基于pcr技术克隆已知区域旁邻的未知dna序列的引物及方法
阅读说明：本技术 基于pcr技术克隆已知区域旁邻的未知dna序列的引物及方法 (Primer and method for cloning unknown DNA sequence adjacent to known region based on PCR technology ) 是由 王高华 李阳 于 2019-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物及方法。引物包括5’端接头区域、中间简并区域和3’端锚定碱基三个组成部分,其中根据物种碱基的偏好性的不同,针对三种碱基群体分布,设计引物的简并区域。引物的设计结合优化后的PCR扩增反应,特异性强,适应性广,能有效地扩增出已知区域旁邻的未知DNA序列。其操作简便,仅需一轮交错热不对称PCR反应,大大节省了商业成本,增加了扩增效率。本发明采用同源重组的形式克隆PCR扩增产物,使非特异性产物在进行同源重组时可以成功的规避掉。同时,在扩增的目标片段为多条或不清晰时,也依然可以进行同源重组反应,获得完整清晰的目标序列。因此,显著减少了实验投入,提高实验效率。(The invention relates to a primer and a method for cloning unknown DNA sequences adjacent to a known region based on a PCR technology. The primer comprises three components of a 5 'end connector region, a middle degenerate region and a 3' end anchoring base, wherein the degenerate region of the primer is designed according to the distribution of three base populations according to the difference of the preference of species bases. The design of the primer is combined with the optimized PCR amplification reaction, the specificity is strong, the adaptability is wide, and the unknown DNA sequences adjacent to the known region can be effectively amplified. The method is simple and convenient to operate, only one round of staggered thermal asymmetric PCR reaction is needed, the commercial cost is greatly saved, and the amplification efficiency is increased. The invention adopts a homologous recombination form to clone a PCR amplification product, so that a non-specific product can be successfully avoided when homologous recombination is carried out. Meanwhile, when the amplified target segment is multiple or unclear, homologous recombination reaction can still be carried out to obtain a complete and clear target sequence. Therefore, the experiment investment is obviously reduced, and the experiment efficiency is improved.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物及方法。
背景技术
染色体步移(Genome Walking)技术是一种由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。对于已经完成基因组测序的模式生物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等)，可以从数据库中轻松的找到已知序列的侧翼序列。但是目前为止，自然界绝大多数生物基因组DNA序列仍未知，要想知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能通过染色体步移技术。传统的染色体步移方法有反向PCR、接头PCR、质粒拯救等技术。由于传统方法的效率低，实验繁琐，灵敏度特异性差，所以近年来研究出许多高效的染色体步移技术，如TAIL-PCR(交错式热不对称PCR)、HiTAIL-PCR(高效交错式热不对称PCR)、FPNI-PCR(整合融合引物和巢式PCR)等。这些技术主要应用于已知DNA片段侧翼序列的步移、T-DNA***位点鉴定、基因组测序填补空隙等。
