阅读说明：本技术 一种具有降高尿酸作用的红豆杉多糖的制备方法及其应用 (A kind of preparation method and applications of the yew amylose with drop high lithemia effect ) 是由 李晓 王赞 于 2019-05-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有降高尿酸作用的红豆杉多糖的制备方法及其应用,具体的红豆杉多糖的制备方法包括以下步骤：A)预处理；B)水提醇沉；C)洗涤；D)去蛋白；E)透析；F)冷冻干燥。并且公开了使用该方法制备得到的红豆杉多糖在降高尿酸方面的应用,以及公开了使用该方法制备得到的红豆杉多糖而制备得到的降高尿酸的药剂。本发明提取红豆杉多糖成本低,提取率以及纯度高,得到的红豆杉多糖具有降低高尿酸的功效,对肾脏有保护作用。(The invention discloses a kind of preparation method and applications of yew amylose with drop high lithemia effect, and the preparation method of specific yew amylose is the following steps are included: A) pretreatment；B) water extract-alcohol precipitation；C it) washs；D) deproteinized；E it) dialyses；F it) is freeze-dried.And application of the yew amylose being prepared using this method in terms of dropping high lithemia is disclosed, and discloses the medicament for the drop high lithemia being prepared using the yew amylose that this method is prepared.Present invention extraction yew amylose is at low cost, recovery rate and purity is high, and obtained yew amylose has effects that reduce high lithemia, has protective effect to kidney.)

一种具有降高尿酸作用的红豆杉多糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种具有降尿酸作用的红豆杉多糖的制备方法及应用。

背景技术

高尿酸血症是指血液中的尿酸浓度超出正常范围的一种机体状态，一般认为男性血液中的尿酸浓度大于400μmol/L时，女性血液中的尿酸浓度大于360μmol/L时应考虑为高尿酸血症。近年的研究表明，高尿酸血症不仅是痛风最重要的生化基础，而且也是引起高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征心血管疾病发生和死亡的重要因素，已成为威胁人类健康的主要代谢性疾病之一。

目前临床上治疗高尿酸血症的化学药物，主要以抑制尿酸生成的别嘌醇和促尿酸***药丙磺舒、苯溴马隆等药物为主。这些药物不良反应多，患者耐受性差，极大影响了高尿酸血症的治疗。近些年，中医药在降低血尿酸水平方面取得了很大成效。

中国专利公开号为CN101879264A的发明专利公开了“一种用于降尿酸的中药组合物”，以土茯苓、泽泻为原料提取各种成分，制备成口服制剂、注射剂，用于降尿酸；肖福洲“降低痛风患者尿酸的药茶”，以金钱草、车前草、当归和苦丁茶为原料，粉碎成粉，制成药茶，患者每日饮茶，可降尿酸；伊莲“预防和治疗高尿酸血症的中药制剂和组合物及其制备方法”，以“黄柏、苍术、土茯苓、忍冬藤”配比而成或者提取其中的生物碱、挥发油和黄酮等配比而成，发现具有显著降尿酸活性；从其中我们可以看出，土茯苓、泽泻为利水消肿药；车前草为利尿通淋药；金钱草为利湿退黄药；这些均可归类为利水渗湿药。可见在中药方面治疗高尿酸是以利水渗湿为主。

红豆杉作为药材，具有利水渗湿的作用，而中药治疗高尿酸又以水煎为主，经研究发现红豆杉除可以提取抗癌药物紫杉醇外，其水煎剂的主要成分为红豆杉多糖，故本发明正好立足于这一点，有效利用在工业上已经提取完紫杉醇和10-DABⅢ后的红豆杉枝叶为原料，提取红豆杉多糖，并做纯化处理，不仅节约资源，而且进一步挖掘红豆杉多糖的药用价值，以期实现珍稀红豆杉植物资源的合理以及最大化的有效应用，为人类医药健康领域资源的开发提供更多可能性。

