一种将鲜老茶叶中茶多酚生物转化为茶褐素的方法
阅读说明：本技术 一种将鲜老茶叶中茶多酚生物转化为茶褐素的方法 (Method for biologically converting tea polyphenol in fresh old tea leaves into theabrownin ) 是由 修志龙 郑梦娇 董悦生 虞诗强 王银波 张建娟 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种将鲜老茶叶中茶多酚生物转化为茶褐素的方法,属于生物工程技术领域。通过从普洱熟茶中分离出能够转化茶多酚为茶褐素的优势菌株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、布朗克假丝酵母(Candida blankii)以及塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis),将其中的一种或两种以上的混合菌接种于以鲜老茶叶为原料的发酵培养基,利用内源酶和微生物结合的方式,生物强化发酵转化茶多酚为茶褐素。本发明以鲜老茶叶为发酵基质,进行悬浮发酵或半固态发酵,均能有效利用茶叶内源酶,加速茶多酚的氧化,缩短发酵周期,大幅提升茶褐素生成效率,从而增加茶树的附加值,具有良好的工业应用前景。(The invention discloses a method for biologically converting tea polyphenol in fresh old tea into theabrownin, belonging to the technical field of biological engineering. The method comprises the steps of separating dominant bacteria Aspergillus fumigatus (Aspergillus fumigatus), Candida blankii (Candida blankii) and Aspergillus tubingensis (Aspergillus tubingensis) which can convert tea polyphenol into theabrownin from Pu-erh ripe tea, inoculating one or more mixed bacteria in a fermentation culture medium which takes fresh and old tea leaves as raw materials, and performing biologically-enhanced fermentation to convert the tea polyphenol into the theabrownin by utilizing a mode of combining endogenous enzyme and microorganisms. According to the invention, fresh old tea leaves are used as a fermentation substrate to carry out suspension fermentation or semi-solid fermentation, so that endogenous enzymes in the tea leaves can be effectively utilized, the oxidation of tea polyphenol is accelerated, the fermentation period is shortened, and the generation efficiency of theabrownin is greatly improved, so that the added value of tea trees is increased, and the tea tree fermentation method has a good industrial application prospect.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种将鲜老茶叶中的茶多酚生物转化为茶褐素的方法。
背景技术
