNF-α特异性ELISA试剂盒(百进生技公司)进行定量。

LPS诱导性腹膜炎：将雄性小鼠(C57BL/6J；6-8周龄)随机分成3组，即，媒剂(0.25％羧甲基纤维素钠(CMC))、UroA和UAS03。UroA组和UAS03组在第0小时、第6小时、第12小时、第18小时和第24小时接受相应化合物的口服强饲(100μl体积中，20mg/kg)。媒剂组同时接受同一体积的CMC。在24小时之后，向小鼠腹膜内注射LPS(2mg/kg；西格玛奥德里奇公司)。LPS攻击后4小时，将小鼠处死并收集血液。使用BD Microtainer分离管制备血清。使用相应ELISA测定试剂盒(百进生技公司)分析血清样品中的Il-6和TNF-α。

实时PCR：使用16LEV simplyRNA组织试剂盒(普洛麦格公司(Promega))从细胞/组织中分离总RNA，并用TaqManC逆转录试剂盒(美国加利福尼亚州应用生物系统公司(Applied Biosystems,CA,USA))进行逆转录。将经转录的cDNA(稀释后)与100nM基因特异性引物(实时引物有限责任公司(Real time primers LLC))和1X SYBR green反应混合物(PowerGreen PCR预混液(PowerGreen PCR Master Mix)；美国加利福尼亚州应用生物系统公司)混合。使用CFX96^TM实时系统(伯乐公司(Bio Rad))分析基因表达的变化，并使用2^ΔΔCT方法使用GAPDH/β-肌动蛋白作为管家基因计算表达的倍数变化，并用未经处理的对照物进行归一化。

体外通透性研究：为了进行体外细胞通透性研究，将Caco2细胞或HT29细胞(2×10⁴细胞/cm²)接种在24孔板中(康宁公司；美国)在聚酯膜过滤器上(孔径0.4μm，表面积1.12cm²)(KOWAPRADIT等人,(2010)“水溶性季铵壳聚糖衍生物的肠道上皮细胞(Caco-2)单层的体外通透性增强(In vitro permeability enhancement in intestinalepithelial cells(Caco-2)monolayer of water soluble quaternary ammoniumchitosan derivatives)”,《Aaps医药科技(Aaps Pharmscitech)》,第11卷,第497-508页。将培养基添加到顶室和基室两者，并且对于Caco2细胞，每隔一天更换一次培养基，直到21天；或者对于HT29细胞，每隔一天更换一次培养基，直到5-7天。对于Caco2细胞，使用EMD密理博米利塞尔-ERS2伏特欧姆计(EMD Millipore Millicell-ERS2 Volt-Ohm Meter)(密理博公司(Millipore))计算跨上皮电阻(TEER)。将表现出大于600Ω.cm²的过滤器(具有细胞单层)用于通透性研究。在细胞(单层细胞)达到期望的融合度之后，将细胞用媒剂(0.01％DMSO)、UroA(50μM)和UAS03(50μM)预处理24小时。在处理之后，将单层用PBS洗涤以去除任何残余药物，并且向每个孔添加200μL LPS(在HBSS中，50ng/ml)并温育2小时。在LPS处理之后，将单层用PBS洗涤两次，并且添加200μL FITC-葡聚糖(FD-4；美国西格玛奥德里奇公司)溶液(在HBSS中，1mg/mL)。在2小时之后，从基室中取出样品，并使用荧光96孔板读板仪分别在480和525nm的激发和发射波长下测定FD4浓度。

RNA测序：从用媒剂和UroA(50μM)(n＝3)处理24小时的HT29细胞中分离总RNA，并且使用基于Trizol的裂解，然后使用凯杰RNeasy(Qiagen RNeasy)试剂盒分离RNA。使用安捷伦生物分析仪2100(Agilent Bioanalyzer 2100)系统(加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司(Agilent Technologies,Santa Clara,CA))检查所分离的RNA的完整性(RIN>9.5)，并使用Qubit荧光测定(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific,Waltham,MA))对所分离的RNA进行定量。按照因美纳公司的TruSeq StrandedmRNA LT文库制备方案(加利福尼亚州圣地亚哥的因美纳公司(Illumina Inc.,San Diego,CA))使用1μg总RNA制备富含聚-A的mRNASeq文库。将所有15个样品分别进行条形编码，并使用用于因美纳KAPA文库定量试剂盒(KAPA Library Quantitation Kit for Illumina)平台(马萨诸塞州威明顿Kapa生物系统公司(Kapa Biosystems,Wilmington,MA))结合安捷伦生物分析仪DNA 1000(Agilent Bioanalyzer DNA 1000)分析(加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司)进行定量以测定片段大小。平均片段大小为约300bp。将1.8pM含1％PhiX掺入物(PhiX spike-in)的合并文库加载到一个NextSeq 500/550 75循环高输出试剂盒v2(High Output Kit v2)测序流动池上，并在因美纳NextSeq 500测序仪上进行测序。使用FASTQC(版本0.10.1)(ANDREWS(2014)“FastQC：一种用于高通量序列数据的质量控制工具(FastQC:A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data)”)检查1×75bp序列的质量。跨读段的整个长度，如果中位数质量评分高于30(错误概率＝0.001，或预计1,000分之1个碱基识别是不正确的)，并且在预期存在质量下降的读段末尾，如果较低分位数高于评分20(错误概率＝0.01)，则不必进行修整。使用tophat2(版本2.0.13)将每个样品的原始读段直接与智人(hg38)参考基因组装(hg38.fa)进行比对(KIM等人,(2013)“TopHat2：在存在插入、缺失和基因融合的情况下准确比对转录组(TopHat2:accuratealignment of transcriptomes in the presence of insertions,deletions and genefusions)”,《基因组生物学(Genome biology)》,第14卷,文章R36)，从而生成bam格式的比对文件。任选的参数包含-no-coverage-search和-library-type fr-firststrand。使用人ENSEMBL(FLICEK等人,(2014)“Ensembl 2014”《核酸研究(Nucleic Acids research)》,第42卷,第D749-D755页)转录组gtf v82进行转录物鉴定，从而产生60,903个总基因。平均每个样品比对2600万个读段，其中平均比对率为97％。进行序列作图后，使用tuxedo程序套件(包含cuffdiff2(版本2.2.1)和任选的参数-library-type fr-firststrand来测定差异表达的基因(TRAPNELL等人,(2013),“使用RNA-seq对转录物分辨率的基因调节进行差异分析(Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq)”,《自然-生物技术(Nature biotechnology)》,第31卷,第46-53页；TRAPNELL等人,(2012年)“使用TopHat和Cufflinks进行RNA-seq实验的差异基因和转录物表达分析(Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experimentswith TopHat and Cufflinks)”,《(自然-实验室指南(Nature Protocols)》,第7卷,第562-578页)。RNA-seq数据保存在基因数据库(GEO#GSE113581)中。

免疫印迹(蛋白质印迹)：使用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(美国西格玛奥德里奇公司)从结肠组织/细胞中收集总蛋白裂解物，并使用BCA蛋白定量试剂盒(赛默科技公司)按照说明手册对其进行定量。将总蛋白(20-50μg)在NuPAGE^TM 4-12％Bis-Tris凝胶(诺维克斯生命科技公司(Novex Life Technologies))上拆分，并转移到聚偏二氟乙烯膜(0.22μm孔；美国密理博公司)上。在用5％(w/v)脱脂奶粉(含1X TBS)封闭1小时之后，然后将膜与相应抗体在4℃下温育过夜(相应抗体的稀释度在表A1中给出)。第二天，探测与辣根过氧化物酶缀合的相应次级抗体，并使用化学发光底物检测蛋白质条带(ImageQuant LAS4000)。使用ImageJ软件对条带进行密度测定分析。从克鲁兹生物技术公司(Santa CruzBiotechnologies)(美国)购买Cldn4、Ocln、Cldn1、Cyp1A1、AhR、HO1、NQO1、Keap1、β-肌动蛋白和核纤层蛋白B(Lamin B)的抗体，并且从诺维斯生物制剂公司(Novus Biologicals)(美国)购买Nrf2的抗体。表A1中提供了抗体的来源和列表。

表A1：用于蛋白质印迹的抗体的列表。

共焦成像：将HT29或CaCo2或BMDM细胞(50,000个细胞/孔)平板接种在8孔分室型载玻片(154534PK；赛默飞世尔科技公司)上，使其生长过夜。将细胞用媒剂(0.01％DMSO)或UroA(50μM)或UAS03(50μM)诱导，持续期望的时间点，并用冷的甲醇将其固定。用相应抗体(1:200稀释)，然后用荧光标记的(对于AhR为Alexa flour594，对于Nrf2和Cldn4为Alexaflour 488)次级抗体(1:500稀释；赛默飞世尔科技公司)对AhR或Nrf2或Cldn4进行染色。将核用DAPI(西格玛奥德里奇公司)染色。使用尼康A1R共焦显微镜，使用具有适当激光通道的60X放大透镜来捕获共焦图像。

AhR报告基因测定：使用AhR报告基因测定系统(Indio生物科学公司(IndioBiosciences))进行AhR报告的测定。在试剂盒中提供AhR报告基因细胞(在AhR启动子下表达荧光素酶)以及阳性对照物MeBio(AhR配体)化合物。将细胞用媒剂或UroA或UAS03或鞣花酸或MeBio处理6小时，并根据制造商的说明测量发光。

Nrf2报告基因测定：从开曼化学公司(Cayman Chemicals)获得ARE-荧光素酶质粒载体。使用脂质体3000试剂(赛默飞世尔科技公司)以50％融合度转染HT29细胞。简而言之，将细胞接种在6孔板(0.5×10⁶个细胞)中，并使其生长24小时。在不存在FBS的情况下，将含1μg质粒DNA和转染试剂的转染复合物添加到每个孔中。在6小时之后，添加含10％FBS的培养基，并将细胞温育另外16-18小时。将这些细胞用媒剂(0.01％DMSO)或UroA(50μM)或UAS03(50μM)或萝卜硫素(10μM)处理24小时。在与诱导剂一起温育后，使细胞裂解，并使用多孔板光度计(BMG LABTECH公司(BMG,LABTECH))用萤光素酶测定系统(普洛麦格公司)测量萤火虫萤光素酶活性(发光)。