我国植物分子生物学研究越来越趋向于小众物种的研究和物种多样性研究，这些物种由于基因组数据库不完整，数据量有限，再加上亚种之间的多样性，导致详细的DNA序列难以获取，因此PCR染色体步移技术就是解决这“最后一段未知DNA序列”的最佳和最优技术。基于PCR的染色体步移技术最主要的问题在于如何在序列信息未知的条件下设计特异性引物来扩增未知区域以及如何优化、设计一套PCR产物克隆方法以实现高效克隆。虽然一些高效的染色体步移技术如TAIL-PCR试验步骤简单、自动化程度高、步移距离长，而且扩增特异性高，但随机简并引物存在有限的结合位点，特异性产物大小难以控制，在第2轮及第3轮扩增中仍可检测到非特异性带等，因此，即使使用不同的简并引物也难以扩增获得阳性结果。
发明内容
针对现有技术存在的技术问题，本发明提出了一种基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物及方法。从而可以避免染色体步移过程中非特异性扩增或扩增条带不清晰难以获得产物完整序列的问题，能显著减少在实验上的投入，提高实验效率。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提出一种基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物，包括简并引物和接头引物；所述简并引物根据物种碱基偏好性的不同，包括针对GC含量＞60％碱基序列的简并引物SEQ ID NO:1-4，针对40％≤GC含量≤60％碱基序列的简并引物SEQ ID NO:5-7，针对GC含量＜40％碱基序列的简并引物SEQ ID NO:8-11；所述接头引物序列如SEQ ID NO:12-14所示；其中R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝G/C，W＝A/T，H＝A/T/C，B＝G/T/C，V＝G/A/C，D＝G/A/T，N＝A/T/C/G。
本发明的第二个目的是提出一种基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的方法，包括如下步骤：
(1)以已知基因组DNA为模板，以权利要求1的简并引物和特异性引物GSP1为引物进行第一轮PCR扩增；所述简并引物选自SEQ ID NO:1-2中的至少一种，或选自SEQ ID NO:3-4中的至少一种，或选自SEQ ID NO:5，或选自SEQ ID NO:6-7中的至少一种，或选自SEQID NO:8-9中的至少一种，或选自SEQ ID NO:10-11中的至少一种；
(2)以第一轮PCR扩增产物为模板，以接头引物AdP1和特异性引物GSP2为引物进行第二轮PCR扩增；所述接头引物AdP1序列如SEQ ID NO:12所示；
(3)以第二轮PCR扩增产物为模板，以接头引物AdP2和特异性引物GSP3为引物进行第三轮PCR扩增；
(4)回收第三轮PCR扩增产物，进行同源重组反应将目的片段克隆至载体，测序，得到完整的未知序列的信息。
进一步地，所述第一轮PCR扩增反应程序为：预变性90-95℃1-5min，91-97℃1-5min；(1)特异性反应90-96℃15-60s、T1 15-60s、68-75℃1-5min，3-10个循环；(2)简并引物杂交反应90-96℃15-60s、20-30℃2-5min、0.1-0.5℃/s、68-75℃1-5min；(3)交错式热不对称PCR反应90-96℃15-60s、T1 15-60s、68-75℃1-5min、90-96℃15-60s、T1 15-60s、68-75℃1-5min、90-96℃15-60s、40-48℃15-60s、68-75℃1-5min，8-15个循环；(4)68-75℃2-8min；所述T1为GSP1的Tm值。
进一步地，所述第二轮PCR扩增反应扩增程序为：91-97℃1-5min；90-96℃15-60s、T2 15-60s、68-75℃1-5min，15-40个循环；68-75℃2-8min；所述T2为GSP2的Tm值。
进一步地，所述第三轮PCR扩增反应扩增程序为：91-97℃1-5min；90-96℃15-60s、T3 15-60s、68-75℃1-5min，15-40个循环；68-75℃2-8min；所述T3为GSP3的Tm值。
进一步地，所述接头引物AdP2序列如SEQ ID NO:13所示。
进一步地，所述第三轮PCR扩增中的接头引物AdP2连接载体的同源臂Left序列，所述特异性引物GSP3包括载体另一端的同源臂Right序列。
更进一步地，所述接头引物AdP2序列如SEQ ID NO:14所示。
1、引物设计思路
本发明引物由三个部分组成：5’端接头区域、中间简并区域和3’端锚定碱基。其中简并引物是针对物种碱基的偏好性的不同，根据三种碱基群体分布而设计的，分为：(1)高GC含量的碱基序列；(2)中性的碱基序列；(3)低GC含量的碱基序列。针对每一种群体引物的简并区域又设计两种简并区域：(1)简并度比较高，随机性强的引物RDP(RandomDegenerate Primers)；(2)简并度低，随机性差，特异性强的引物ADP(ArbitraryDegenerate Primers)。RDP是由简并碱基H、B、V、D、N组成的简并区域，因为这些简并碱基都包含3-4个碱基，由此设计简并度高，结合到目的基因侧翼的可能性和扩增长度都会提升，但非特异性扩增会增加；而ADP是由简并碱基和A、T、G、C这些固定碱基组合而成，使简并度降低，但特异性会提高，非特异性扩增会减少。3’端锚定碱基采用了HiTIAL-PCR四碱基方式，降低非特异性扩增。
本发明根据物种碱基的偏好性的不同，针对三种碱基群体分布设计了11条简并性引物和三条接头引物，其中简并引物总共六类：LRD-L、LRD-N、LRD-H、LAD-L、LAD-N和LAD-H，这六种引物，同类之间可以进行混合使用以增加简并度。后续采取巢式PCR的形式扩增，所以后续设计了两条巢式的接头引物AdP1和AdP2，该引物为普通PCR扩增引物。
SEQ ID NO:1 LRD-H1：acgatggactccagacggtcbnvnnnggtt