茶褐素是普洱熟茶的主要有效成分，具有降糖、降脂、抑菌、抗癌以及抗氧化等功效。茶褐素是普洱茶渥堆发酵过程中由茶多酚、茶多糖和蛋白质等物质在湿热作用以及微生物分泌的胞外酶作用下聚合而成的复合色素类物质。自然发酵过程周期长(通常需要50-60天)，有效成分转化率低，同时也难以精准控制，茶褐素含量差异较大，产品品质不稳定，限制了茶褐素的进一步开发和利用。另外，参与自然渥堆发酵的微生物主要来源于叶片、空气以及周围环境，菌群组成复杂，较多的杂菌易导致产品品质不稳定，而且极易产生霉菌毒素，严重影响普洱茶的质量。
为了克服自然发酵的缺陷，人为添加微生物或酶可以提高茶褐素的生产效率和产品质量。在普洱茶渥堆发酵过程中添加外源酶制剂，例如漆酶、过氧化物酶以及纤维素酶等，能够不同程度地加速普洱茶中茶多酚等物质的氧化，缩短发酵时间，提高产物中茶褐素的含量。但添加酶制剂增加了额外成本，并且酶促反应条件要求较为苛刻，不利于其推广应用。在利用酶制剂或者人工接种微生物发酵生产茶褐素过程中，通常采用的是经过杀青的晒青毛茶，而新鲜茶叶自身含有的多酚氧化酶和过氧化物酶等促进茶多酚转化为茶褐素的酶并没有得到充分利用。
目前提高茶褐素生产效率的方法均是对传统制茶工艺的改良，所用茶叶或提取物均为制茶的嫩叶，而不是成熟的老茶叶，即茶树顶端嫩叶下方的成熟叶片。老茶叶通常都弃而不用，自然凋谢脱落，但它比嫩叶含有更多的淀粉、叶绿素和茶多酚，如茶多酚含量高出7-10％。倘若这些老茶叶能得以利用，那么无疑将给茶农增加额外收入。例如，2018年云南省茶叶采摘面积600万亩，平均每亩产茶66公斤，每亩茶园利润在5000～10000元左右。若每亩茶园能采500kg老茶叶，即便只将其中的茶多酚提取出来，则每亩新增产值2万元。在不影响正常制茶收入的情况下，可为茶农额外增收2-3倍。若将老茶叶中的茶多酚经生物催化转化为茶红素、茶褐素，为茶饮料或保健品提供原料，则可以进一步提高茶产业的产值，增加茶农收入。
综上，利用新鲜老茶叶中内源酶和普洱茶发酵的优势菌相结合的方法将鲜老茶叶中的茶多酚转化为茶褐素，充分利用茶叶资源，提升茶褐素的生产效率和品质，降低生产成本，对工业化生产茶褐素及其开发利用具有重要的经济价值和社会效益。
发明内容
本发明旨在提供一种将鲜老茶叶中茶多酚生物转化为茶褐素的方法，提高老茶叶的利用率，增加茶树的附加值。
本发明的技术方案如下：
一种将鲜老茶叶中茶多酚生物转化为茶褐素的方法，将筛选自普洱熟茶中能够转化茶多酚为茶褐素的优势微生物接种至以鲜老茶叶为原料的发酵培养基中进行发酵，发酵过程中利用茶叶内源酶和所述的优势微生物相结合的方法，强化茶多酚生物转化为茶褐素。
进一步的，在上述技术方案中，所述的优势微生物具有下述性质：在固体茶汤筛选培养基上培养2～5天，菌株生长状态良好，且菌落周围能够产生褐色斑块。
进一步的，在上述技术方案中，所述固体茶汤筛选培养基的制备包括以下步骤：称取晒青毛茶20-60g，加入1000mL水中，水浴锅煮沸5～20min，过滤，调节所得茶汤的pH值至5.0～7.0，定容到1000mL，添加10-30g琼脂，灭菌即得。
进一步的，在上述技术方案中，所述的优势微生物包括烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、布朗克假丝酵母菌(Candida blankie)和塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)中的一种或者两种以上的组合。
进一步的，在上述技术方案中，所述鲜老茶叶是指茶树顶端嫩叶下方的新鲜成熟叶片。
进一步的，在上述技术方案中，采用的发酵方式为液态发酵、悬浮发酵或半固态发酵。
进一步的，在上述技术方案中，发酵条件：好氧发酵；接种量为1～10％(v/v)的种子培养液，其中孢子或活菌细胞数为1×106～1×109CFU/mL；培养温度为28～45℃，pH为5-8，转速150rpm～300rpm，发酵时间为72h～120h。
进一步的，在上述技术方案中，种子培养液的制备包括以下步骤：将烟曲霉和塔宾曲霉菌株分别接种至PDA平板培养基，30℃培养3-5天，用适量的灭菌生理盐水将真菌孢子洗下，转移至装有灭菌玻璃珠的离心管中，涡旋震荡，过滤，分别得到烟曲霉和塔宾曲霉的种子培养液；将布朗克假丝酵母接入YPD培养基活化10-12h，按1％-10％(v/v)接种量接至新鲜YPD培养基培养24-30h，得到布朗克假丝酵母种子培养液。
进一步的，在上述技术方案中，所述液态发酵的发酵培养基的制备包括以下步骤：向鲜老茶叶中加入10～50倍质量的水，50～100℃浸提0.1-12h后过滤，所得茶汤灭菌即得。