测量Cyp1A1酶活性(离体)：将小鼠每日以所指示的浓度通过口服或腹膜内途径用媒剂或UroA或UAS03、BNF或FICZ处理，持续一周。在一周之后，对小鼠实施安乐死，并切除结肠和肝组织。使用以下程序制备这些组织的微粒体(SINGH等人,(2013)“针对斯普拉格-道利大鼠的P-糖蛋白和细胞色素P450 3A对假马齿苋的记忆增强性临床上可获得的标准化提取物的评估(Evaluation of memory enhancing clinically available standardizedextract of Bacopa monniera on P-glycoprotein and cytochrome P450 3A inSprague-Dawley rats)”,《公共科学图书馆·综合》,第8卷,文章e72517)。对于肝微粒体，首先向肝灌注0.9％氯化钠溶液并将其切除。用棉纸吸除粘附的血液和盐水，并使组织在组织均质缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4和250mM蔗糖)中均质化。将匀浆在4℃下以10,000xg离心30分钟。将获得的上清液在4℃下以105,000x g进一步离心60分钟。将沉淀物用均质缓冲液洗涤，并在4℃下再次以105,000x g离心60分钟。将沉淀物悬浮于均质缓冲液中并且用于蛋白质和CYP测定。为了制备肠道微粒体，将肠取出并用0.9％氯化钠洗涤。将肠纵向切割开以暴露粘膜层，并在载玻片的帮助下刮取粘膜。将所刮取的组织收集在均质缓冲液(含甘油(20％v/v)、蛋白酶抑制剂(1％)和肝素(3U/ml)的50mM Tris-HCl缓冲液)中。使此悬浮的粘膜均质化并在4℃下以10,000x g离心20分钟。将所获得的上清液在4℃下以105,000xg进一步离心60分钟。将沉淀物用缓冲液洗涤并在4℃下再次以105,000x g离心60分钟。将沉淀物悬浮于均质缓冲液中并且用于蛋白质和CYP酶测定。

乙氧基试卤灵-O-脱乙基酶(EROD)测定：将微粒体蛋白(0.5mg)与含乙氧基试卤灵(0.01mM)的200μL Tris缓冲液(0.1M，pH 7.4)混合。为了开始反应，添加NADPH(0.1mM)并在37℃下温育10分钟。在10分钟之后，通过添加等体积的乙腈使反应终止，并将反应混合物在4℃下以13000x g离心10分钟。使用上清液通过测量荧光(激发：530nm，发射：580nm)来测定试卤灵。使用纯试卤灵(西格玛奥德里奇公司)产生标准曲线。

P450-Glo Cyp1A1发光测定：根据制造商的说明，将上述微粒体(20μg)用于P450-Glo Cyp1A1发光测定。

体外测量Cyp1A1酶活性。EROD测定：将媒剂、UroA和UAS03处理(24小时)的HT-29细胞(15,000个细胞/孔)用HBSS缓冲液冲洗，并且然后添加新鲜的HBSS缓冲液以及5μM的7-乙氧基试卤灵。将细胞在37℃下进一步温育1小时。在温育时间之后，测量荧光(激发：530nm，发射：580nm)，并从校准标准品计算形成的产物(试卤灵)，并用蛋白质浓度进行归一化。

P450-Glo Cyp1A1发光测定：将HT29细胞(25,000个细胞/孔)平板接种在48孔板中。然后，将细胞用UroA(0.1、1、10、25和50μM)或UAS03(0.1、1、10、25和50μM)或FICZ(0.1、1、10、25和50nM)处理24小时。在处理之后，将细胞洗涤以去除任何残余药物，并且含Cyp1A1底物的新鲜培养基(按照随试剂盒目录号V8751提供的方案；普洛麦格公司)，持续3小时。在温育之后，从每个孔中取出25μl培养基并将其转移到96孔白色不透明板中，并添加25μl荧光素检测试剂以引发发光反应，并将板在室温下温育20分钟。在温育之后，在光度计中记录发光。数据报告为相对于媒剂处理的倍数变化。

小干扰RNA(siRNA)介导的敲落实验：从傲锐东源公司(Origene)购买AhR siRNA(SR300136)和Cyp1A1 siRNA(SR301093)。对于敲落实验，将HT29细胞(0.5×10⁶细胞/孔)平板接种在6孔板中并生长24小时。按照给出的指示，使用RNAiMAX试剂(赛默飞世尔科技公司)将AhR、Cyp1A1和对照siRNA转染到HT29细胞中。在转染24小时之后，将细胞用媒剂(0.01％DMSO)、UroA(50μM)和UAS03(50μM)诱导24小时。在用诱导剂处理之后，使用RIPA缓冲液使细胞裂解，并使用总蛋白通过蛋白质印迹分析AhR、Cyp1A1和cldn4的表达。

通过CRISPR/Cas9方法进行Cyp1A1缺失：在转染前24小时，将HT29细胞(1.5×10⁵)平板接种在6孔中，在无抗生素的标准生长培养基中。在融合度为60％时，使用转染试剂(sc-395739；圣克鲁兹公司)将细胞与2μg CRISPR/Cas9 KO质粒(sc-400511-KO-2；圣克鲁兹公司)和HDR质粒(sc-400511-HDR-2；圣克鲁兹公司)中的每一种共转染。转染后96小时，用选择性培养基(含4μg/mL嘌呤霉素)替代培养基。通过荧光显微镜检查和蛋白质印迹(CYP1A1)确认转染。使用MoFlo XDP分选仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))对用于GFP和RFP的双阳性细胞进行分选。通过蛋白质印迹确认这些所分选中Cyp1A1的缺失。然后，将这些细胞平板接种在6孔板中，在标准培养基中，以评估UroA/UAS03对Cldn4表达的影响。在UroA/UAS03处理24小时之后，收获细胞中的蛋白质，并与正常的HT29细胞一起研究Cldn4的表达。

NF-κB EMSA测定：将RAW 264.7细胞或BMDM平板接种在100mm培养皿(1×10⁶)中，在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM中。使细胞生长24小时，并且在温育之后，在具有和不具有UroA(50μM)和UAS03(50μM)的情况下，将细胞用LPS(50ng/mL)处理6小时。在处理之后，取出培养基并用PBS洗涤。刮取细胞并使其沉淀在PBS中。丢弃上清液，并使用NE-PER核和细胞质(NE-PER Nuclear and Cytoplasmic)试剂盒(赛默科技公司；目录号78833)从沉淀物中分离核蛋白和胞质溶胶蛋白。使用用于核因子κBp65的具有IR荧光探针的非放射性EMSA试剂盒(Non-Radioactive EMSA Kits with IRFluo-Probes)(Viagene生物科技公司(Viagene Biotech Inc)，目录号IRTF282 60)对后来的核蛋白(2μg)进行EMSA。

结肠外植体培养：将来自野生型(C57BL/6)或Nrf2^-/-或AhR^-/-小鼠的结肠组织片(长度为0.5-1cm)在存在媒剂(0.01％DMSO)、UroA(50μM)或UAS03(50μM)的情况下在潮湿气氛中在完全DMEM-高葡萄糖培养基(补充有10％胎牛血清、1X青霉素-链霉素溶液)中一式三份地培养24小时。处理组织以进行蛋白质制备(含RIPA和缓冲液的组织裂解物)或总RNA分离。使用这些组织裂解物或RNA测定Nrf2、Cldn4和AhR的表达。

用于RNA和蛋白质分析的组织处理：如结果部分所描述的对小鼠进行处理。通过CO₂窒息和随后的颈椎脱臼法(cervical dislocation)对小鼠实施安乐死。解剖出结肠，并用冷PBS(含PMSF和原钒酸钠)冲洗腔内容物。将结肠的一小部分在液氮中速冻并储存在-80℃下以供RNA分析。为了制备蛋白质样品，纵向打开结肠并使用预冷的载玻片将粘膜刮取在冰冷的1X PBS中，并将粘膜在4℃下以300x g离心10分钟。丢弃上清液，并将沉淀物悬浮于RIPA缓冲液(含1X蛋白酶抑制剂)中并高速涡旋。在冰上温育30分钟之后，将样品在4℃下以13,000x g离心20分钟。收集上清液，并使用BCA蛋白质定量试剂盒对蛋白质进行定量。将裂解物适当地用于蛋白质印迹。

28天重复剂量毒性研究：为了评估UroA和UAS03的毒性，进行28天重复剂量毒性研究。每日用UroA(20和40毫克/千克/天)和UAS03(20和40毫克/千克/天)饲养小鼠(口服强饲)，持续28天。每周评估体重、食物和水的摄入量。在28天之后，处死小鼠，并对所有主要器官进行大体检查。收集血液以获得血清。按照说明手册使用ALT/AST试剂盒(BioVision公司(BioVision))分析血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。

2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导性结肠炎：将雄性C57BL/6或Nrf2^-/-小鼠(6-8周龄小鼠)用氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/12.5mg/kg IP)混合物麻醉，并施用单剂量的含TNBS(2.5毫克/小鼠；美国西格玛奥德里奇公司)的50％乙醇。在施用TNBS之后，将小鼠保持倒置30-60秒，以确保TNBS在结肠中的正确分布。对照组接受不含TNBS的50％乙醇。将具有TNBS的小鼠随机分成三组，即，媒剂(0.25％羧甲基纤维素钠(CMC))、UroA和UAS03。将UroA或UAS03以期望的浓度重悬于0.25％钠-CMC中。以期望的浓度(4或20毫克/千克/体重)以100μl向小鼠口服给予Veh或UroA或UAS03。在TNBS施用12小时之后开始处理，并且此后每12个小时进行处理，直至72小时。实验在TNBS 60小时后终止，其中涉及AhR^-/-小鼠。在一些实验中，在TNBS施用12小时后仅进行一次处理。在TNBS/乙醇处理80小时之后，对施用TNBS的小鼠和对照小鼠实施安乐死以收集组织和血浆。检查小鼠的结肠炎表型。

DSS诱导性结肠炎：通过在饮用水中给予3％(w/v)结肠炎级DSS(MP生物医药公司(MP Biomedicals))来诱导小鼠的急性实验性结肠炎，持续7天。对照动物接受不含DSS的饮用水。将所有结肠炎组小鼠随机分成三组，即，DSS处理的第4天和第6天的媒剂处理(0.25％Na-CMC)、UroA(20毫克/千克/天)和UAS03(20毫克/千克/天)。在7天之后，使动物回到常规水，持续7天的时段。对于慢性DSS结肠炎模型，使用三个2.0％(w/v)DSS循环，并且每个DSS循环由7天和随后的10天常规水组成，并且在DSS循环的每个第4天和第6天，用UroA(20毫克/千克/天)来处理小鼠。