SEQ ID NO:2 LRD-H2：acgatggactccagacggtcbvnvbnnnggtt
SEQ ID NO:3 LAD-H1：acgatggactccagacggtcabgcvtvcgbasnggtt
SEQ ID NO:4 LAD-H2：acgatggactccagacggtcvgcbtvcgbasnggtt
SEQ ID NO:5 LRD-N：acgatggactccagacggtcnnnnnnnnggtca
SEQ ID NO:6 LAD-N1：acgatggactccagacggtcyrnnygmnnkrnggtca
SEQ ID NO:7 LAD-N2：acgatggactccagacggtcrnnygmnnkrnggtca
SEQ ID NO:8 LRD-L1：acgatggactccagacggtchndnnnggaa
SEQ ID NO:9 LRD-L2：acgatggactccagacggtchdndhnnnggaa
SEQ ID NO:10 LAD-L1：acgatggactccagacggtcwgnagwancawaggt
SEQ ID NO:11 LAD-L2：acgatggactccagacggtcdtahcdathgwnggaa
SEQ ID NO:12 AdP1：gagtttaggtccagcgtccgtcgacgatggactccagacggtc
SEQ ID NO:13 AdP2：tcgacgatggactccagacggtc
其中r＝a/g，y＝c/t，m＝a/c，k＝g/t，s＝g/c，w＝a/t，h＝a/t/c，b＝g/t/c，v＝g/a/c，d＝g/a/t，n＝a/t/c/g。
2、PCR扩增设计思路
由于AD的兼并区域是与已知片段的附近进行匹配结合，AD引物量太少导致结合到已知片段附近的可能性降低，扩增效果降低；而AD引物量过多会使非特异性扩增急剧增加，导致后续扩增出来假阳性条带增多，因此本申请在第一轮PCR体系中AD引物是基因特异性引物1(GSP1)引物的5倍左右，而后两次PCR反应为巢式PCR反应。
在第一轮PCR反应，扩增条件中分为三部分：(1)特异性扩增阶段进行5-10个循环的反应，该阶段的退火温度较高与相应的GSP1引物Tm值相匹配；(2)退火杂交过程，在低温反应2-5min，增加简并区域与模板DNA配对的可能性；(3)交错热不对称PCR反应，设置2轮特异性高温反应和1轮非特异性的低温反应，该反应进行8-15个循环。第二轮PCR和第三轮PCR反应为巢式PCR反应，增加扩增的特异性，简便扩增条件，不再进行交错热不对称PCR反应。
3、目标序列克隆方式优化思路
本发明采用同源重组的形式进行克隆PCR扩增产物，在AdP2引物上加上pUC线性化载体的同源臂Left，为AdP2(HR-L)，在GSP3引物上加上pUC线性化载体另一端的同源臂Right(线性化载体pUC序列见SEQ ID NO:27)，为GSP3(HR-R)，这样在第三轮PCR的产物两端就带有了pUC线性化载体两端的同源臂，在同源重组过程中，那些非特异性扩增产物AD-AD和GSP-GSP，因为两端的同源臂只含有Left或Right端，在进行同源重组时可以成功的规避掉；所以后续的阳性克隆产物就是目标序列。实验表明，同源重组的连接方式还有一大优势，在扩增的目标片段多条或不清晰时，依然可以回收到PCR产物，即使回收量低，也可以进行同源重组反应，把真正的目标序列克隆出来，再经过PCR检测和测序，就可以获得完整清晰的目标序列。
SEQ ID NO:14AdP2(HR-L)：ccagtgaattcggatccaagctttcgacgatggactccagacggtc
因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)本发明的AD引物包括5’端接头区域、中间简并区域和3’端锚定碱基三个组成部分，其中根据物种碱基的偏好性的不同，针对三种碱基群体分布，设计的引物的简并区域。引物的设计结合本发明的优化后的PCR扩增反应，特异性强，适应性广，能有效地扩增出已知区域旁邻的未知DNA序列。其操作简便，使用的三轮PCR扩增中只需一轮交错热不对称PCR反应，整个PCR扩增、产物回收和克隆也可在9-10h之内完成，大大节省了商业成本，减少人力物力的投入，增加了扩增效率。
(2)本发明采用同源重组的形式进行克隆PCR扩增产物，使非特异性产物在进行同源重组时可以成功的规避掉，从而后续的阳性克隆产物基本就是目标序列。同时，在扩增的目标片段为多条或不清晰时，也依然可以进行同源重组反应，获得完整清晰的目标序列。因此，显著减少了实验投入，提高实验效率。
附图说明
图1为实施例1中表示EjCAL已知序列及GSP引物位置的示意图，其中下划线标识和方框标识为GSP引物位置。
图2为实施例1中第三轮PCR扩增后DNA的琼脂糖凝胶电泳照片，其中M表示6000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp DNAmarker。
图3为实施例2中表示AaMYB6启动子已知序列及GSP引物位置的示意图，其中方框标识处即为GSP引物位置。
图4为实施例2中第三轮PCR扩增后DNA的琼脂糖凝胶电泳照片，其中M表示5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp DNA marker。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克著)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本实施例中已知序列为枇杷(Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl)基因EjCAL部分序列，序列如SEQ ID NO:15所示，其GSP引物位置见图1。本实验的扩增体系采用的酶是南京诺唯赞生物科技有限公司的LAmp DNA Polymerase类。实验详细步骤如下：