进一步的，在上述技术方案中，所述悬浮发酵的发酵培养基的制备包括以下步骤：向鲜老茶叶中加入10～50倍质量的水，匀浆破碎后即得，或者匀浆破碎后灭菌即得，或者匀浆破碎后在30～40℃条件下利用茶叶自身氧化酶酶促反应2～4h后再灭菌即得。
进一步的，在上述技术方案中，所述半固态发酵的发酵培养基的制备包括以下步骤：向鲜老茶叶中加入1～8倍质量的水，匀浆破碎后即得，或者匀浆破碎后灭菌即得，或匀浆破碎后在30～40℃条件下利用茶叶自身氧化酶酶促反应2～4h，再灭菌即得。
本发明的有益效果：
(1)本发明所用菌株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、布朗克假丝酵母菌(Candida blankii)以及塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)均筛选自普洱熟茶样本，属于天然菌株，具有高效转化茶多酚为茶褐素的能力，易于培养，遗传稳定性高等优点，可应用于工业化生产。
(2)本发明以鲜老茶叶为原料，采用悬浮发酵或半固态发酵的方式，提高茶叶内源酶的利用率，增加酶与底物的接触，促进茶多酚转化为茶褐素。该法简化茶褐素的生产工艺，缩短发酵周期，增加茶树的附加值，减轻环境压力。
附图说明
图1表示实施例1中鲜老茶叶中茶多酚含量。
图2表示实施例2中烟曲霉DL-01、布朗克假丝酵母DL-02和塔宾曲霉DL-03在茶汤筛选培养基上的生长状态。
图3表示实施例3中单菌液态发酵中茶褐素得率变化图。
图4表示实施例4中单菌悬浮发酵中茶多酚和茶褐素浓度变化图。
图5表示实施例5中单菌半固态发酵中茶多酚和茶褐素浓度变化图。
图6表示实施例6中混菌半固态发酵中茶多酚和茶褐素浓度变化图(左：30℃；右：37℃)。
图7表示实施例7中内源酶催化与单菌半固态发酵中茶多酚和茶褐素浓度变化图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学或生物试剂公司购买，茶叶均采自云南省保山市龙陵县大叶茶茶园。
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施方式。
1.下述实施例使用的培养基：
1)PDA培养基：200g去皮马铃薯切块沸水浴20min，两层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖定容至1000mL，加入20g琼脂，115℃高压灭菌20min后分装成固体培养基。
2)YPD培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，水定容至1000mL，115℃高压灭菌20min。
3)液体茶汤筛选培养基：称取晒青毛茶30g，加入1000mL水中，水浴锅煮沸5～10min，减压过滤弃去茶渣，所得茶汤调节pH值为6.0，定容至1000mL，115℃高压灭菌20min备用。
4)固体茶汤筛选培养基：制备方法同液体茶汤筛选培养基，另调整晒青毛茶为40g，高压灭菌前添加20g琼脂。
5)液态发酵培养基：向鲜老茶叶中加入30倍质量的水，100℃浸提15min，减压抽滤弃去茶渣，所得茶汤调节pH至6.0后巴氏杀菌(80℃，30min)。与此对照的发酵培养基中原料为晒青毛茶，制备方法相同。
6)悬浮发酵培养基：实验组：向鲜老茶叶中加入30倍质量的水，匀浆破碎2min。匀浆液在恒温37℃条件下以200rpm速率通气搅拌，利用茶叶内源酶充分氧化茶多酚，2h后微波高温加热3～5min，终止酶促反应，调节pH至6.0后巴氏杀菌(80℃，30min)。对照组：向鲜老茶叶中加入30倍质量的水，匀浆破碎2min。匀浆液微波高温加热3～5min，调节pH至6.0后巴氏杀菌(80℃，30min)。
7)半固态发酵培养基∶向鲜老茶叶中加入5倍质量的水，匀浆破碎2min。匀浆液在恒温37℃水浴中以200rpm速率通气搅拌，利用茶叶内源酶充分氧化茶多酚，2h后微波高温加热3～5min，终止酶促反应，调节pH至6.0后巴氏杀菌(80℃，30min)。与此对照的发酵培养基是向鲜老茶叶中加入5倍质量的水，匀浆破碎2min。
2分析方法
(1)液态发酵液样品预处理：将发酵液利用小型离心机10000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液75℃水浴5min，终止发酵。
(2)悬浮发酵液样品预处理：将发酵液利用小型离心机10000rpm离心10min，弃去菌体和茶叶悬浮物，取上清液10000rpm再离心10min，取上清75℃水浴5min，终止发酵。
