一种彝药齿叶蓼提取物及其制备方法和抗癌应用
阅读说明：本技术 一种彝药齿叶蓼提取物及其制备方法和抗癌应用 (Yi medicine polygonum cuspidatum extract as well as preparation method and anticancer application thereof ) 是由 薛永波 苏向东 邓文斌 何鑫 曾子谦 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于天然药物提取物技术领域,具体涉及一种彝药齿叶蓼提取物及其制备方法和抗癌应用,为加强齿叶蓼在抗癌药物及保健品应用方面的研究,提高对齿叶蓼这一民族药用植物的资源开发和利用,本发明提供了一种有效、稳定、安全的制备齿叶蓼块根的不同极性提取部位的方法,所提取得到的齿叶蓼块根乙醇提取物、齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物和齿叶蓼块根正丁醇提取物对肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞和神经母细胞癌细胞均表现出一定的抑制效果。本发明涉及齿叶蓼抗癌有效部位的提取制备工艺流程简易、高效,绿色环保,有利于对何首乌属植物齿叶蓼植物资源的进一步开发。(The invention belongs to the technical field of natural medicine extracts, and particularly relates to a Yi medicine polygonum cuspidatum extract, a preparation method and anticancer application thereof, aiming at strengthening the research of polygonum cuspidatum on the application aspect of anticancer medicines and health care products and improving the resource development and utilization of the polygonum cuspidatum, which is a national medicinal plant. The invention relates to a preparation method of an anticancer effective part of polygonum cuspidatum, which has simple and efficient extraction process flow and is green and environment-friendly and is beneficial to further development of polygonum cuspidatum plant resources of polygonum.)
技术领域
本发明属于药物提取物技术领域，具体涉及一种彝药齿叶蓼提取物及其制备方法和抗癌应用。
背景技术
癌症是一类严重危害人类健康的重要疾病。根据国际癌症研究机构(IARC)《2020年世界癌症报告》中公布的统计数据显示，2020年全球癌症新发病例约为1930万，癌症死亡例数为1000万，其中肺癌死亡率最高为18.0％,紧接着是结肠癌(9.4％)，肝癌(8.3％)，胃癌(7.7％)和乳腺癌(6.9％)。今后数年将是全球癌症的高发年份，各国若不采取紧急措施，到2040年，全球每年将有2840万新发癌症病例出现。因此，癌症的预防与治疗任务十分艰巨，世界各国都在积极投入抗癌药物的研究与开发工作。
生命科学研究的飞速发展，使人们对恶性肿瘤的发病原因、生理变化和病理机制的认识不断深入。同时，随着肿瘤细胞内信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡、血管生成以及细胞转移、浸润等各种基本过程的逐步阐明，许多抗肿瘤药物也随之被研发出来。但目前已开发的抗肿瘤药物大多为化学合成类，存在选择性差、毒副作用大和耐药性等问题。因此，从植物中寻找有效的抗癌活性天然药物已成为国内外药学研究者的热点研究课题。从1981年到2019年的近40年间，已上市的抗肿瘤药物中，共有64.4％来自天然产物或其衍生物。如来源于红豆杉(Taxus Chinensis)的紫杉醇(Taxol)；珙桐科植物喜树(Camptothecaacuminata)的喜树碱(Camptothecine)等。很多药用植物在民间有几千年的药用历史，有着雄厚的医学临床用药基础。因此，从药用植物资源中研发新的天然抗癌药物有着巨大的潜力和应用前景。