结肠炎严重程度的评估和组织收集：每日评估小鼠的体重、粪便稠度和直肠出血的变化，并给出评分并将评分组合以获得疾病活动指数(MURTHY等人,(1993)“通过结肠内环孢菌素治疗葡聚糖硫酸钠诱导性鼠结肠炎(Treatment of dextran sulfate sodium-induced murine colitis by intracolonic cyclosporin)”,《消化系统疾病和科学(DigDis Sci)》,第38卷,第1722-1734页)。在安乐死后，将结肠取出，并用PBS(含1mM PMSF和0.2mM原钒酸钠)冲洗。测量结肠长度和结肠重量，并切除结肠的一小部分用于髓过氧化物酶(MPO)活性测定和RNA分离。将用于MPO和RNA提取的组织在液氮中速冻，并保存在-80℃下，直至进一步分析。将用于组织学检查的组织储存在10％磷酸盐缓冲盐水福尔马林中。收集血液，并通过以3500x g离心15分钟来分离血清。根据制造商的说明书，通过ELISA测量血清细胞因子(IL-6、TNF-α；百进生技公司)和趋化因子(CXCL1；R&D系统公司)水平。

体内肠道通透性测定：使用FITC-葡聚糖(MW 4000；FD4，美国西格玛奥德里奇公司)通过体内肠道通透性来评估肠屏障功能(FURUTA等人,(2001)“肠三叶因子的缺氧诱导因子1依赖性诱导在缺氧期间保护屏障功能(Hypoxia-inducible factor 1-dependentinduction of intestinal trefoil factor protects barrier function duringhypoxia)”,《实验医学杂志(J Exp Med)》,第193卷,第1027-1034页)。简而言之，向小鼠口服施用FITC-葡聚糖(60毫克/100克体重)。在安乐死前使小鼠禁食4小时。使用血清中FITC-葡聚糖的标准曲线(激发：485nm；发射：525nm；BMG LABTECH公司)测定血清中FITC-葡聚糖的浓度。

髓过氧化物酶(MPO)活性：使用以下程序测定结肠中的MPO活性(KIM等人,(2012)“在DSS诱导性IBD模型中调查肠道炎症(Investigating intestinal inflammation inDSS-induced model of IBD)”,《可视实验期刊(J Vis Exp.)》,第60卷,文章e3678(6页))。简而言之，将结肠组织在pH 6.0的含0.5％(w/v)溴化十六烷基三甲铵(H6269；美国西格玛奥德里奇公司)的50mM PBS中均质化。此匀浆经历3个冻融循环和超声处理10-15秒以获得均匀的悬浮液。在4℃下以13000x g离心20分钟之后，收集此悬浮液的上清液。然后，将上清液(10μl)添加到含0.167mg/ml邻联茴香胺(美国西格玛奥德里奇公司)和0.0005％H₂O₂(美国西格玛奥德里奇公司)的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)中，并且以2分钟的间隔获得450nm下的吸光度(BMG LABTECH公司)。通过考虑一个MPO单位(U)＝用摩尔消光系数1.13×10^-2纳米/分钟拆分的1μmol H₂O₂并且通过使用[ΔA(t₂-t₁)]/Δmin×(1.13×10^-2)公式计算每个样品中的MPO来测定每个样品中的MPO单位数，并且将MPO单位数相对于每毫克组织进行归一化。

组织病理学：将收集的结肠组织在10％缓冲甲醛溶液中固定过夜，并且对固定的组织进行标准组织病理学处理。简而言之，在固定之后，将组织脱水并用二甲苯清洁，然后进行石蜡包埋。切下5μm的石蜡切片(徕卡切片机(Leica microtome))并通过H&E染色进行染色。使用Aperio Scanscope捕获H&E图像。使用Erben等人所描述的指数评分对H&E切片进行盲目评分(ERBEN等人,(2014)“小鼠模型中肠道炎症的组织形态学评估指南(A guide tohistomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models)”,《国际临床和实验病理学杂志(Int J Clin Exp Pathol)》,第7卷,第4557-4576页)。

除非另有说明，否则在下文讨论的结果中使用的方法是实施例组A中讨论的方法。

实施例组B

UroA和UAS03的合成和抗炎活性

UroA(3,8-二羟基-6H-二苯并[b,d]吡喃-6-酮)具有内酯(环状酯键)，所述内酯连接两个单羟基苯环，从而产生平面结构(图1A)。胃pH或消化酶可以水解内酯环，这会打开环，从而导致失去平面结构并可能失去其活性(在不希望受理论束缚的情况下)。为了产生更稳定且可能更强效的化合物，合成不可水解的环状醚衍生物UAS03(6H-苯并[c]色烯-3,8-二醇)(图1A)。在胃pH和消化酶的条件下检查两种化合物的稳定性。结果表明，UAS03在胃pH值下以及在存在胃酶(例如，酯酶和蛋白酶)的情况下确实稳定(图1A)。UroA和UAS03两者均降低了小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)中的LPS诱导性IL-6和TNF-α，其中UAS03在纳摩尔浓度下表现出抗炎活性(图1B)。接下来，在LPS诱导性腹膜炎小鼠模型中体内检查UroA和UAS03的抗炎活性。UroA或UAS03处理降低了血清IL-6和TNF-α水平的LPS诱导性升高(图1C)。这些结果表明，UAS03是UroA抗炎活性增加的强效结构类似物。

UroA/UAS03诱导紧密连接蛋白

由于微生物代谢物非常接近肠上皮，所以推测(在不希望受到理论的束缚的情况下)代谢物可能直接影响上皮细胞功能。为了检查这种效果，对暴露于UroA的上皮细胞系(HT29)进行RNA-Seq分析。如方法中所描述的进行分析，并且为了测定差异基因表达的显著性，使用cuffdiff2算法。基于未校正p值截止值0.05，测定1,960个基因由于HT29细胞中的UroA处理而差异表达。进一步限制此列表，发现437基因在经UroA处理的HT29细胞中以<0.05的FDR校正的q值差异表达(图1D)。使用独创性途径分析(IPA)软件使用这些限制性基因列表进行途径分析(图1D)。真核起始因子2(eIF2)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和线粒体功能障碍途径以前3个途径的形式出现。需要在结肠上皮功能的背景下测定UroA对mTOR和eIF2途径的影响。RNA-Seq分析显示，细胞色素P450 1A1(Cyp1A1)是前3个UroA上调基因之一。途径分析进一步表明Nrf2和AhR信号传导途径位于前25位(图1D)。推测(在不希望受到理论的束缚的情况下)调节屏障功能有时可以有助于减轻IBD。因此，在RNA-Seq数据中检查紧密连接蛋白的表达，并且发现闭合蛋白4(Cldn4)在UroA处理的细胞中有所上调(图1E-F)。除了Cldn4和Cyp1A1之外，UroA也增加了血红素加氧酶1(HMOX1或HO1)的表达(图1E-F)。HO1是Nrf2依赖性基因，其可以发挥一些有益的活性，包含去除毒性血红素、防止氧化应激、调节细胞凋亡和炎症。基于这些观察，假设UroA和UAS03可以诱导紧密连接蛋白并通过AhR和Nrf2途径增强屏障功能。

独创性途径分析(IPA)显示了Nrf2和AhR信号传导途径的富集(图1D)，从而支持这些途径在UroA信号传导中的作用。IBD的潜在治疗途径是增加屏障功能的能力。因此，令人感兴趣的是，观察到在UroA处理的细胞中紧密连接蛋白Cldn4的表达增加。尽管在RNA-seq数据集中在统计学上不显著，但使用实时PCR进一步观察到另外的紧密连接蛋白ZO-1和Ocln1的表达增加(图1G)。在HT29和另一种结肠上皮细胞系Caco2两者中，通过蛋白质印迹(图1H)和Cldn4通过共焦成像(图1I)确认UroA或UAS03使这些蛋白质的水平升高。进一步地，观察到用UroA/UAS03处理的小鼠的结肠中Cldn4的表达升高(图1J)。在跨孔板中使用体外FITC-葡聚糖通透性测定检查紧密连接蛋白增加的功能结果。如图1L所示，用UAS03或UroA预处理Caco2或HT29细胞抑制了LPS诱导的FITC-葡聚糖泄漏到底室中。总体而言，这些结果表明，用UroA/UAS03进行的处理增加了紧密连接蛋白的表达，从而可能增强肠屏障完整性。

AhR介导UroA/UAS03的活性

RNA-Seq数据和实时PCR数据表明，UroA上调了Cyp1A1(图1E-F，图2A-B)。进行P450-Glo Cyp1A1测定(图2C)以及7-乙氧基试卤灵-O-脱乙基酶(EROD)测定(图2D)，以测定Cyp1A1酶活性是否受到类似影响。UroA/UAS03诱导了结肠上皮细胞的Cyp1A1活性(图2C和图2D)。由于Cyp1A1是AhR信号传导的下游靶标，因此检查了UroA/UAS03是否通过AhR介导其作用。在这些测定中，利用强效的AhR配体[2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英(TCDD)或6-甲酰基吲哚并[3,2-b]咔唑(FICZ)和低亲和力AhR配体(β-萘黄酮(BNF)]将Cyp1A1活性与UroA/UAS03进行比较。在50μM下，UroA/UAS03以类似于低亲和力AhR配体BNF的方式激活Cyp1A1。如所预期的，与UroA/UAS03/BNF相比，即使在纳摩尔浓度下，高亲和力配体(如FICZ和TCDD)也显示出增加的Cyp1A1活性(图2C和图2D)。使用野生型和AhR^-/-小鼠测试UroA/UAS03是否在体内诱导Cyp1A1活性。如图2E所示，UroA/UAS03激活了野生型而非AhR^-/-小鼠的结肠和肝脏中的Cyp1A1活性。此外，与BNF和FICZ处理的小鼠相比，UroA/UAS03处理的野生型小鼠在结肠组织中显示出相对更高的Cyp1A1活性(图2F-G)。与通过口服途径递送的UroA/UAS03相比，通过腹膜内(i.p)递送的FICZ和BNF在肝中显示出更高的Cyp1A1活性(图2F-G)。这可以归因于首过效应。为了直接对施用途径进行比较，腹膜内递送UroA或UAS03或FICZ并测定Cyp1A1酶活性。如所预期的，相比UroA/UAS03诱导的5-6倍，高亲和力AhR配体FICZ在肝脏中诱导约30倍(图2H)。在结肠中，FICZ将Cyp1A1活性提高了约5倍，而UroA/USA03提高了仅约3倍。总之，这些结果表明，尽管在体内处于低水平，UroA/UAS03上调了Cyp1A1的表达并通过AhR增强了酶活性。