1、合成引物：
(1)随机兼并性引物合成
SEQ ID NO:1 LRD-H1:acgatggactccagacggtcbnvnnnggtt
SEQ ID NO:12 AdP1:gagtttaggtccagcgtccgtcgacgatggactccagacggtc
SEQ ID NO:14 AdP2(HR-L):ccagtgaattcggatccaagctttcgacgatggactccagacggtc
(2)GSP引物合成
SEQ ID NO:16 EjCAL-GSP1:gagaagacaataagtgccacatcagca
SEQ ID NO:17 EjCAL-GSP2:ccacatcagcatcacacagaacagag
SEQ ID NO:18
EjCAL-GSP3(HR-R):tgaccctcgaggagctcctgcagtcacttgcctgcttatcgtgttctc
注：下划线部分是pUC克隆载体的同源臂序列。
2、实验反应体系和条件
(1)第一轮PCR扩增
第一轮PCR扩增反应中，分为三部分：(1)特异性扩增阶段，该阶段的退火温度较高与相应的GSP1引物Tm值相匹配；(2)退火杂交过程，在低温25℃反应3-5min，增加兼并区域与模板DNA配对的可能性；(3)交错热不对称PCR反应，设置特异性高温反应2轮和1轮非特异性的低温反应。
反应体系：2×Vazyme LAmp Master Mix：12.5μL
LRD-H1(10μM)：2.5μL
EjCAL-GSP1(10μM)：0.75μL
Template(50-100ng的DNA)：0.5-1μL
加ddH2O至25μL
反应程序：
(2)第二轮PCR扩增
反应体系：2×Vazyme LAmp Master Mix：12.5μL
AdP1(10μM)：0.5μL
EjCAL-GSP2(10μM)：0.75μL
Template(第一轮PCR原液稀释50倍)：0.5μL
加ddH2O至25μL
反应程序：
(3)第三轮PCR扩增
反应体系：2×Vazyme LAmp Master Mix：12.5μL
AdP2(HR-L)(10uM)：0.5μL
EjCAL-GSP3(HR-R)(10uM)：0.5μL
Template(第二轮PCR原液稀释10倍)：0.5μL
加ddH2O至25μL
反应程序：
本实施例中的三轮PCR扩增反应程序及其参数旨在具体说明本实施例的反应过程，但不能解释为限制本发明的范围。本发明第一轮PCR扩增反应扩增程序为：预变性90-95℃1-5min，91-97℃1-5min；(1)特异性反应90-96℃15-60s、T1 15-60s、68-75℃1-5min，3-10个循环；(2)简并引物杂交反应90-96℃15-60s、20-30℃2-5min、0.1-0.5℃/s、68-75℃1-5min；(3)交错式热不对称PCR反应90-96℃15-60s、T1 15-60s、68-75℃1-5min、90-96℃15-60s、T1 15-60s、68-75℃1-5min、90-96℃15-60s、40-48℃15-60s、68-75℃1-5min，8-15个循环；(4)68-75℃2-8min；所述T1为GSP1的Tm值。第二轮PCR扩增反应扩增程序为：91-97℃1-5min；90-96℃15-60s、T2 15-60s、68-75℃1-5min，15-40个循环；68-75℃2-8min；所述T2为GSP2的Tm值。第三轮PCR扩增反应扩增程序为：91-97℃1-5min；90-96℃15-60s、T3 15-60s、68-75℃1-5min，15-40个循环；68-75℃2-8min；所述T3为GSP3的Tm值。
3、扩增产物的克隆和测序
(1)第三轮PCR扩增后产物跑胶如图2所示。其中目标条带为1700bp左右。
(2)PCR产物的回收
使用核酸回收试剂盒或乙醇醋酸钠沉淀法回收图2中的第3轮PCR产物；根据ADP2(HR-L)和GSP3(HR-R)引物的同源臂与线性化载体pUC进行同源重组反应。反应体系为：Gibson Assenbly Mix 5μL，rDNA(50ng/μL)4.5μL，线性化载体pUC0.5μL(50ng/μL-100ng/μL)。同源重组反应条件为：50℃30min。
(3)转化
将重组反应体系转化大肠杆菌感受态细胞详细步骤见《分子克隆实验指南》，涂布于Amp+的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h，进行菌斑PCR鉴定。
(4)菌检
菌落或菌液PCR鉴定引物：
SEQ ID NO:19 PUC-M13F:acatttcgtaaaacgacggc
SEQ ID NO:20 PUC-M13R:tatggaaaaacgccagcaac
(注：该阳性克隆的测序引物也是PUC-M13F和PUC-M13R)
选取阳性菌落测序，其余50μL菌液接种到含有5-10ml(Amp+)抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒。
4、结果分析
经由上述实验经过测序获得染色体步移的EjCAL基因上游序列约1700bp，序列如SEQ ID NO:21所示。
实施例2
本实施例已知序列为红掌(Anthurium andraeanum Linden)AaMYB6基因的一段启动子序列(SEQ ID NO:22所示)，其GSP引物位置见图3。扩增体系采用的酶是南京诺唯赞生物科技有限公司的LAmp DNAPolymerase类。
1、合成引物
(1)随机兼并性引物
SEQ ID NO:10 LAD-L1:acgatggactccagacggtcwgnagwancawaggt