发明内容

本发明的目的是提供一种红豆杉多糖及其制备方法，实现其在制备治疗高尿酸血症药物中的应用。

本发明提供的一种红豆杉多糖的制备方法，其包括以下步骤：

A)预处理

取已经提取完紫杉醇和10-DABⅢ之后的红豆杉干废料，粉碎，加乙醇，进行索氏提取，过滤收集药渣备用。

B)水提醇沉

步骤A)中所述药渣加入适量纯化水，搅拌至药渣被水浸透，索氏提取，滤过，减压浓缩；浓缩液加入乙醇，低温静置，滤过得到提取物。

C)洗涤

步骤B)中所得提取物依次缓慢滴加无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯，干燥后得粗品。

D)去蛋白

步骤C)中所得粗品溶解于适量热水中，以Sevage法去蛋白，得到去除蛋白后的多糖溶液。

E)透析

步骤D)中所得多糖溶液，采用流水透析法去除溶液中小分子物质。

F)冷冻干燥

步骤E)中透析后的溶液减压浓缩，预冷冻后冷冻干燥，得到红豆杉粗多糖。

优选的，所述步骤A)中加入80％乙醇索氏提取的料液比为1:5-15。

本案在水提醇沉前先用80％乙醇预处理红豆杉粉末，目的是为了去除药材中残存的脂溶性化合物以及部分单糖，这样可以提高步骤B药材多糖提取效率，增加收得率并且提高红豆多糖的纯度。乙醇索氏提取的料液比会影响到除杂的程度，本发明经过多次尝试，确定80％乙醇索氏提取的料液比为1:5-15时具有好的除杂效率，并且成本最低，进一步优选的80％乙醇索氏提取的料液比为1:8-12，进一步优选1:10。

步骤B)进行两次水提取，第一次加入纯化水料液比为1:8-12，第二次加入纯化水料液比为1:5-10，步骤B)中减压浓缩至生药浓度为0.8-15g/mL；浓缩液加入3-6倍体积乙醇，乙醇浓度85-97％，低温静置的温度为2-8℃，静置时间15-36h。

水提醇沉是目前药材多糖提取最常用的方法，方法大同小异，但是对提取工艺缺存在较大差异，在保持提取率的情况下提高生产效率、降低成本，本发明进行两次水提取，第一次加入纯化水料液比为1:8-12，第二次加入纯化水料液比为1:5-10，进一步优选的第一次料液比为1:10，第二次为1:8。

为了保证洗涤步骤能有效去除杂质减少洗涤时多糖损失，发明人通过观察洗涤过程洗涤液颜色变化以及洗涤液中多糖含量测试的方法，来考察最佳洗涤方法，确认洗涤工艺。

最终确定的洗涤方法为以此加入无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯，并且保证的体积都是南方红豆杉投料质量的0.05-0.2倍，优选为0.1倍。

步骤E)中透析法使用的透析袋截留分子量8000-14000。

本发明还提供了一种红豆杉多糖在制备治疗高尿酸血症药物中的应用。

红豆杉多糖作为主要活性成分在制备高尿酸血症药物中，其可以制成被药学上接受的各种制剂，制剂的剂型包括但不限于：灌肠剂；片剂；胶囊剂，例如硬胶囊剂；口服液；***剂；颗粒剂；冲剂；丸剂；滴丸剂；散剂；膏剂；丹剂；混悬剂；粉剂；溶液剂；栓剂；搽剂；霜剂；喷雾剂；粉雾剂；气雾剂；滴剂；锭剂以及贴剂。

制备各种剂型的辅料为药学领域常规的药物辅料，辅料包括但不限于：粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂和表面活性剂等。

上述的应用中，对本领域技术人员来说，可按药学领域的常规生产方法生产，红豆杉多糖的活性成分含量在1％-99.5％。

本发明的使用量可以根据给药途径，患者的体重、高尿酸血症的严重程度等变化，其服用量可以是0.01-2g/kg,可以一次或多次给药。

本发明利用已经提取完紫杉醇和10-DABⅢ之后的红豆杉干废料作为提取红豆杉多糖的原料，降低成本，同时增加了红豆杉的利用率，并且通过工艺的设置提高了红豆杉多糖的提取率以及纯度，同时验证了提取得到的红豆杉多糖无毒性。

本发明发现了红豆杉多糖对降低高尿酸的功效，并制备出了相应的制剂，并验证了用红豆杉多糖为活性成分制成的药物在高尿酸小鼠动物试验中，显示出红豆杉多糖优异的降尿酸及其降肌酐的效果，并对肾脏有保护作用；用红豆杉多糖为活性成分制成药物在临床实验中表现红豆杉多糖有明显的降尿酸效果。

具体实施方式

为更好地了解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定。

实施例1南方红豆杉总多糖制备工艺预处理方法探索

发明人在水提醇沉前先用80％乙醇预处理红豆杉粉末，目的是为了去除药材中残存的脂溶性化合物以及部分单糖，这样可以提高步骤B药材多糖提取效率，增加收得率。发明人分别对比四种料液比1:5、1:10、1:15、1:20，发现料液比为1:5时，除杂不完全，而料液比为1:15和1:20虽然效果非常好，但是会提高生产成本，所以优选料液比为1:10。