齿叶蓼[Fallopia denticuta(HuangA.J.Li)]是蓼科(Polygonaceae)何首乌属(Fallopia)多年生缠绕草本植物，主要分布于我国南方的云南(滇西、滇中和滇西北)，以及贵州等地区。齿叶蓼的块根肥大近球形，质地坚硬且呈粉性，是彝族民间常用的传统草药。其药用价值最早记载于1970年版的《云南种草药选》和《曲靖专区中草药手册》，别名酱头、降头、赤胆红等。根据这几本医学典籍记载，齿叶蓼块根味苦，药性涩、凉，归心、脾、胃经，其具有收敛止泻、消炎止痢的功效，主要适用的病症包括消化道疾病，如消化不良、胃痛、痢疾；慢性肝炎；月经不调；崩漏等；外用可治疗外伤出血；疔疮初起。然而，齿叶蓼作为一种有着传统药用经验的民族草药并没有得到重视，其相关的研究也比较滞后。目前，还没有关于将齿叶蓼应用于制备抗癌药物或保健品的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种彝族药用植物齿叶蓼提取物的制备方法，制备工艺流程简易、高效，绿色环保，提取得到的不同极性提取部位对肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMMC-7721)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(SW480)和神经母细胞癌细胞(SH-SY5Y)均表现出一定的抑制效果，有利于齿叶蓼这一彝族民间常用草药资源的进一步开发和利用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了彝族药用植物齿叶蓼块根乙醇提取物的制备方法，具体为：将齿叶蓼块根粉粹过筛，用乙醇溶液进行浸泡提取，浸泡提取后过滤收集提取液，然后将提取液减压浓缩至无乙醇味即得到齿叶蓼块根乙醇提取物。
本发明还提供了彝族药用植物齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物的制备方法，具体为：将上述的齿叶蓼块根乙醇提取物最大程度溶解于水中，形成均一的混悬液，然后加入乙酸乙酯溶剂进行萃取，萃取液浓缩至无溶剂味即得齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物。
本发明还提供了彝族药用植物齿叶蓼块根正丁醇提取物的制备方法，具体为：往上述的乙醇提取物的混悬液中继续加入正丁醇溶剂进行萃取，最后再浓缩至无溶剂味，即得齿叶蓼块根正丁醇提取物。
优选地，齿叶蓼块根乙醇提取物的提取过程中，所述齿叶蓼块根与乙醇溶液的料液比为1.0g：15～25mL，所述乙醇溶液为95％乙醇溶液。
优选地，齿叶蓼块根乙醇提取物的提取过程中，减压浓缩的温度为45±5℃、真空度为0.04±0.02Mpa。
优选地，齿叶蓼块根乙醇提取物的提取过程中，所述浸泡为20±5℃条件下浸泡24～36小时，浸泡过程重复3～4次。
优选地，齿叶蓼块根乙醇提取物的提取过程中，所述过滤采用加压抽滤的方法，过滤前先静置至液体澄清，并过滤至无药渣。
优选地，齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物的萃取过程中，所述乙酸乙酯溶剂的添加体积为混悬液的1～1.5倍,萃取过程重复。
优选地，齿叶蓼块根正丁醇提取物的萃取过程中，所述正丁醇溶剂的添加体积为混悬液的1～1.5倍。
优选地，在齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物的萃取以及齿叶蓼块根正丁醇提取物的萃取过程中，减压浓缩的的温度为50±5℃、真空度为0.04±0.02Mpa。
优选地，在齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物的萃取以及齿叶蓼块根正丁醇提取物的萃取过程中，齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物和齿叶蓼块根正丁醇提取物的萃取次数均为3～4次。
本发明还提供了采用上述的制备方法制备得到的齿叶蓼块根乙醇提取物或齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物或齿叶蓼块根正丁醇提取物。
本发明还提供了上述的齿叶蓼块根乙醇提取物或齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物或齿叶蓼块根正丁醇提取物在制备抗癌药物中的应用。
本发明还提供了上述的齿叶蓼块根乙醇提取物或齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物或齿叶蓼块根正丁醇提取物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤细胞包括肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMMC-7721)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(SW480)和神经母细胞癌细胞(SH-SY5Y)。