SEQ ID NO:12 AdP1:gagtttaggtccagcgtccgtcgacgatggactccagacggtc
SEQ ID NO:14 AdP2(HR-L):ccagtgaattcggatccaagctttcgacgatggactccagacggtc
(2)GSP引物
SEQ ID NO:23 AaMYB6-GSP1:ggtcttcactgtaaatctgtgcgatg
SEQ ID NO:24 AaMYB6-GSP2:atcccattgatttaggaccacagta
SEQ ID NO:25
AaMYB6-GSP3(HR-R):tgaccctcgaggagctcctgcagctgagctaaattagggaggaaagaca注：下划线部分是pUC克隆载体的同源臂序列。
2、实验反应体系和条件
本实施例PCR反应体系和反应条件与实例1的操作步骤相同。
3、扩增产物的克隆和测序
(1)第三轮PCR扩增后产物跑胶如图4所示。其中目标条带为1900bp左右。
(2)本实施例PCR扩增产物的克隆和测序方法与实例1的操作步骤一致。
4、测序结果
经由上述实验经过测序获得染色体步移的AaMYB6启动子片段上游序列约1914bp，序列如SEQ ID NO:26所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北伯远合成生物科技有限公司
<120> 基于PCR技术克隆已知区域旁邻的未知DNA序列的引物及方法
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgatggact ccagacggtc bnvnnnggtt 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgatggact ccagacggtc bvnvbnnngg tt 32
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgatggact ccagacggtc abgcvtvcgb asnggtt 37
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgatggact ccagacggtc vgcbtvcgba snggtt 36
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgatggact ccagacggtc nnnnnnnngg tca 33
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgatggact ccagacggtc yrnnygmnnk rnggtca 37
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgatggact ccagacggtc rnnygmnnkr nggtca 36
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgatggact ccagacggtc hndnnnggaa 30
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgatggact ccagacggtc hdndhnnngg aa 32
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgatggact ccagacggtc wgnagwanca waggt 35
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgatggact ccagacggtc dtahcdathg wnggaa 36
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagtttaggt ccagcgtccg tcgacgatgg actccagacg gtc 43
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcgacgatgg actccagacg gtc 23
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccagtgaatt cggatccaag ctttcgacga tggactccag acggtc 46
<210> 15
<211> 304
<212> DNA
<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)
<400> 15
atgggaagag gtaaggttca gctgaagcga atcgagaaca cgataagcag gcaagtgaca 60
ttctcaaaga ggaggaccgg attgctcaaa aaagctcatg agatctctgt tctgtgtgat 120
gctgatgtgg cacttattgt cttctccacc aaagggaagc tctttgagta ttctactgat 180
tcgagcatgg agaggattct ggatcgatac gaacaatata cctttgcaga acggcaacta 240
aacggaacta atattgaatc acaggaaaac tggtctgtgg aataccccaa acttgcggca 300
agga 304
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagaagacaa taagtgccac atcagca 27