实施例2南方红豆杉总多糖制备工艺水提醇沉方法探索

水提醇沉是目前药材多糖提取最常用的方法，方法大同小异，但是对提取工艺却需要试验验证，在保持提取率的情况下提高生产效率、降低成本。发明人采用料液比1：5、1:8、1:10、1:15以及提取1、2、3次，以提取物提取率为参考标准，对提取工艺进行探索，确认最佳提取工艺：提取两次，第一次料液比为1:10，第二次为1:8。

实施例3南方红豆杉总多糖制备工艺洗涤方法探索

为了保证洗涤步骤能有效去除杂质减少洗涤时多糖损失，发明人通过观察洗涤过程洗涤液颜色变化以及洗涤液中多糖含量测试的方法，来考察最佳洗涤方法，确认了洗涤工艺：加入无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯的体积都是南方红豆杉投料量的0.1倍(质量/体积)。

实施例4南方红豆杉总多糖制备工艺透析袋的选择

透析袋孔径决定了多糖分子量，多糖分子量决定了其药效。发明人在查阅大量文献，并通过不同分子量红豆杉多糖的动物试验，发现透析袋截留分子量为8000-14000时，其药效和提取率最合适。

实施例5南方红豆杉多糖制备

取南方红豆杉粉末1kg，加80％乙醇10L，浸泡1h后，80℃索氏提取2小时，过滤收集药渣。药渣先加入10L纯化水，搅拌至药渣被水浸透，80℃索氏提取2h，滤过，残渣再加8L水重复提取一次，合并两次提取液，过滤，减压浓缩至生药浓度为1g/mL；浓缩液加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置24小时，滤过得到提取物。所得提取物依次缓慢依次滴加100mL无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯，干燥后得红豆杉多糖粗品。所得粗品溶解于适量热水中，以Sevage法加入1倍体积的正丁醇/氯仿(体积比为1:4)混合液，搅拌30分钟后离心，取上层水液；重复上述操作3次，得到去除蛋白后的多糖溶液。所得多糖溶液装入截留分子量为8000-14000的透析带中，采用流水透析法72小时去除溶液中小分子物质。透析后的溶液减压浓缩至生药浓度3.0g/mL，预冷冻后冷冻干燥，得到红豆杉粗多糖。

实施例6南方红豆杉粗多糖安全性试验

A)本发明急性毒理试验

本发明所使用实施例5粗多糖。实验时用蒸馏水配置成所需浓度的受试液。

本发明选用SPF级昆明小鼠，雌雄各20只，18～22g。采用最大耐受量(MTD)法，受试物一次性灌胃给予，染毒剂量为15.0g·kg·d^-1，灌胃容量0.8～1.0ml·(20g)^-1。试验前动物禁食(不禁水)16h，记录动物的中毒表现及死亡情况，连续观察14d。

本发明结果如下所述：灌胃给予受试物后，未见明显中毒症状，14d内动物无死亡。该受试物对2种性别小鼠的急性毒性MTD＞15.0g·kg^-1。根据急性毒性分级标准，该样品属实际无毒级。

B)本发明遗传毒性实验

Ames试验

采用常规平板掺入法，将受试样品红豆杉粗多糖配制成8、40、200、1000、5000ug/皿进行试验。溶液用无菌抽滤法除菌后，分别在顶层琼脂中加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL受试物溶液和0.5mLS9混合液(需要代谢活化时)，混合后倒入底层培养基平板上。同时做未处理对照、溶剂对照和阳性对照(TA_97a[-S₉]:500ug/皿阿的平；TA₉₈[-S₉]:6.0ug/皿正定霉素；TA₁₀₀[-S₉]和TA₁₀₂[-S₉]:1.0uL/皿甲基磺酸甲酯；TA_97a[+S₉♂]、TA₉₈[+S₉]及TA₁₀₀[+S₉]：10.0ug/皿2-氨基芴；TA₁₀₂[+S₉]：50.0ug/皿1,8-二羟基蒽醌)。

结果如表1和表2所示：在本试验的各浓度下，无论是否加入S9混合液,回变菌落数均未大于自发回变数的2倍，并且未见剂量-反应关系。而各阳性对照组均显示强烈的诱变作用。根据Ames试验结果判断标准，本次试验测试的该受试物未见致突变作用。说明未见该受试物对小鼠***有遗传毒性。