本发明采用MTS法研究了齿叶蓼块根的不同极性提取部位(齿叶蓼块根乙醇提取物、齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物、齿叶蓼块根正丁醇提取物对肺癌(A549)、肝癌(SMMC-7721)、乳腺癌(MCF-7)、结肠癌(SW480)和神经母细胞癌(SH-SY5Y)的体外抗肿瘤作用。结果表明，各极性提取部位均表现出一定的抗癌效果。其中，齿叶蓼块根的乙醇提取物和乙酸乙酯提取物对神经母细胞癌细胞(SH-SY5Y)的体外增殖具有明显的抑制率，乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对结肠癌(SW480)的体外增殖具有较明显的抑制率，并且乙酸乙酯提取物对肝癌(SMMC-7721)和乳腺癌(MCF-7)的体外增殖都具有一定程度上的抑制率。说明齿叶蓼的不同提取部位在抗癌药物研发方面具有重要的应用潜力。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
为加强齿叶蓼在抗癌药物及保健品应用方面的研究，提高对齿叶蓼这一民族药用植物的资源开发程度，本发明提供了一种有效、稳定、安全的制备齿叶蓼块根的不同极性提取部位的方法，所提取得到的齿叶蓼块根乙醇提取物、齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物和齿叶蓼块根正丁醇提取物对肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMMC-7721)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(SW480)和神经母细胞癌细胞(SH-SY5Y)均表现出一定的抑制效果，说明齿叶蓼在抗癌药物的研发方面具有潜在的应用价值。本发明对齿叶蓼抗癌有效部位的提取制备工艺流程简易、高效，绿色环保，可以促进何首乌属植物齿叶蓼植物资源的开发和利用。
本发明首次对齿叶蓼块根的不同极性提取部位进行抗癌活性评估，提供了齿叶蓼在民间常用于治疗消化道疾病和出血症以外的药用价值，即齿叶蓼块根的不同极性提取部位在制备抗肿瘤药物方面的应用，有利于齿叶蓼这一彝族民间常用草药资源的持续开发和利用。
附图说明
图1为齿叶蓼块根的不同极性提取物对5种癌细胞株的抗细胞增殖活性图；
图2为齿叶蓼块根的乙醇提取物和乙酸乙酯提取物对神经母细胞癌(SH-SY5Y)细胞株的抗细胞增殖活性图；
图3为齿叶蓼块根的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对结肠癌(SW480)细胞株的抗细胞增殖活性图；
图4为齿叶蓼块根的乙酸乙酯提取物对乳腺癌(MCF-7)和肝癌(SMMC-7721)细胞株的抗细胞增殖活性图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
下述实施例所涉及的药材、试剂及仪器：
(1)药材与试剂
齿叶蓼块根采集自贵州省毕节市织金县，经湖北民族大学黄升教授鉴定为蓼科何首乌属齿叶蓼[Fallopia denticuta(HuangA.J.Li)]的块根。
胎牛血清(FBS,Hyclone)、胰酶(Hyclone)、RMPI1640或者DMEM高糖和DMEM低糖(Hyclone,Logan,UT,USA)、四甲基偶氮唑盐(MTT,Sigma,St.Louis,MO,USA)、二甲基亚砜(DMSO,Sigma)、顺铂和紫杉醇(Sigma)，另外，95％乙醇、乙酸乙酯和正丁醇均为国产分析纯。
(2)五种癌细胞株均购于美国ATCC(Manassas,VA,USA)：肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMMC-7721)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(SW480)和神经母细胞癌细胞(SH-SY5Y)。
(3)仪器：海道夫旋转蒸发仪(Hei-VAP Core ML)；电子天平，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)。
实施例1齿叶蓼块根的不同极性提取部位的制备
(1)将阴干后质地坚硬的齿叶蓼块根打粉，过40目筛网，按照1：20(g/mL)的物料比加入95％乙醇溶液，充分搅拌混匀后室温(20±5℃)条件下浸泡。浸泡过程中，每间隔4个小时对浸润的样品进行一次充分的搅拌，一共浸泡24小时。
(2)对步骤(1)所得的乙醇提取液静置直至液体澄清，然后通过加压抽滤的方法过滤提取液，并且重复该抽滤步骤3次直至无药渣。
(3)重复步骤(1)和步骤(2)，对齿叶蓼块根进行3～4次24小时浸泡提取，收集全部提取液。
(4)对步骤(3)中收集的乙醇提取液通过减压浓缩(温度45±5℃、真空度0.04±0.02Mpa)至浓缩物无乙醇味，得到齿叶蓼块根乙醇提取物。
(5)按照提取物：蒸馏水＝1：1～1：2的质量比将乙醇提取物最大程度的溶解，形成均一的混悬液。
(6)往步骤(5)的混悬液中加入体积为1～1.5倍的乙酸乙酯溶剂，萃取3次，合并3次萃取液后减压浓缩(温度50±5℃、真空度0.04±0.02Mpa)至无溶剂味，得到齿叶蓼块根乙酸乙酯提取物。
(7)步骤(6)萃取结束后，继续向混悬液中加入体积为1～1.5倍的正丁醇溶剂，溶剂萃取3次，合并3次萃取液后减压浓缩(温度50±5℃、真空度0.04±0.02Mpa)至无溶剂味，得到齿叶蓼块根正丁醇提取物。
实施例2齿叶蓼块根不同提取部位在研发抗癌药物中的应用