通过XRE-荧光素酶报告基因测定和AhR的核易位，在HT29细胞中检查UroA/UAS03对AhR的直接激活。数据表明，与引起更高水平的AhR激活(约15倍)的高亲和力配体MeBio相比，UroA/UAS03处理引起2到4倍的萤光素酶活性诱导(图2I)。UroA和UAS03两者均诱导AhR的核易位(图2J-K)。在用UroA或UAS03处理的小鼠中，AhR有所上调(图1K)。接下来，询问AhR或Cyp1A1是否参与UroA/UAS03介导的紧密连接蛋白Cldn4的上调。出于此目的，使用siRNA敲落来抑制AhR或Cyp1A1表达，并检查Cldn4表达。如图2L-O所示，UroA/UAS03似乎在AhR或Cyp1A1敲落细胞两者中均未诱导Cldn4。另外，还使用CRISPR/Cas9方法使在HT29细胞中的Cyp1A1缺失，并检查UroA/UAS03介导的活性。与亲本HT 29细胞相比，Cyp1A1的缺失未显示出对Cldn4的基础水平有影响(图2P)。如图2Q-S所示，UroA/UAS03似乎未使Cyp1A1缺失的细胞中的Cldn4或NQO1上调。这些结果表明，UroA/US03通过激活AhR-Cyp1A1依赖性途径来诱导紧密连接蛋白的表达。

UroA/UAS03通过Nrf2增强肠屏障功能

由于AhR似乎在UroA介导的活性中发挥作用，因此使用对乳腺癌细胞系MCF-7执行的ChIP-Atlas(<<http://chip-atlas.org/target_genes>>)分析现有的AhR-配体Chip分析(<<http://dbarchive.biosciencedbc.jp/kyushu-u/hg19/target/AHR.1.html>>)。分析表明Nrf2是AhR信号传导级联的靶标(图3A)。类似地，AhR还对紧密连接蛋白(如Ocln、TJP3、Cldn2、3和5)有影响(图3B)。此外，RNA seq数据的途径分析(独创性)还揭示AhR和Nrf2途径列在前25位。由于TCDD通过Nrf2途径介导其某些活性，因此假设UroA/UAS03可以通过激活AhR-Nrf2依赖性途径来诱导紧密连接蛋白。在结肠上皮细胞以及缺乏AhR和Nrf2的小鼠中测试此假设。用UroA/UAS03进行的处理使Nrf2的mRNA和蛋白水平两者上调(图3C和图3G)并诱导其在的HT29细胞中的核易位(图3H-I)。利用ARE荧光素酶测定对Nrf2启动子活性进行验证，其中尽管处于低水平，但类似于已知的Nrf2激活剂萝卜硫素(SFN)，在处理之后，UroA/UAS03增强发光(图3D)。在用UroA/UAS03处理的野生型小鼠的结肠(图1J-K)以及HT29细胞(图3E)中，Nrf2和其靶基因HO1有所上调。为了检查AhR-Nrf2途径在UroA/UAS03诱导的Cldn4上调中的精确功能和相互依赖性，利用来自C57BL/6(野生型，WT)、AhR^-/-和Nrf2^-/-小鼠的结肠外植体。NAD(P)H：醌氧化还原酶(NQO1)对细胞质2-电子还原酶进行编码，并且诱导由AhR和Nrf2途径两者共享。检查UroA/UAS03是否上调这些小鼠的结肠外植体中的NQO1的表达。用UroA/UAS03进行的处理诱导了WT结肠外植体中的Nrf2、NQO1和Cldn4的表达(图3J-N)。但是这些化合物似乎未诱导Nrf2^-/-和AhR^-/-结肠外植体两者的Cldn4和NQO1以及AhR^-/-小鼠结肠外植体中的Nrf2(图3J-N)，从而表明AhR和Nrf2表达可能需要UroA/UAS03介导的活性。对WT、AhR^-/-和Nrf2^-/-小鼠结肠外植体中的Cldn4和NQO1的表达的基础水平比较表明，AhR和Nrf2的缺乏会减少NQO1和Cldn4的表达(图3L)。数据表明Clnd4的表达在AhR^-/-和Nrf2^-/-中有所减少，但在Cyp1A1敲落细胞中未减少。

为了定义AhR和Nrf2对UroA/UAS03介导的紧密连接蛋白的上调的可能的体内需求，利用WT、Nrf2^-/-和AhR^-/-小鼠。检查这些小鼠的结肠组织中的Cldn4、NQO1的基础水平表达表明，AhR或Nrf2的缺乏降低了NQO1水平，但是未显示出Cldn4降低的统计学显著性(尽管有表达减少的趋势)。(图3Q)。每日用UroA/UAS03(口服，20毫克/千克体重)处理小鼠，持续七天，并且分析屏障功能。用UroA/UAS03进行的处理使WT小鼠的Nrf2和紧密连接蛋白(Cldn4、NQO1、Ocln、ZO1和TJP3)上调(图3O-T)。相比之下，UroA/UAS03似乎未诱导Nrf2^-/-和AhR^-/-小鼠的这些蛋白质(图3O-T)。在HT29细胞中也证实了UroA/UAS03诱导的NQO1表达(图3F)。总体而言，这些结果表明，AhR和Nrf2两者在UroA/UAS03介导的紧密连接蛋白和NQO1的上调中均起作用。

用UroA/UAS03进行的处理减轻结肠炎

在2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导性结肠炎模型中检查了UroA/UAS03调节的屏障功能的生理相关性(ANTONIOU等人,(2016)“TNBS诱导性结肠炎动物模型：概述(TheTNBS-induced colitis animal model:An overview)”,《医学和外科学年鉴(伦敦)(AnnMed Surg(Lond))》,第11卷,第9-15页)。用UroA/UAS03(20mg/kg，每12小时)进行的口服处理防止了TNBS诱导性体重减轻(图4A)、疾病活动指数(DAI)评分降低(图4B)和肠道通透性(图4C)。UroA/UAS03处理防止了TNBS诱导性结肠缩短(图4D-E)和体重-长度比降低(图4F)的，从而表明结肠炎症减少。如从髓过氧化物酶(MPO)活性(图4G)以及如IL-6、TNF-α、CXCL1和IL-1β(图4H)等作为溃疡性结肠炎的标志的血清炎症标志物可以明显看出，UroA/UAS03处理还减少了中性粒细胞浸润。与这些发现一致，对结肠切片的H&E分析显示组织损伤较少且炎症评分较低(图4I)。此外，UroA/UAS03还防止了TNBS诱导的这些小鼠的结肠中的Cldn4的下调(图4J)。进一步检查了UroA/UAS03处理的剂量和频率的影响以及其在减轻结肠炎中的预防功效。如图4K-P所示，UroA/UAS03通过4或20mg/kg体重的单次处理减轻了TNBS诱导的结肠炎。每个时间点的体重比较表明，所有组中的TNBS处理均引起体重减轻，并且处理似乎减少了体重减轻，但未达到显著水平(图4Q)。然而，处理显示出对其它参数的影响，如防止结肠缩短、阻断炎性介质。用UroA或UAS03补充野生型小鼠未表现出任何毒性迹象，如从其体重、CBC计数以及血清ALT和AST水平的变化中均未明显观察到的(图4R-S)。

由于UroA/UAS03通过上调紧密连接蛋白表现出屏障保护性活性，因此研究了定期暴露于这些代谢物是否对预防结肠炎具有持续的有益作用。在TNBS诱导性结肠炎模型中检查了UroA/UAS03的预防性活性。每日向WT小鼠口服饲养媒剂或UroA/UAS03，持续一周，然后施用TNBS以诱导结肠炎。这些小鼠未接受任何另外的UroA/UAS03。在图5A和图5H中示出了处理方案和体重百分比。类似于治疗方案，使预处理的小鼠免于TNBS诱导性结肠缩短和结肠炎症(结肠长度/重量)(图5B-D)。预处理还增强了屏障功能并减少了TNBS诱导性炎症(图5E-F)。这些结果表明，UroA/UAS03介导的肠屏障功能增强可能对预防结肠炎具有长期有益的作用。在治疗方案中，TNBS后24小时用UroA或UAS03处理小鼠，其中小鼠患上严重结肠炎。在此情况下，与媒剂处理相比，用UroA/UAS03进行的处理还通过减少结肠缩短、肠通透性和炎症逆转了结肠炎表型。

还在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导性结肠炎模型中检查了UroA/UAS03的治疗应用。DSS在化学上破坏上皮细胞屏障并导致细菌渗透增加，从而导致炎症和结肠组织损伤。如图2N-O所示，使用UroA/UAS03处理的小鼠免于3％DSS诱导性急性结肠炎。在疾病进展期间，UroA/UAS03处理小鼠显示出DAI评分的总体下降。在第15天实验结束时，与媒剂处理相比，UroA/UAS03处理防止了结肠缩短、降低了肠通透性并且减少了炎症(图5I-M)。进一步地，还在慢性DSS模型中检查了UroA/UAS03的治疗功效，其中在饮用水中向小鼠给予了4个为期7天的2％DSS循环，每个循环间隔14天(期间使用常规水)(图6A)。用UroA/UAS03进行的处理防止了DSS诱导性结肠炎，如从肠通透性下降(图6B)、结肠缩短减少(图6C-D)、结肠重量/长度比增加(图6E)、炎症减少(血清IL-6、IL-1β、TNF-α以及结肠组织MPO水平)(图6F-G)明显看出的。对这些小鼠的紧密连接蛋白的分析还表明，用UroA/UAS03进行的处理增强了Cldn4的表达(图6H)。这些结果突显了UroA/UAS03在保持屏障完整性和减轻结肠炎症方面的模型独立的有益活性。

UAS03/UroA介导的针对结肠炎的保护可以使用AhR-Nrf2途径

上文所描述的研究表明AhR-Nrf2途径在UroA/UAS03增强的屏障功能中的作用。为了检查这些途径在结肠炎中的相关性，测试了Nrf2(图7)和AhR(图8)的体内使用。用UroA/UAS03处理Nrf2^-/-小鼠似乎未恢复由TNBS诱导性结肠炎引起的体重减轻(图7A-B和图9A)或防止结肠缩短(图7C)。与媒剂处理相比，UroA/UAS03处理并未增强Nrf2^-/-小鼠的屏障功能，如从UroA/UAS03处理的小鼠中的类似的FITC-葡聚糖泄漏明显看出的(图7D)。这些结果表明，UroA/UAS03增强的肠屏障完整性涉及Nrf2的表达。UroA/UAS03部分降低了Nrf2^-/-小鼠的血清炎性介质，如IL-6和TNF-α水平(图7E)，从而表明UroA/UAS03可以以Nrf2独立的方式介导抗炎活性中的一些抗炎活性。为了定义AhR在UroA/UAS03介导的保护性活性中的作用，在AhR^-/-小鼠和野生型小鼠中执行了TNBS诱导性结肠炎模型(图8A)。如所预期的，AhR^-/-小鼠对TNBS诱导性结肠炎模型更敏感，如从体重的快速减轻中可以明显看出的(图8B和图9B)。因此，在TNBS施用60小时后终止了实验(图8A)。与野生型小鼠相比，用UroA/UAS03进行的处理似乎未防止AhR^-/-小鼠的结肠长度的缩短(图8C-D)。此外，UroA/UAS03似乎未纠正AhR^-/-小鼠的屏障功能障碍，如从体内通透性测定明显看出的(图8E)。对血清炎性介质的分析表明，UroA/UAS03似乎未减少AhR^-/-小鼠的IL-6并且略微减少了TNF-α，而如上文所观察到的，UroA/UAS03处理减少了野生型小鼠的IL-6和TNF-α(图8F)。基于这些结果，提出了UroA/UAS03通过AhR-Nrf2依赖性途径通过诱导紧密连接蛋白发挥保护性屏障功能活性(图8G)。