表1第一次Ames试验结果(x±s,n＝3)

注：阳性对照：不加用S9：TA97a500.0ug/皿阿的平；TA986.0ug/皿正定霉素；TA100及TA1021.0ul/皿甲基磺酸甲酯；加用S9：TA97a、TA98、TA10010.0ug/皿2-氨基芴；TA10250.0ug/皿1.8-二羟基蒽醌。

表2第2次Ames试验结果(x±s,n＝3)

骨髓细胞微核试验

♀♂小鼠各50只，25～30g。样品灌胃给予。按体质量随机分为5组，阴性对照组(纯化水)、受试样品红豆杉粗多糖600,1200,2400mg·kg^-1组,阳性对照(环磷酰胺，40mg·kg^-1)组，每组♀♂各5只。以0.4mL·(20g)^-1 2次灌胃(间隔24h)，第2次灌胃后6h取胸骨制片镜检。

结果：试验组动物在各试验剂量下，嗜多染红细胞(PCE)微核出现率、PCE/成熟红细胞(RBC)与阴性对照组相比，差异均无显著性(P>0.05)。而阳性对照组与阴性对照组相比，差异有显著性(P<0.05)，显示强烈的致突变作用。试验结果表明该受试物在本次试验剂量下未见致突变作用。

小鼠***畸形试验

♂小鼠各25只，25～30g。样品灌胃给予。按体质量随机分为5组，阴性对照组(纯化水)、受试样品红豆杉粗多糖600，1200，2400mg·kg^-1组，阳性对照(环磷酰胺，40mg·kg^-1)组，每组5只。以0.4mL·(20g)^-1体质量灌胃，连续5d，于首次灌胃后第30天取双侧附睾制片镜检。

结果：阴性对照组的***畸形率为1.99％，阳性对照组(环磷酰胺组)的***畸形率为5.26％，与阴性对照组相比,差异有显著性(P<0.05)。而试验3个剂量组的***畸形率分别为2.06％，2.02％，2.12％，与阴性对照组比差异无显著性(P>0.05)。

实施例7观察实验

A)分组及剂量设置：断乳SD大鼠120只，按体质量随机分为4组，每组30只，♀♂各15只。受试物红豆杉粗多糖经饲料掺入给予。设正常对照组：给予全价营养配合饲料；受试样品低，中，高3个剂量组：600，1200，2400mg·kg^-1·d^-1。动物单笼饲养，自由摄食摄水，连续观察30d结束喂养。

B)观察指标

一般指标：每天观察动物一次，记录动物毛色、行为及死亡情况；分别于试验的第7，15，22，30天称重一次，观察体质量增长状况；每周加饲料2次，称重记录，并记录撒失的饲料量，计算饲料消耗及利用率。

血液学检查：于试验第30天，股动脉取血进行血红蛋白测定，红细胞、白细胞、血小板计数及白细胞分类测定；分离血清，使用日立-7150全自动生化分析仪进行总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)、胆固醇(T-CHE)及三酰甘油(TG)测定。

结果：所测各组动物的血红蛋白、红细胞、白细胞(包括分类)、血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)、胆固醇(T-che)及三酰甘油(TG)均在正常值范围内。

C)脏器质量及病理组织学检

试验结束，大鼠采用股动脉放血处死，立即解剖进行大体检查；称取肝、脾、双侧肾和睾丸，分别计算脏体比；以甲醛液固定肝、肾、脾、胃、十二指肠、卵巢、睾丸。石腊包埋切片，HE染色进行病理组织学检查。

结果：脏体比：红豆杉粗多糖各剂量组的脏器绝对质量及其肝质量/体质量、脾质量/体质量、肾质量/体质量、睾丸质量/体质量比均无显著性差异。

组织病理检查：大体解剖时，对照组及红豆杉多糖各剂量组大鼠肝、肾、脾、胃、十二指肠、卵巢、睾丸在体观察未见异常，因此仅选高剂量组进行组织病理学检查。镜下检查除对照组和高剂量组有个别轻度异常(肝脂肪变性、肾间质灶性炎细胞浸润、胃与十二指肠黏膜上皮细胞部分脱落并有少量炎细胞浸润外，其余各例大鼠组织病理学检查结果均在正常范围内，高剂量组与空白对照组比较未见明显病理差异，提示红豆杉多糖对肝、肾、脾、胃、十二指肠、卵巢、睾丸无明显损伤作用。