(3)半固态发酵液样品预处理方法同悬浮发酵液样品预处理。
(4)茶多酚含量测定：参照《GB/T 8313-2018茶叶中茶多酚和儿茶素类含量检测方法》，以没食子酸作为标准参照物，比色标准曲线法定量测定茶多酚。
(5)茶褐素浓度测定：参照系统分析法。
取预处理完的发酵液样品2mL，加入等体积正丁醇，涡旋震荡3min，静置分层。取下层水相0.4mL加入0.4mL饱和草酸、1.2mL蒸馏水和3mL 95％乙醇，混匀后于380nm处检测吸光度。以95％乙醇作为空白对照。分别按照式(1)和式(2)计算发酵液中茶褐素得率和茶褐素浓度。
式中：XTB：发酵液中茶褐素得率(g TB/100g制作培养基所用茶叶干重)；CTB：发酵液中茶褐素浓度(g/L)；EB：试样吸光度；ω：制作培养基所用茶叶水分质量分数；f：制作培养基不同料液比时的校正系数，培养基中茶叶与水比例为3∶125时，f＝1；m：制作培养基所用茶叶干重(g)；V：发酵液总体积(mL)；d：发酵液稀释倍数。
实施例1茶叶中茶多酚含量
测定鲜老茶叶以及从同一地区购入的由嫩叶制成的绿茶、晒青毛茶、红茶中茶多酚含量。茶多酚是氧化生成茶褐素的底物，其含量高低直接影响茶褐素的生成量。由图1所示，鲜老茶叶中茶多酚含量为28.07％(w/w，干重，下同)，明显高于由同一品种嫩叶制成的绿茶(19.62％)、晒青毛茶(18.28％)、红茶(9.49％)。红茶中的茶红素和茶黄素是由茶多酚转化而来，绿茶和晒青毛茶的茶多酚保留率较高，由此可见，鲜老茶叶中茶多酚明显比嫩叶高。
实施例2普洱茶优势菌株分离与鉴定
本发明的菌株来源于普洱熟茶样品中。具体分离鉴定方法如下：
(1)初筛：向2g普洱熟茶中加入18mL灭菌0.9％生理盐水，置于37℃恒温震荡培养箱中震荡30min，取出后静置5min，制成菌悬液备用。取100μL溶液进行10-1、10-2、10-3三个浓度梯度稀释，取100μL稀释后的菌悬液涂布于固体茶汤筛选培养基，倒置于37℃培养箱中恒温培养1～5天，根据褐色斑大小筛选菌落，再接种至新的固体筛选培养基，经多次划线分离纯化，得到菌落形态单一的菌种。将其接种于PDA斜面培养基保存备用。
(2)复筛：将初筛保存的菌株接种至新的PDA培养基进行活化，30℃培养3-5天，挑取单菌落，分别接种至液体茶汤筛选培养基，在30℃、200rpm条件下摇瓶培养4天。测定发酵液中茶多酚与茶褐素浓度，得到具有较强转化茶多酚为茶褐素能力的3株优势菌株，分别命名为DL-01、DL-02、DL-03。采用斜面传代法、低温甘油法等常规方法保存备用。
(3)菌株的鉴定：通过对DL-01和DL-03菌株ITS rDNA序列以及DL-02菌株的26SrDNA序列测定，并将所得序列信息与美国国立生物技术信息中心(National Center ofBiotechnology Information，简称NCBI)的GenBank数据库进行比对，结果表明DL-01、DL-02、DL-03分别与已知菌株Aspergillus fumigatus(NCBI登录号：MT558940.1)、Candidablankii(NCBI登录号：MF940140.1)和Aspergillus tubingensis(NCBI登录号：MN818620.1)同源相似性为100％，确定其分别为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、布朗克假丝酵母(Candida blankii)和塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。DL-01、DL-02以及DL-03基因测序所得原始数据已提交至NCBI GenBank，登录号分别为MZ203542.1、MZ206165.1、MZ206179.1。三株菌株分别与中国工业微生物菌种保藏中心菌种保藏编号为CICC 41620、CICC 33217、CICC 41400的菌株具有相似的来源。
实施例3三种单菌的液态发酵
种子培养液制备：将实施例2中获得的烟曲霉和塔宾曲霉菌株接种至PDA平板培养基，30℃培养3-5天，用适量的灭菌生理盐水将真菌孢子洗下，转移至装有灭菌玻璃珠的50mL离心管中，涡旋震荡3min，经过两层灭菌脱脂棉过滤，分别得到二者种子培养液。将实施例2中获得的布朗克假丝酵母接入YPD培养基活化10-12h，按1％-10％接种量接至新鲜YPD培养基培养24-30h，得到布朗克假丝酵母种子培养液。