由于巨噬细胞可以是IBD中的结肠炎症的介质，因此测定UroA/UAS03介导的抗炎活性是否参与巨噬细胞的AhR-Nrf2途径。首先，检查了UroA/UAS03是否激活巨噬细胞的Nrf2依赖性途径。结果表明，用UroA/UAS03进行的处理上调了Nrf2表达并诱导了其核易位，以及上调了巨噬细胞中的Nrf2靶基因，如HO1表达(图9C-G)。进一步地，对来自WT、Nrf2^-/-和AhR^-/-小鼠的巨噬细胞的LPS诱导的IL-6产生的UroA/UAS03介导的下调的分析表明，相对于WT，LPS在Nrf2^-/-和AhR^-/-巨噬细胞中诱导高得多的IL-6水平(图8H)。UroA/UAS03还以AhR依赖性方式减少了巨噬细胞中的NF-κB激活(图9H)。与野生型相比，AhR^-/-BMDM对LPS刺激具有高应答性，如从NF-κB激活增加以及IL-6水平增加明显看出的(图8H和图9I)。尽管通过UroA/UAS03降低了Nrf2^-/-巨噬细胞中的IL-6水平，但与WT巨噬细胞中的LPS诱导的IL-6相比，这些降低后的水平仍然较高。当比较处理后的倍数减少(图9J-L)时，类似于WT，UroA/UAS03减少了Nrf2^-/-中的IL-6，从而表明在体内(TNBS模型)和体外BMDM中的非Nrf2依赖性抗炎活性(LPS诱导的IL-6)。相比之下，UroA/UAS03在至多30μM下未阻断AhR^-/-巨噬细胞中并且未阻断TNBS诱导的结肠炎模型中的AhR^-/-小鼠中的LPS诱导的IL-6产生，从而表明UroA/UAS03通过AhR依赖性方式介导抗炎活性。在50μM剂量下，AhR^-/-BMDM的IL-6水平略有降低，这可能表明未知的AhR独立的抗炎活性中的一些抗炎活性。此处呈现的结果突显了单个微生物代谢物通过激活AhR-Nrf2信号传导途径调节上皮细胞中的屏障功能，并且还以AhR依赖性途径调节抗炎活性。

讨论

除了通过增强抗炎活性之外，UroA和UAS03还通过增强屏障功能来提高总体肠健康。UroA/UAS03激活I期(AhR-Cyp1A1)和II期(Nrf2-抗氧化途径)代谢途径，以增强紧密连接蛋白的表达并抑制炎症。进一步表明，在预防和治疗环境中，用这些化合物进行处理减轻了结肠炎。

通过RNA-Seq分析寻找这些代谢物的上皮细胞功能的方法揭示了有关其功能以及潜在机制的若干线索。UroA/UAS03介导的紧密连接蛋白(例如，Cldn4、Ocln和ZO1)的上调以及对LPS诱导的上皮单层泄漏的保护表明这些代谢物显然在屏障功能的调节中发挥作用。紧密连接由跨膜蛋白(例如，咬合蛋白、闭合蛋白、连接粘附分子和三纤维素)以及外周膜蛋白(例如，ZO-1和扣带蛋白)两者组成，以调节细胞旁通透性并维持肠屏障功能。紧密连接的破坏导致屏障功能障碍并与IBD和其它病症有关。

RNA-seq研究和表达分析表明，除了Cldn4的上调之外，UroA还诱导结肠上皮细胞的Cyp1A1和HO1的表达。由于Cyp1A1和HO1表示I期和II期药物代谢途径的激活，因此这些结果表明AhR和Nrf-2涉及介导UroA/UAS03功能。AhR是一种核转录因子，其对外源性和内源性配体两者都作出应答，从而引起细胞特异性基因调节和细胞功能。AhR激活负责诱导多种I期和II期异源性化学代谢酶，如Cyp1A1。研究表明，UroA/UAS03处理诱导AhR的表达和核易位并且增强XRE靶基因的转录，并诱导Cyp1A1酶活性，而未表现出毒性。

UroA/USA03在缺乏AhR的细胞或AhR^-/-结肠外植体以及AhR^-/-小鼠中似乎未发挥其活性，从而表明AhR途径在介导UroA/UAS03活性中起作用。目前的研究突显了上皮细胞中调节紧密连接蛋白和屏障功能的此途径。

体外和体内研究表明，UroA/UAS03诱导结肠上皮细胞的Nrf2和其靶基因(如HO1和NQO1)的表达。此外，结果还表明，AhR-Cyp1A1-Nrf2途径在UroA/UAS03介导的紧密连接蛋白的上调中起作用(图2和3)。

在结肠炎模型中进行的广泛研究揭示，用UroA/UAS03进行的处理增强紧密连接蛋白，降低肠通透性，并且减少局部和全身性炎症，从而使结肠炎有所减轻(图4-8)。即使单剂量的UroA/UAS03也对TNBS诱导的结肠炎表现出治疗效果。观察到UroA/UAS03对肠屏障功能的预防性益处和对结肠炎发展的预防(图5)。在TNBS施用前用UroA/UAS03预处理的小鼠降低肠通透性(图5E)，这与紧密连接蛋白的表达的增加一致。尽管在TNBS施用后未接受另外的处理，但这些小鼠也得到免于疾病发展的保护，从而表明这些化合物的通过增强屏障功能实现预防性作用。此外，为期7天的每日补充UroA/UAS03诱导野生型小鼠的结肠中的AhR、Nrf2和Cldn4的表达，而不存在可观察到的毒性(图3T、图1J-K、图3O-S和图4R-S)，从而表明这些化合物的潜在转译应用。进一步地，用UroA/UAS03进行的处理还减轻慢性和急性的DSS诱导的结肠炎两者，从而表明这些代谢物的模型独立的有益活性(图6和图5I-M)。UroA/UAS03是和抑制DSS诱导的结肠炎的发病机理的BNF一样的低亲和力无毒AhR激动剂。

观察到与野生型小鼠以及Nrf2^-/-BMDM相比，Nrf2^-/-小鼠中的炎性介质的基础水平增加。进一步地，与野生型BMDM以及TNBS诱导的结肠炎模型相比，LPS的添加上调Nrf2^-/-BMDM中的IL-6。UroA/UAS03无法修复Nrf2^-/-小鼠的TNBS诱导的屏障功能障碍和结肠炎(图7)。

使用AhR siRNA、来自AhR^-/-小鼠的结肠外植体以及AhR^-/-小鼠中的体内处理证明了AhR在紧密连接蛋白的UroA/UAS03介导的上调中的作用。此外，UroA/UAS03似乎未减轻缺乏AhR的小鼠的TNBS诱导的结肠炎(图8)。UAS03似乎对用TNBS处理的AhR^-/-小鼠的体重的快速减轻具有一定保护作用。其似乎不能防止其它参数，如结肠长度缩短、通透性增加和炎性介质增加。

当前的研究突显了AhR-Nrf2在防止屏障功能障碍中的作用。UroA/UAS03可能通过双管齐下的作用机制发挥结肠炎保护性活性。这些化合物似乎对免疫细胞(例如，巨噬细胞)起作用，以防止LPS/细菌诱导的炎症并通过AhR-Nrf2途径表现出抗氧化活性。这些代谢物通过上调紧密连接蛋白直接影响肠上皮和肠屏障功能。屏障功能增强会减少肠中的细菌性泄漏，从而减少全身性炎症。除了抗炎活性和屏障保护性活性之外，UroA/UAS03还可以通过调节线粒体功能障碍来减少IBD。

目前的研究总结了在通过增强肠屏障功能和减少炎症来减轻IBD方面具有活性的UroA和UAS03。现有的IBD处理包含利用抗TNF-α抗体来减轻炎症；此处，建议除了抑制炎症之外，增强肠屏障功能可能为控制IBD提供更好的治疗选项。

实施例组C

UroA减少人原代单核细胞中的LPS和EtOH诱导的TNF-α。慢性酒精中毒患者的外周血单核细胞产生的自发性炎性介质，如TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-12增加。为了模拟此病状，将健康的外周血单核细胞暴露一周，并测试UroA/UAS03是否减少LPS诱导的TNF-α。研究表明，UroA减少长期暴露于EtOH的人单核细胞中的TNF-α(图11)，从而承认了其在离体人原代培养物中具有有益的抗炎活性。

UroA/UAS03上调TJ蛋白并防止LPS诱导的损伤：TJ蛋白(如Cldn4、ZO-1、Ocln)在维持肠上皮完整性和保护肠免于外部伤害(如LPS)方面发挥作用。调查UroA/UAS03对结肠上皮细胞、HT-29和Caco2细胞中的TJ蛋白调节的影响。在一系列体内和体外实验中，证明用UroA/UAS03进行的处理上调TJ蛋白并增强肠屏障功能。ALD与TJ破坏、通透性增加、炎症和内毒素血症相关。Ocln是在肠道上皮中表达的紧密连接蛋白并且在维持肠屏障功能中起作用。检查UroA/UAS03是否可以防止结肠上皮细胞中的Ocln的LPS(内毒素)耗竭。如图12所示，用LPS进行的处理降低Ocln的水平(图12A)，并且UroA/UAS03防止结肠上皮细胞中的Ocln的耗竭(图12B)。接下来，测试UroA是否防止酒精介导的上皮细胞损伤。出于此目的，在跨孔膜上利用Caco-2单层细胞，并进行跨上皮电阻(TEER)和FITC-葡聚糖通透性测定。

UroA上调TJ蛋白并防止EtOH诱导的损伤。接下来，测试UroA是否防止酒精介导的上皮细胞损伤。出于此目的，在跨孔膜上利用Caco-2单层细胞，并进行跨上皮电阻(TEER)和FITC-葡聚糖通透性测定。如图13所示，EtOH诱导单层Caco2细胞的损伤，并以时间依赖性方式诱导泄漏(图13A)。在尿石素当中，UroA是更好的防止EtOH诱导的通透性(图13B)的化合物并以剂量依赖性方式减少(图13C)。UroA防止EtOH或LPS或HMGB1诱导的上皮通透性：内毒素血症和肠屏障功能障碍与ALD的发病机理相关。肠屏障功能障碍会导致肠道通透性升高，从而增加内毒素的循环水平。内毒素(如LPS(代表PAMP)和HMGB1(代表DAMP))诱导若干种炎性细胞因子、趋化因子和ROS，从而进一步增强全身性炎症以促进ALD的发病机理。体外研究(图13D)表明，HMGB1或LPS增加肠上皮通透性，并且用UroA进行处理防止EtOH或LPS或HMGB1诱导的通透性。即使在较高的EtOH剂量(400mM)下，UroA也对通透性诱导(图13E)和TEER值增强(图13F)有保护作用。用UroA进行处理防止紧密连接蛋白的EtOH诱导的损伤，如从蛋白质印迹(图13G)和经染色的TJ蛋白、ZO-1和Ocln的共焦图像(图13H)看出的。