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccacatcagc atcacacaga acagag 26
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgaccctcga ggagctcctg cagtcacttg cctgcttatc gtgttctc 48
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acatttcgta aaacgacggc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tatggaaaaa cgccagcaac 20
<210> 21
<211> 1720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aggctctgat accaaattgt cacatcccgg cccgggcgca ccaccacaac ccaggcccga 60
ctccactgta gcacgatatt gtccgctttg ggccccaacc acgccctcac ggttttgttc 120
tgggttctca cccactcact gcgcattctg atgcttaggc agctttaggt ttaaatctat 180
tcatattttt ccacacctta tggcttcgtc accgtccagg tgtcggccag cacatctcga 240
ttcgatgtcc acgtggatat ttcaggtcag ggtgtgtcag atcgacaccg aattaagttg 300
atataaagtt ttccattaat caatataaca ctaaaaacac gcatattgag agtgtacgta 360
acaaaaggat aataattaaa acatattatt cggttattct acaacacaac tatttttttt 420
taaagtacaa acaatttttt tttgttcatt tagttttagt ggtgattaaa aaaaagctcc 480
aaattaaact gatcaatttg ggtttggtgc tttcattcat tttttttttt tagaacaaag 540
gcctatatag tactcctaaa gaaaaatggt tgcatgtgcc aagtgccacc aaatgaaagg 600
gcgtcctaga catatagagg agttatcgaa ttctcgcttt ttgttaacaa aatgagttga 660
aatcccctta aaaagtggtc acatgctgtt tcattaattt cttctattga atgtgacttt 720
ttgttaataa atacactttc acacataaag gacaaacttg gagaggaaat taagttgaag 780
ggcgaaagtg gaaaagcacg aagtgtttag gagggcaata cgaaattaac attctaccag 840
tatatttcag ggggagattt aacaaaacac ttccggtact gtttactttt aatgaaaaac 900
catatttata tgtttttctg gtactattca ccataccttt aaaagggact tttcattaaa 960
aatgaagttt tttttggact tttcgttagt gttccttata tttcatcaag agataggcca 1020
tataaatttg gatggttaga aatataaagt tataattcat acttaattaa tctttggttg 1080
gaataattaa taaagcttag aagtgacgtc agcaacggca aatgcatacc atgctcctat 1140
aatgccttcc gtttggtccc gcagagctta acctgacaag atatttgtac ggactgtctg 1200
caatcctgtg actaaactga gacactaagc aactgaattg gccttttgga ccactatcaa 1260
ttcgacaacg cattacccca ataccaccag gtttcccaaa actaccattc tctctctctc 1320
tttctctctc tccctctctc tctctcccca tatttatgca cagcgccttc gcttccacaa 1380
aacctcccaa tacaaaaata gaaagacact acaaaaaaag cccctacaga aaacgcccct 1440
tctttcttcc ttatcattct tttgcttttt atcatcatcc agctgcttcc tttcctttct 1500
tgtatgaacc aaatttaggg ttttctctca aattgggtat attttcaatc tcttgggttt 1560
ctaagcacta aaaaagcaag tggtacttct tcttctccct cctttctata tttagcaata 1620
tataaggggg aaaaaaagaa agggaaaata aaaaggaaaa aaatgggaag aggtaaggtt 1680
cagctgaagc gaatcgagaa cacgataagc aggcaagtga 1720
<210> 22
<211> 456
<212> DNA
<213> 红掌(Anthurium andraeanum Linden)
<400> 22