使用血球计数板分别对三种种子培养液中孢子(曲霉)或活菌细胞(酵母)数进行计数，利用灭菌生理盐水调整其浓度为1×107CFU/mL，以5％(v/v)接种量分别接至装有以鲜老茶叶或晒青毛茶浸提液为唯一发酵底物的液态发酵培养基的锥形瓶，瓶口用双向透气膜封口，30℃、200rpm条件下进行摇瓶发酵，定期取样测定发酵液中茶多酚和茶褐素浓度，计算茶褐素的得率。发酵过程如图3所示，发酵起点茶多酚含量(干重)以及终点茶褐素得率如表1所示。鲜老茶叶中茶多酚的含量明显高于晒青毛茶，发酵过程中鲜老茶叶发酵液中茶褐素的得率均高于晒青毛茶，说明以鲜老茶叶为原料生物转化为茶褐素具有明显优势。
表1单菌液态发酵起点茶多酚含量和终点茶褐素得率
注：XTP，0：发酵起点茶多酚含量(w/w，干重)；XTB，f：发酵终点茶褐素得率。
实施例4三种单菌的悬浮发酵
种子培养液的制备同实施例3，相同条件下分别接种至经内源酶预处理2h(实验组)和未经内源酶酶解处理(对照组)的鲜老茶叶悬浮发酵培养基进行摇瓶发酵，定期取样测定发酵液中茶多酚和茶褐素浓度，计算茶褐素得率。发酵过程如图4所示：茶多酚浓度在48h基本达到平衡状态，茶褐素浓度在72h基本趋于稳定。发酵结果如表2所示，发酵过程中实验组(内源酶+菌)发酵液中茶褐素的浓度均高于对照组(单菌)，说明利用鲜老茶叶自身的氧化酶(内源酶)进行酶促反应，可以促进更多的茶多酚转化为茶褐素。
表2单菌悬浮发酵终点茶多酚和茶褐素浓度
注：CTP，0：发酵起点茶多酚浓度；CTP，f：发酵终点茶多酚浓度；CTB，0：发酵起点茶褐素浓度；CTB，f：发酵终点茶褐素浓度；XTB，f(％)：发酵终点茶褐素得率。
实施例5三种单菌的半固态发酵
种子培养液的制备同实施例3，调整孢子或活菌细胞数为1×108CFU/mL，相同条件下接种至经茶叶内源酶预处理2h的鲜老茶叶半固态发酵培养基进行摇瓶发酵，定期取样测定发酵液中茶多酚和茶褐素浓度，计算茶褐素得率。发酵过程如图5所示：接种塔宾曲霉、烟曲霉、布朗克假丝酵母的终点发酵液中茶褐素浓度分别为8.13、7.38、13.95g/L，得率分别为：17.49％、15.87％、30.00％。半固态发酵茶褐素浓度显著高于液态发酵和悬浮发酵，如布朗克假丝酵母的半固态发酵液中茶褐素浓度是悬浮发酵的4.08倍。虽然半固态发酵液中茶褐素得率低于液态发酵和悬浮发酵，如布朗克假丝酵母的悬浮发酵液中茶褐素得率是半固态发酵的1.37倍，但是浓度提升会减少后续浓缩成本。
实施例6三种菌混合的半固态发酵
种子培养液的制备同实施例3，调整孢子或活菌细胞数为1×108CFU/mL，分别按照塔宾曲霉和烟曲霉种子液体积1∶1(组合A)，塔宾曲霉和布朗克假丝酵母种子液体积1∶1(组合B)，烟曲霉和布朗克假丝酵母种子液体积1∶1(组合C)，烟曲霉、塔宾曲霉和布朗克假丝酵母1∶1∶1(组合D)的比例进行混合，将混合种子培养液以相同接种量接种至经茶叶内源酶预处理2h的半固态发酵培养基，分别在30℃和37℃条件下进行摇瓶发酵，定期取样测定发酵液中茶多酚和茶褐素浓度，计算茶褐素得率。实验过程如图6所示，发酵终点茶多酚浓度、茶褐素浓度以及茶褐素得率如表3所示。随着温度升高，四种组合发酵终点茶褐素的浓度和得率都有不同程度的升高，其中塔宾曲霉与布朗克假丝酵母组合(B)相较于其他组合随温度的变化最明显，茶褐素浓度提升了2.13g/L，茶褐素得率提升了3.28％。同样，在相同温度条件下，塔宾曲霉与布朗克假丝酵母组合(B)相较于其他组合也具有明显优势。
表3半固态混菌发酵终点茶多酚和茶褐素浓度
注：CTP，f：发酵终点茶多酚浓度；CTB，f：发酵终点茶褐素浓度；XTB，f(％)：发酵终点茶褐素得率。
实施例7鲜老茶叶内源酶催化与单菌半固态发酵相结合
种子培养液的制备同实施例3，调整孢子或活菌细胞数为5×107CFU/mL，相同条件下直接接种至匀浆处理后未经灭菌的半固态发酵培养基进行摇瓶发酵，定期取样测定发酵液中茶多酚和茶褐素浓度，计算茶褐素得率。发酵过程如图7所示，茶多酚浓度在24h～48h内显著下降，48h后基本达到平衡状态。茶褐素浓度在48h后逐渐上升，接种布朗克假丝酵母的发酵液中茶褐素的浓度在48h后明显高于其他两组。接种塔宾曲霉、烟曲霉、布朗克假丝酵母的终点发酵液中茶褐素浓度分别为7.32、6.40、13.57g/L，茶褐素得率分别为：15.74％、11.33％、29.18％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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