测试UAS03是否可以防止Caco2单层细胞的较高EtOH剂量(350mM)诱导的屏障功能障碍。如图14所示，UAS03和UroA防止了EtOH诱导的屏障功能障碍，如从证实TJ蛋白Ocln增加(图14C)的TEER增加(图14A)和通透性降低(图14B)看出的。

用UroA进行的处理减轻急性和慢性酒精性肝病。为了检查UroA在ALD中的治疗功效，采用由Gao B组开发的急性小鼠模型(NIAAA)(BERTOLA等人,(2013)“慢性和无节制乙醇饲养的小鼠模型(NIAAA模型)(Mouse model of chronic and binge ethanol feeding(the NIAAA model))”,《自然-实验手册(Nat Protoc.)》,第8卷,第3期,第627-637页)。在此模型中测试UroA的治疗功效。如图15所示，UroA降低酒精诱导的(急性模型，图15A)通透性(FITC-葡聚糖泄漏、粪便白蛋白水平-图15B-C)、两种全身性炎症(血清IL-6、TNF-α、IL-1β、内毒素-图15D-G)、循环血清ALT、AST水平(图15H-I)。UroA处理还减少肝中的TG积累(图15J)。UroA还防止肠处的TJ蛋白(ZO-1)破坏(图16)。

UroA防止慢性低剂量酒精诱导的肠屏障功能障碍和炎症。通过每日两次口服EtOH(3g/kg)持续5天来处理C57BL/6小鼠(每组n＝5)。EtOH处理前2小时口服给予UroA(20mg/kg)。评估血清和肝两者中的肠通透性和炎症参数(图17)。

用UAS03进行的处理改善慢性ALD：由于UAS03在减少炎症和通透性方面显示出较 高功效，因此仅以UAS03作为概念验证，在慢性ALD小鼠模型中进行实验(图18)。从杰克逊实验室购买雄性C57BL/6N(10周龄)，并使其适应成对饲养的流质饮食(Lieber DeCarli)，持续1周。在适应之后，以成对饲养(n＝5只小鼠/组)和酒精饮食(n＝10只小鼠/组)来饲养动物。简而言之，用含17％能量作为蛋白质、40％作为玉米油、7.5％作为碳水化合物和35.5％作为酒精(5％v/w，酒精饲养，AF)或等热量的麦芽糊精(成对饲养，PF)的饮食来饲养小鼠。在小鼠进行到5％酒精饮食之前，酒精浓度从1.6％(3天)渐变为3.6％(3天)并且到最终的5％，持续4周。UAS03组动物在开始酒精饮食之后每隔一天口服接受UAS03(20毫克/千克/天)(图18A)。使用0.25％羧甲基纤维素钠(CMC)作为媒剂处理。在4周之后对小鼠实施安乐死并测量结肠长度(图18B-C)、体内肠通透性(FITC-葡聚糖测定)、血清ALT、AST、内毒素、IL-6和TNF-α(图18E)。肝脏组织病理学分析表明，UAS03减少肝脂肪沉积，从而支持肝TG水平和脂肪变性(图18F)。肝组织中IL-6、TNF-α、MPO和三酸甘油酯(TG)的水平表明，用UAS03进行的处理下调这些小鼠的肝炎症和TG水平(图18G)。UAS03防止肠中的Ocln变质(图18H)，从而支持ALD小鼠中的UAS03处理组的肠道通透性降低。

AhR对ALD模型的UroA介导的保护起作用：为了解决AhR表达对于UroA介导的活性的作用，在C57BL/6J小鼠和AhR^-/-小鼠中进行急性ALD模型。在此实验中，小鼠(WT、AhR^-/-小鼠(n＝4/组))分别在第0小时、第12小时和第24小时用一半EtOH剂量(2.5g/kg)处理，并且然后在第2小时、第14小时和第26小时进行口服处理Veh(0.25％CMC)或UroA(20mg/kg)。如图19所示，这些小鼠耐受低剂量EtOH，并且UroA处理似乎未挽救EtOH诱导的肠泄漏(粪便白蛋白水平)、血清内毒素、TNF-α、ALT以及肝ALT水平。UroA下调AhR^-/-小鼠的TG水平，从而表明脂质代谢的AhR依赖性活性。

UroA处理防止EtOH诱导的结肠上皮连接蛋白：将结肠上皮细胞(T84细胞)用媒剂(0.05％DMSO)或UroA(50μM)处理1小时，然后用EtOH(40mM)处理6小时。将膜和胞质溶胶部分分离，并评估紧密连接(TJ)和黏着小带(AJ)和桥粒。从图20可以明显看出，UroA防止膜连接蛋白向胞质溶胶的EtOH诱导的内化。(即，单独的EtOH处理具有更多的胞质溶胶蛋白，而EtOH+UroA具有更多的膜部分)(图20)。

UroA防止CaCo-2细胞中的TNF-α和IFN-γ诱导的通透性：在存在或不存在UroA(50μM)的情况下，将跨孔膜孔上的单层CaCo2细胞用TNF-α(10ng/ml)和IFN-γ(10ng/ml)处理48小时。如SINGH等人,(2019)“通过Nrf2途径通过微生物代谢物增强肠屏障完整性(Enhancement of the gut barrier integrity by a microbial metabolite throughthe Nrf2 pathway)”《自然-通讯(Nat Commun)》,第10卷,第1期,文章89(18页)所描述的来测量TEER值和FITC-葡聚糖通透性；(图21)。

实施例组D

UAS03(醚)降低败血症死亡率。以20mg/kg的败血症剂量向C57B6/J小鼠腹膜内注射脂多糖。经处理的动物以20mg/kg腹膜内注射接受尿石素-A或UAS03(醚)。未经处理的败血症动物在50小时内显示出100％死亡率。用尿石素A处理的动物显示出20％存活率，而用UAS03(醚)处理的动物显示出90％长期存活率(图22)。

UAS03(醚)在败血症动物中的预防和治疗作用。以20mg/kg剂量向动物腹膜内注射LPS以诱导败血症。对于醚+LPS组，在LPS注射前1小时向动物给予UAS03(20mg/kg；腹膜内)。LPS+醚组在LPS注射后1小时接受UAS03。未经处理的败血症动物在50小时内显示出100％死亡率；用UAS03预处理的动物显示出70％存活率；而治疗组则显示出100％存活率(图23)。

UAS03减弱Snail转基因小鼠的硬皮病相关的血管通透性。使用UV分光光度计对从背部皮肤提取的伊文思蓝染料进行量热定量。用媒剂处理的Snail动物显示出的染料为对照动物的染料的3倍。用UAS03处理的动物显示出超过3倍的染料泄漏减少(图24)。这表明UAS03具有降低内皮血管通透性的能力。

Snail转基因小鼠的背部皮肤中的纤维化相关基因的表达。使用RT-qPCR测量背部皮肤中的1型胶原蛋白(Collagen 1)的mRNA水平。与对照动物相比，Snail媒剂在媒剂处理组的雄性和雌性两者中均表现出表达增加。在UAS03处理组中，雄性和雌性中的表达均减少。分别评估媒剂和药物处理的动物中的雄性和雌性的水平(图25)。此数据表明UAS03具有减少纤维化的能力。

UAS03显示出自噬诱导。通过细胞内红色和绿色斑点的存在来评估在化合物处理2小时之后的自噬诱导。在药物处理前48小时，用RFP-GFP-LC3质粒转染HeLa细胞。在药物处理2小时之后，将细胞固定并进行成像。LC3是一种在自噬体上表达的蛋白质并且被视为绿色斑点。当自噬体和溶酶体融合以形成自噬溶酶体时，其内部的酸性pH会引起GFP蛋白的降解，并且只有红色斑点可见(图26)。此数据表明UroA和UAS03具有诱导自噬的能力。

实施例组E

合成若干种化合物并以剂量依赖性方式测试其抗炎活性和对单胺氧化酶A(MAOA)和单胺氧化酶B(MAO B)的抑制活性。

筛选抗炎活性：将小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)平板接种在96孔板中以进行ELISA。为了评估抗炎性质，将BMDM仅用大肠杆菌源性脂多糖(LPS；O55:B5；西格玛公司)以50ng/mL的浓度刺激六小时或用大肠杆菌源性脂多糖与化合物的组合以所指示的浓度一式四份地刺激六小时。对于通过ELISA产生细胞因子，将上清液收集并在4℃下以12,000rpm离心10分钟以沉淀出任何细胞，并将细胞因子按照制造商的说明使用IL-6和TNF-α特异性ELISA试剂盒(百进生技公司)进行定量。LPS诱导的IL-6或TNF-α被认为是100％。

抗炎活性(图27-30)：炎症是若干种疾病的根本原因和促进因素，所述疾病包含但不限于炎性肠病、酒精性肝病、各种类型的癌症、关节炎、心血管疾病、神经障碍、败血症、肾相关、肺相关和衰老相关疾病。此处，筛选这些类似物的抗炎活性。鉴定此系列中的若干种化合物在小鼠骨髓源性巨噬细胞中显示出抗炎活性并阻断LPS诱导的IL-6和TNF-α。为了便于呈现，将LPS诱导的IL-6或TNF-α视为100％。发现与UroA(母体化合物)相比，UAS03、PKL3、PKL 4和PKL 17是有效的抗炎化合物。

总之，合成并鉴定若干种抗炎化合物作为涉及炎症的多种病症的潜在治疗剂。

化合物的单胺氧化酶A(MAO A)和单胺氧化酶B(MAO B)抑制活性：测定：简而言之，将5μg MAO-A和MAO-B分别与160和16μM MAO底物一起温育。在存在胶囊化合物的情况下在96孔白板中进行酶测定。对照反应含有等量的MAO缓冲液和同一百分比的溶剂。将反应板在37℃下温育60分钟。在温育期之后，通过添加荧光素检测试剂使反应停止。将丙炔苯丙胺(deprenyl)分别用作MAO-A和MAO-B的阳性对照物。用多模式微孔板读板仪测量产生的发光，并且其与MAO活性成正比。