实施例8高尿酸小鼠模型造模液的配置和模型构建

A)造模液配制方法：称取97％氧嗪酸钾(1g·kg^-1·d^-1)和腺嘌呤(100mg·kg^-1·d^-1),分别为18.0g和1.8g，混合溶于225ml蒸馏水中，即可。

B)模型构建方法：将小鼠按照体重、性别，保证每组小鼠平均体重、性别各半一致，进行分组，分别为正常对照组(C)、模型组(M)、红豆杉多糖高剂量(H-600)、红豆杉多糖高剂量(H-300)、红豆杉多糖高剂量(H-150)、别嘌醇阳性药组(Y)。分组具体情况如下表：如表3所示：

表3动物分组情况表

除正常对照组外，其余各组每只小鼠按照0.25ml/20g给药，持续5天。

C)红豆杉多糖高剂量(H-600)、红豆杉多糖高剂量(H-300)、红豆杉多糖高剂量(H-150)受试药物配制方法：分别称取南方红豆杉总多糖1.5g，0.75g，0.375g，各自溶于25ml蒸馏水中，配置成600mg/kg、300mg/kg、150mg/kg浓度的受试溶液，将其分别命名为红豆杉多糖高剂量(H-600)、红豆杉多糖高剂量(H-300)、红豆杉多糖高剂量(H-150)。

D)别嘌呤醇阳性药物配制:别嘌呤醇药物规格为0.1g/片，取2片，溶于25.00ml蒸馏水中，即可。

E)按照步骤B表3分组情况表，造模给药第6天，给予造模液1h后，按照0.2ml/20g给予治疗药物红豆杉粗多糖高、中低剂量，以及别嘌醇阳性药，持续给药7d。第7d给药结束后，Am12:00开始摘眼球取血，离心，取上清，转移至5mlEP管，贮存-20℃冰箱保存，待测。

F)本发明粗多糖降低高尿酸小鼠观察

从观察上来看，与正常组相比，治疗组动物状态比较好，而模型组动物活动相对较差；按照H-600、H-300、H-150、Y，动物外观皮毛光泽度，体重，行为活动，摄食量，摄水量依次减少。

与正常组对比，H-600组，左右侧肾均无萎缩现象，且双肾颜色稍发白，但整体与正常组无异，表面颗粒性凹凸不平不明显。Y阳性药组，肾萎缩最严重，其中以左侧肾萎缩最为严重，双肾颜色明显发白，表面颗粒性凹凸不平明显。因此推测阳性药别嘌醇在降尿酸的同时，因长期服用，药物积累而存在严重的肾损伤。即：H-600组不会产生肾脏损伤，且对肾功能有保护作用。

G)血清中UA、BUN、Cr结果分别如表4所示：

表4小鼠血清中UA、BUN、Cr测试结果(X±S)

注：“*”为与正常组比较，P＜0.05，模型组存在显著性差异；“#”为与模型组比较，P＜0.05，受试药物组存在显著性差异。

从表4可以表明，模型组与正常组比较，尿酸指标，尿素氮指标以及肌酐指标均存在显著性差异(P＜0.05)，且明显高于正常组小鼠的水平，表明小鼠高尿酸血症造模成功。

表4血清指标所示，尿酸(UA)指标，受试药物各组与模型组比较，阳性药别嘌醇组(Y)及红豆杉多糖H-600组有显著性差异(P＜0.05)，尿酸指标明显降低。而红豆杉多糖H-300及H-150两组的尿酸值与模型组相比均有所下降，但均不具有显著性差异。

尿素氮(BUN)指标所示，受试药物各组与模型组比较，阳性药别嘌醇组(Y)有显著性差异(P＜0.05)，阳性药组尿素氮水平显著性降低，而受试药物红豆杉多糖H-600、H-300与H-150有降尿素氮效果，但不具有显著性(P>0.05)。

肌酐(Cr)指标所示，受试药物各组与模型组比较，阳性药别嘌醇组(Y)、红豆杉多糖H-600组有显著性差异(P＜0.05)，肌酐(Cr)显著性降低，而红豆杉多糖H-300及H-150依次有下降趋势，但不具有显著性差异(P>0.05)。

本发明得出的结论：红豆杉粗多糖H-600组(600mg/kg)具有降尿酸及降肌酐的效果，且对肾脏有保护作用。

经过实施例6，7得出本发明南方红豆杉粗多糖具有很好的安全性；经过实施例8得出该粗多糖具有很好的降尿酸效果。