ccgacgatca gctgtactct ctgttgtagc caccagatga attatcaagt gtattgtctt 60
tcctccctaa tttagctcag aggaggcatt gatgaaaatg gcattgtatc ttctttgggt 120
tgcatcagta tactgtggtc ctaaatcaat gggatcccac agataacctg gtgaacacaa 180
ctaatagtca gcatccatat aagagtatgg tggctgcaag ttgcacccaa gccatctcat 240
gacagcatga ttgtgttcag attcttatgt attaccattt tccattgctt ttattgaata 300
ttcgcctgta atatttcgtg actaatcatc gcacagattt acagtgaaga ccttctgatg 360
aagttcgatt ttctaaccat atattccccc cttcatgaca tgagaaaatg cttgaggaga 420
aacaattatc aagattgctt tttgataagg aatggt 456
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggtcttcact gtaaatctgt gcgatg 26
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atcccattga tttaggacca cagta 25
<210> 25
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgaccctcga ggagctcctg cagctgagct aaattaggga ggaaagaca 49
<210> 26
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agaggagtaa caaagggaaa taagtataat aatatccctt ctcgacatta aattttgcgt 60
gaataaaatt gtgaaacgcc attaattgac aaagattgct tatttggtac ctgtaataag 120
agaattgttt cattctcatt gatgtgtcaa attgggcgtc aagaagatgt tttactatac 180
cattttccat aataaagaaa tccaactgtt atatttgact catttataat acaaattttt 240
aggataacag aaaaattgaa tatgagagta tattttttag ctttgttctc ccatgagttc 300
ttaaaggaga cccttcgatg gagatccctt acgtacacat gacattgtta atgggtaaac 360
catacatcac actttactgg gttgatgtat atgatataaa attataagta atggcttacc 420
taaattttat tgtaatgttt tcagggtttt aagactttcg ggtcaagttt gtctaagccc 480
agcgaattaa gaaatgaaat gattccaccg aattaagaaa tgaaatgagt ccactcgtaa 540
ctacttgact cggaccgagg cagctatagt gtgatttggt atgcgaataa ctaccatttt 600
ttattggaca aggagggtta gataaaaggt tacacaccac ttttatcttg ttgtcattct 660
accctctttc ctctcacccc tccatattct tctactctct ttcaaaaaca tttctcttca 720
cctacttatc cacctcataa cggagccaac caaacacaaa atggaggtga ataacttcat 780
acattaccaa actcaacaag cacataaata cttatccacc tcttcctact tgtccacctc 840
cccacttatc cacataccaa ataaaggcta taagacctca agcaatggct tggtgaaaga 900
atatattcaa attaatccga gtggttaact cagttcaacc atacaacacc ctctcacatg 960
ggttagactt actctagatt taaaccggtt gaaccctaag ctttccaaag taaaatcaag 1020
ctttctgagt taaatccacc tcaaatttaa tcctatccca atctactgtt ttgccaaaac 1080
agtcccaaat atctattgac agtccatctt tggccactag tttaaattac tcttactttg 1140
ttttcaagta actctattct gacctattga cagtcctgac ccacttaaca tattataacg 1200
tgctttgaat tactcttctg tattcttgaa aattatggca gatgagaata taagtgagat 1260
ccatcttact ctagcattac gtcgcaatca ttcatcgata tggaattatc caaacaaaag 1320
tgtgcatttg tgttttaggc agaaaggacg acatttgtgt tctaaaaaaa aaaataaaaa 1380
aaatcatccg taacatttct tcaaacttta gaaaaaatgt ccctaatccc acagtgagtt 1440