考虑将MAO A和MAO B的抑制剂用于治疗阿尔茨海默氏病和帕金森氏病。利用纯MAO A和MAO B酶测试若干种化合物。发现若干种化合物抑制MAO A和MAO B酶的活性。图31示出了在100μM剂量下对这些化合物的初步筛选。

接下来，选择潜在的候选化合物(PKL3、4、5、12、13、14、15、16以及UroA、B、C)，并对MAO A和MAO B酶进行剂量依赖性(0.1、1、10μM)抑制活性(图32)。

图33示出了对抗炎活性的筛选。在具有或不具有化合物的情况下，将小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)用LPS(50ng/ml)刺激6小时。使用标准ELISA方法测量上清液中的IL-6和TNF-α水平。结果表示三个独立的实验，其中每个浓度一式三份。

图34示出了MAO酶在存在各种化合物的情况下的活性。图35示出了针对MAO-A和MAO-B活性测试的对化合物以及所测定的IC50和Ki值。

化合物增强内皮屏障功能并防止内皮屏障功能障碍：人类研究表明，即使少量消耗酒精也可能损害内皮屏障功能。急性酒精中毒可能诱导微脉管系统泄漏，并且直接暴露于内皮会导致破坏内皮完整性。已知循环内毒素水平(例如，LPS)和炎性介质(例如，IL-6和TNF-α)的水平增加会损坏内皮屏障，从而导致血管泄漏并会增强ALD中的全身性炎症和组织炎症。另外，内皮通透性增加会增强免疫细胞向肝的外渗，从而导致炎症增加。为了检查UroA/UAS03对内皮细胞通透性的影响，利用体内伊文思蓝通透性测定。简而言之，对C57BL/6小鼠(n＝4/组)腹膜内给予LPS(100μg)，然后在1小时和18小时之后用UAS03或UroA(20mg/kg)进行处理。对小鼠给予(静脉内)伊文思蓝(LPS处理后24小时)，并在30分钟后对小鼠实施安乐死，并使用甲酰胺从肺和肝组织中提取伊文思蓝。通过620nm下的OD测定伊文思蓝的水平。用UroA或UAS03处理的小鼠减少伊文思蓝的组织积累，从而表明可以防止LPS诱导的泄漏(图36A)。UroA/UAS03处理还降低血清和支气管肺泡灌洗(BAL)流体中的LPS诱导的TNF-α水平(图36B)。为了评估UroA或UAS03对内皮屏障功能的直接影响，使用体内迈尔斯(Miles)测定来测试血管通透性。使用血管内皮生长因子(VEGF)作为血管舒张剂。在此测定中，对C57BL/6小鼠(每组n＝3)给予媒剂或UroA或UAS03(20mg/kg；口服强饲)。在3小时之后，静脉内施用伊文思蓝(100μL 1％溶液)，然后皮内施用VEGF(2.5纳克/小鼠)或PBS(对照物)。在30分钟之后，对小鼠实施安乐死，并且如先前所描述的提取并估计注射部位周围的皮肤组织中的伊文思蓝的水平(图36C)。结果表明，用UroA/UAS03进行的处理防止VEGF诱导的内皮屏障泄漏(伊文思蓝水平降低)，而媒剂处理诱导血管泄漏，如从伊文思蓝增加明显看出的(图36C)。为了了解UroA/UAS03介导的内皮屏障功能的分子机制，测试这些化合物在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的作用。内毒素或炎性介质负责减少细胞-细胞和细胞-基质粘附，从而导致屏障间隙和通透性增加。VE-钙粘蛋白(CDH5)作为黏着小带(AJ)蛋白可以通过与相邻细胞的同型相互作用来维持内皮连接的完整性。如图36D-E所示，UroA或UAS03增加CDH5的表达，从而表明这些代谢物通过上调AJ潜在地增强内皮屏障完整性。此外，来自体外通透性测定的结果(与白蛋白结合的伊文思蓝)还表明UroA/UAS03降低HUVEC中的LPS(100ng/ml)诱导的屏障通透性(图36F)。

化合物对化学抗性癌症化学致敏：检查UroA和UAS03对5-氟尿嘧啶(5FU-5-氟-1H,3H-嘧啶-2,4-二酮)的化疗功效的影响。数据表明，5FU与UroA或UAS03的组合降低5FU耐药(5FUR)结肠癌细胞系的细胞活力，其中组合指数(CI)小于1表明其协同作用。UAS03在对5FU处理的化学致敏中更有效(高32倍)。用UroA进行的处理降低结肠癌细胞系中的P-糖蛋白(P-gp)、乳腺癌抗性蛋白(BCRP)的药物外排活性，并增强E-钙粘蛋白的表达，从而为化学致敏提供了潜在的作用机制。UAS03是强效的化学致敏佐剂：癌症疗法中的一个问题是对药物处理的化学抗性。研究UroA和其它化合物使结肠癌细胞对5FU处理化学致敏。图37中示出了来自代表性结肠癌细胞系(SW480)的增殖测定的结果。用UroA或UAS03进行的处理对细胞增殖的影响很小。用25μM和3.12μM 5FU进行的处理分别将细胞活力降低到63％、90％。当与单独的5FU处理相比时，向5FU处理中添加UroA或UAS03降低细胞活力(图37A)(抑制作用增加，图37B)。UroA与5FU(3.12μM)一起将细胞活力从90％降低到69％，而UAS03将细胞活力降低到40％，这表示对细胞增殖的抑制作用增加约6倍，即使在3.12μM 5FU下，也是如此。测试的最高5FU浓度100μM只能抑制最多60％癌细胞生长。而与UAS03组合时，即使在达到平稳的3.12μM 5FU浓度下，也抑制至多60％，从而表明化合物具有高效力(比达到类似效果的5FU药物浓度低32倍以上)。从等效线图(图37C)得出的Chou-Talalay组合指数(CI)值(<1表示协同作用)<0.5，从而表明其在抗增殖活性中具有协同作用。UroA还减少结肠癌细胞集落的形成，如从克隆发生测定明显看出的(图37D)。还在其它结肠癌细胞系(HT-29、HCT-116、Col205)中观察到了这些化合物的类似趋势(数据未示出)。亲本和5FU耐药(5FUR)细胞系中，UroA和UAS03与5FU的组合增强5FUR细胞对5FU处理的敏感性，其中CI值<1，从而表明其具有协同作用(数据未示出)。利用标准伤口愈合测定检查UroA与5FU的组合疗法是否阻断细胞迁移和细胞生长。如图38所示，与单独的化合物相比，UroA与5FU的组合抑制细胞生长和结肠癌细胞迁移到划伤处(右角图像)。

UroA/UAS03减少药物转运蛋白：癌细胞获得化学抗性表型的机制之一是通过诱导ATP结合盒(ABC)药物外排转运蛋白、BCRP和P-糖蛋白(P-gp)。因此，通过阻断其活性和/或下调BCRP的表达，P-gp可以逆转所述作用并使癌细胞致敏。证明UroA降低BCRP活性(数据未示出)。Rh123流出测定(图39)，UroA(50μM)阻断Rh123的流出(使Rh123保留在细胞中)。

UroA/UAS03处理降低5FU耐药(5FU R)结肠癌细胞的上皮-间充质转化(EMT)特征：检查5FU敏感(亲本)和5FU耐药(5FUR)HCT116结肠癌细胞系中的EMT标志物。如图40所示，与亲本细胞系相比，5FUR细胞显示ZO1、E-钙粘蛋白的表达减少并且β-连环蛋白和Snail的表达增加。这些分子的互相表达是EMT特征的标志。接下来，检查用UroA/UAS03进行的处理是否可以逆转5FUR细胞中的这些模式。从图41明显看出，即使在存在5FU的情况下，用UroA/UAS03进行的处理也上调ZO-1、E-钙粘蛋白，并下调Snail和β-连环蛋白。总体上，这些结果表明，除了抗增殖活性增强之外，UroA/UAS03还可以逆转5FUR结肠癌细胞中的EMT特征模式。癌细胞获得化学抗性表型的机制之一是通过诱导药物转运蛋白，如多药耐药相关蛋白2(MRP2)、ATP结合盒(ABC)药物外排转运蛋白、BCRP和P-糖蛋白(P-gp)。

5FU-R结肠癌细胞表达更高水平的MRP2(图42)，并且用UroA/UAS03进行的处理减少这些转运蛋白的表达(图43)。这可能使细胞内药物浓度增加，从而使得在用5FU和UroA/UAS03进行处理后，耐药性癌细胞的细胞死亡增加/增殖减少。

这些化合物还可以与化疗药物组合用于对化疗药物具有化学抗性的其它类型的癌症。另外，使用这些化合物可能有助于降低药物的剂量以获得类似的作用而不会由于较高剂量而产生主要副作用。

实施例组F

方案F1

1.合成(3-甲氧基苯基)溴化镁(2)；

对于具有水冷式冷凝器的100ml 2颈RB烧瓶中处于氮气下的催化量的I₂(碘)、镁2g(83.36mmol)于100ml无水THF中的搅拌溶液。经10分钟时段内向其中逐滴添加1-溴-3-甲氧基苯15.50g(83.36mmol)。在完全添加溴化合物之后，在室温下将其搅拌10分钟。在一段时间之后，溶剂将开始回流，这表明格氏试剂(Grignard reagent)的产生。如果逐渐形成更多的热量，只需用冰冷却即可，否则溶剂会回流一段时间，然后缓慢停止，最后可以观察到RB烧瓶内的灰白色格氏试剂。这种所产生的格氏试剂可以直接用于下一步骤。

2.合成1,2-双(3-甲氧基苯基)乙烷-1,2-二酮(3)；

对于先前制备的(3-甲氧基苯基)溴化镁于50ml无水THF中的搅拌溶液，向其中添加溴化铜10.24g(71.42mmol)、溴化锂6.2g(71.42mmol)，使用干冰丙酮混合物将反应混合物在-78℃下冷却。一旦温度达到-78℃，就缓慢添加草酰氯4.53g(35.71mmol)，使反应在室温下搅拌过夜。通过TLC监测反应的完成，一旦反应完成，就将反应冷却到0℃，并用饱和氯化铵水溶液淬灭。在减压下蒸发THF溶剂，用乙酸乙酯稀释反应混合物，用盐水、水洗涤有机层，并在无水硫酸钠上进行干燥，在减压下蒸发，以得到5g1,2-双(3-甲氧基苯基)乙烷-1,2-二酮(26％)。

质量；m/z：(M+H)＝271.2

1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ7.60-7.52(2H,m),7.45-7.41(2H,m),7.39-7.37(4H,m),3.84(6H,s)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):194.89,160.27,134.01,131.22,123.33,122.40,113.13,56.00。