(1)MTS法检测细胞活性原理
MTS为一种全新的MTT类似物，全称为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的甲臜(Formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
(2)实验方法
1)接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，并以每孔3000～12000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔的接种体积为100μL，细胞提前12～24小时接种培养。
2)加入待测提取物溶液：用DMSO溶解实施例1中制备得到的乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物，然后加入到步骤(1)的96孔板中，各个提取物以100μg/mL、20μg/mL、4μg/mL、0.8μg/mL、0.16μg/mL的浓度复筛，每孔的终体积为200μL，每种处理均设3个复孔。
3)显色：加入待测提取物后，将细胞置于37℃下培养48小时，弃除孔内的培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液100μL；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。
4)比色：选择492nm波长，用多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔的光吸收值，然后以提取物浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，并应用两点法(ReedandMuench法)计算化合物的IC50值。
5)阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物，然后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，并应用两点法(Reed andMuench法)计算化合物的IC50值。
(3)实验结果
如图1的结果所示，乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMMC-7721)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(SW480)和神经母细胞癌细胞(SH-SY5Y)均具有一定的抑制效果。其中，乙醇提取物对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的生长增殖抑制效果最好，药效呈现浓度依赖性，IC50值为30.1±0.67μg/mL。
如图2和图4的结果所示，乙酸乙酯提取物对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和肝癌细胞(SMMC-7721)这两种肿瘤细胞的抑制效果最好，药效呈现浓度依赖性，IC50值分别为36.6±1.37μg/mL和59.5±3.86μg/mL。同时，由图3和图4可以看出，乙酸乙酯提取物对乳腺癌(MCF-7)和结肠癌(SW480)细胞的生长增殖都具有一定的抑制效果，药效呈现浓度依赖性，IC50值分别为95.4±1.07μg/mL和77.2±2.11μg/mL(如图3和图4)。
此外，由图3可以看出，正丁醇提取物对结肠癌(SW480)细胞的生长增殖抑制效果较好，药效呈现浓度依赖性，IC50值为72.1±1.06μg/mL。
综上所述可见，乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物等齿叶蓼块根不同极性提取物均对不同肿瘤细胞的生长增殖具有抑制作用，具有潜在的抗肿瘤活性。其中，乙酸乙酯对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)、肝癌(SMMC-7721)、乳腺癌(MCF-7)和结肠癌(SW480)这四种肿瘤细胞都有抑制作用，即抗肿瘤活性明显优于乙醇提取物和正丁醇提取物。有趣的是，乙醇提取物和乙酸乙酯提取物同时对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)具有明显的生长增殖抑制作用(图2)，而乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对结肠癌(SW480)具有较明显的生长增殖抑制作用(图3)。此外，乙酸乙酯提取物在一定程度上抑制肝癌(SMMC-7721)和乳腺癌(MCF-7)细胞的活性(图4)。可见，何首乌属植物齿叶蓼具有潜在的抗癌药用功效，为更好的开发齿叶蓼这一彝族传统药用植物在抗癌药物研发中的应用提供了理论依据。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
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