gtgtatgaga attgctgctt ggcggtcgtg tagtttgtga cactataact gccatcatgg 1500
ttttgataat catagatctt atggttgtaa aaagattata aggtttgata gatgtaacca 1560
cggttgtgat aaccatgcca agctcttgca gctggtgttt tcttaaatca aatgcaacct 1620
ggtctcggcc ttctataatc tccaaggcaa tctcagtaat gaaaatttag catgagacct 1680
aaatgatggc tagttgaaat caccagaaag gggactagag gagggagagg tggtcctcca 1740
ccaagagtag taaaaaaatt atttcgatgg atcaaccaga actaccaact ctttcccata 1800
caatccaagt atctattgca cccatttatt gcctgacatg atgaacctgc actctccctt 1860
gtagccacca gtgaattatc aagtgtattg tctttcctcc ctaatttagc tcag 1914
<210> 27
<211> 1819
<212> DNA
<213> 线性化片pUC57序列及同源臂序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctgcaggagc tcctcgaggg tcatagctgt ttcctgcgcg ttgctggcgt ttttccatag 60
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 120
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 180
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 240
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 300
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 360
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 420
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 480
ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 540
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 600
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 660
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 720
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 780
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 840
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 900
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 960
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 1020
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 1080
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 1140
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 1200
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 1260
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 1320
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 1380
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 1440
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 1500
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 1560
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 1620
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 1680
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 1740
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttcgtaaaa cgacggccag 1800
tgaattcgga tccaagctt 1819