3.合成2,7-二甲氧基菲-9,10-二酮(5)；

对于1,2-双(3-甲氧基苯基)乙烷-1,2-二酮5g(18.51mmol)于200ml无水二氯甲烷中的搅拌溶液。将反应混合物冷却到0℃，向其中添加氯化钛(IV)3.51g(18.51mmol)、氯化钼(V)5.05g(18.51mmol)，在室温下搅拌反应混合物过夜。通过TLC监测反应的完成。将反应混合物冷却到0℃，用甲醇缓慢淬灭，使反应混合物通过硅藻土，并在减压下蒸发，以得到粗制的2,7-二甲氧基菲-9,10-二酮。将粗产物使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液通过柱色谱法纯化，以得到纯的3g 2,7-二甲氧基菲-9,10-二酮(61％)。

质量；m/z：(M+H)＝269.2

1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ8.09-8.08(2H,m),7.42(2H,s),7.31-7.29(2H,m),3.86(6H,s)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):179.41,159.61,131.92,129.34,126.32,122.80,112.67,56.04。

4.合成2,7-二羟基菲-9,10-二酮(6)：

对于2,7-二甲氧基菲-9,10-二酮2g(7.46mmol)于100ml氯苯中的搅拌溶液，向其中添加无水氯化铝5.97g(44.77mmol)。将反应混合物在135℃下回流。通过TLC监测反应混合物的完成。将反应混合物倒入碎冰中，用乙酸乙酯萃取，用盐水、水洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥并在减压下蒸发，以得到粗制的2,7-二甲氧基菲-9,10-二酮。将粗产物使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液通过柱色谱法纯化，以得到纯的1.2g 2,7-二甲氧基菲-9,10-二酮(67％)。

质量；m/z：(M-H)＝239.2

1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ10.05(2H,s),7.92-7.90(2H,m),7.30(2H,s),7.11-7.09(2H,m)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):179.93,157.73,131.64,128.28,125.98,123.62,114.97。

5.合成(9E,10E)-9,10-双((2-羟乙基)亚氨基)-9,10-二氢菲-2,7-二醇(7)。

对于2,7-二甲氧基菲-9,10-二酮0.5g(2.08mmol)于50ml乙醇中的搅拌溶液。向其中添加催化量的乙酸、乙醇胺0.317g(5.20mmol)。将反应混合物在110℃下回流过夜。通过TLC监测反应的完成。在减压下蒸发反应混合物，用乙酸乙酯稀释反应混合物，用盐水、水洗涤乙酸乙酯层，并用无水硫酸钠干燥并蒸发，以得到粗制的(9E,10E)-9,10-双((2-羟乙基)亚氨基)-9,10-二氢菲-2,7-二醇。将粗产物使用氯仿和甲醇作为洗脱液用柱色谱法纯化，以得到纯的0.25g(9E,10E)-9,10-双((2-羟乙基)亚氨基)-9,10-二氢菲-2,7-二醇(36.2％)。

质量；m/z：(M-H)＝325.2

1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):9.99(2H,s),7.90-7.88(2H,m),7.40(2H,s),7.09-7.06(2H,m),5.58-5.57(2H,m),4.27-4.25(4H,m),3.48-3.46(4H,m)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):157.72,155.57,132.98,127.00,126.95,119.14,115.03,65.02,55.36。

6.合成(E)-2,7-二羟基-10-((2-羟乙基)亚氨基)菲-9(10H)-酮

对于2,7-二甲氧基菲-9,10-二酮0.5g(2.08mmol)于50ml乙醇中的搅拌溶液。向其中添加催化量的乙酸、乙醇胺0.152g(2.5mmol)。将反应混合物在110℃下回流过夜。通过TLC监测反应的完成。在减压下蒸发反应混合物，用乙酸乙酯稀释反应混合物，用盐水、水洗涤乙酸乙酯层，并用无水硫酸钠干燥并蒸发，以得到粗制的(E)-2,7-二羟基-10-((2-羟乙基)亚氨基)菲-9(10H)-酮。将粗产物使用氯仿和甲醇作为洗脱液用柱色谱法纯化，以得到纯的0.15g(E)-2,7-二羟基-10-((2-羟乙基)亚氨基)菲-9(10H)-酮(26％)。

质量；m/z：(M+H)＝284.2

1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):9.51(1H,s),9.45(1H,s),8.39-8.28(2H,m),7.20(1H,s),7.11(1H,s),6.99-6.97(1H,m),6.86-6.84(1H,s),5.58-5.57(2H,m),4.27-4.25(4H,m),3.48-3.46(4H,m)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):157.72,155.57,132.98,127.00,126.95,119.14,115.03,65.02,55.36。

7.合成2,2'-((1E,1'E)-(2,7-二羟基菲-9,10-二亚基)双(氮烷基亚基))双(丙烷-1,3-二醇)

1H-NMR(DMSO-d6,800MHz):9.50(1H,s),9.44(1H,s),8.34-8.29(2H,m),7.78(1H,m),7.23(1H,s),6.99(1H,s),6.85-6.84(1H,s),4.60-4.58(8H,m),3.76-3.75(2H,m)。

8.合成(E)-10-((1,3-二羟基丙-2-基)亚氨基)-2,7-二羟基菲-9(10H)-酮

1H-NMR(DMSO-d6,800MHz):9.50(1H,s),9.44(1H,s),8.34-8.29(2H,m),7.78(1H,m),7.23(1H,s),6.99(1H,s),6.85-6.84(1H,s),4.60-4.58(8H,m),3.76-3.75(2H,m)；13C-NMR(DMSO-d6,200MHz):157.72,155.57,132.98,127.00,126.95,119.14,115.03,65.02,55.36。

9.合成2,2'-((1E)-(2,7-二羟基菲-9,10-二亚基)双(氮烷基亚基))双(2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)

质量；m/z：(M-H)＝445.2

1H-NMR(DMSO-d6,800MHz):9.50(1H,s),9.44(1H,s),8.37-8.36(2H,m),7.98(2H,s),6.99-6.86(2H,s),4.73(6H,m),3.52-3.51(12H,m)；13C-NMR(DMSO-d6,200MHz):157.72,155.57,137.25,132.98,128.00,126.15,118.14,116.03,64.02,59.36。

10.合成(E)-10-((1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基)亚氨基)-2,7-二羟基菲-9(10H)-酮

质量；m/z：(M-H)＝342.2

1H-NMR(DMSO-d6,800MHz):9.77(1H,s),9.71(1H,s),7.94-7.91(2H,m),7.65(1H,s),7.11(1H,s),7.02-7.01(1H,m),6.91-6.89(1H,m),5.09-5.07(3H,m),3.82-3.81(6H,m)；13C-NMR(DMSO-d6,200MHz):167.33,157.01,155.42,133.52,132.76,129.80,127.04,122.20,121.06,118.16,115.54,109.44,65.10,59.34。

11.合成9,10-二亚氨基-9,10-二氢菲-2,7-二醇

质量；m/z：(M+H)＝239.2

1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):9.96(2H,s),8.99(2H,s),8.10-8.08(2H,m)7.95(2H,s),7.57(2H,s),7.09-7.07(2H,m)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):162.77,158.42,157.19,126.99,126.77,125.91,120.77,112.17。

12.合成二苯并[f,h]喹喔啉-6,11-二醇

质量；m/z：(M-H)＝261.2

1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):9.95(2H,s),8.99(2H,s),8.52-8.50(2H,m)8.42-8.41(2H,s),7.28-7.26(2H,m)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):156.74,144.41,140.96,129.94,124.76,124.50。

13.合成2-溴-6H-苯并[c]色烯-3,8-二醇

1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):10.27(1H,s),9.58(1H,s),7.79(1H,s),7.55-7.53(1H,m),6.75-6.73(1H,m),6.62-6.61(1H,m),6.53(1H,s),4.99(2H,s)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):158.74,153.41,126.56,123.32,115.86,111.88,105.11,68.25。

实施例组G

方案G1

1.合成1-(3-甲氧基苯基)-2-苯基乙烷-1,2-二酮

质量；m/z：(M+H)＝241.2

1H-NMR(DMSO-d6,800MHz):δ7.93-7.91(2H,m),7.80-7.79(1H,m),7.64-7.62(2H,m),7.54-7.52(1H,m),7.46(1H,s),7.43-7.39(2H,m),3.85(6H,s)；13C-NMR(DMSO-d6,200MHz):195.10,160.27,136.01,134.01,132.69,131.23,130.06,129.97,123.36,122.42,113.10,56.00。

3.合成2-甲氧基菲-9,10-二酮

质量；m/z：(M+H)＝239.2

1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ8.12-8.08(1H,m),7.83-7.81(2H,m),7.61-7.57(2H,m),7.36-7.34(2H,m),3.85(3H,s)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):179.41,159.61,131.92,129.34,126.32,122.80,112.67,56.04。

本公开中使用的标题并不意在表明与标题有关的所有公开内容均存在于以所述标题开头的部分中。在整个说明书中都可以找到有关任何主题的公开内容。

应注意的是，如“优选地(preferably)”、“通常(commonly)”和“典型地(typically)”等术语在本文中并非用来限制所要求保护的发明的范围或暗示某些特征对于所要求保护的结构或功能是关键的、必要的或者甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在突显可能或可能不在本发明的特定实施方案中使用的替代性或另外的特征。

除非另有说明，否则如本公开中所使用的，“一个或一种(a/an)”意指一个或多于一个。除非另有说明，否则如权利要求中所使用的，当与词语“包括”结合使用时，词语“一个或一种(a/an)”意指一个或多于一个。除非另有说明，否则如本公开或权利要求中所使用的，“另一个”意指至少第二或更多。如本公开中所使用的，短语“如(such as)”、“例如(forexample)”和“例如(e.g.)”意指“例如但不限于”，因为所述术语(“如”、“例如”或“例如”)之后的列表提供了一些实例，但是所述列表不一定是完全包含性的列表。词语“包括”意味着词语“包括”之后的项目可以包含另外的未叙述的要素或步骤；换句话说，“包括”不排除另外的未叙述的步骤或要素。

除非另有说明，否则说明书和权利要求中使用的表示成分数量、性质(如反应条件)等的所有数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则说明书和权利要求中阐述的数值参数是可以根据寻求通过目前公开的主题获得的期望性质而变化的近似值。

如本文所使用的，当提及质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，术语“约”意在涵盖偏离指定量在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％以及在一些实施方案中±0.1％的变化，因为这种变化对于执行所公开的方法来说是适合的。

本文提供了对一个或多个实施方案的详细描述。然而，应当理解，本公开可以用各种形式来体现。因此，本文所公开的具体细节(即使被指定为优选的或有利的)不应被解释为是限制性的，而是应用作权利要求的说明性基础，并且用作教导本领域的技术人员以任何适当方式采用本发明的代表性基础。事实上，对于本领域的技术人员来说，除了本文所描述的修改之外，对本发明的各种修改将从前面的描述和附图中变得显而易见。这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。