一种用于微量复杂性物证检材dna提取纯化的试剂盒与提取方法
阅读说明：本技术 一种用于微量复杂性物证检材dna提取纯化的试剂盒与提取方法 (Kit for extracting and purifying DNA (deoxyribonucleic acid) of trace complex material to be detected and extraction method ) 是由 朱灿灿 朱灵 胡安中 杨柯 崔俊生 邓国庆 刘勇 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒与提取方法。所述试剂盒可有效进行多年陈旧布类、铁锈、泥土、色素中DNA提取纯化,由裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠和洗脱液六部分组成,该试剂盒提取DNA的方法包括以下步骤：裂解液对检材中细胞的消化、磁珠吸附DNA、磁珠分离、磁珠漂洗、DNA洗脱。本发明的创新点是在于一种特殊的试剂体系,可有效去除复杂物证检材中的抑制物如腐殖酸、多糖以及阳离子等,有利于含有铁锈、泥土、色素等复杂检材中DNA的提取,使得DNA纯度更高,完整性更好,更有利于下游的STR扩增与电泳图谱分析。(The invention provides a kit for extracting and purifying trace complex material evidence DNA and an extraction method. The kit can effectively extract and purify DNA in old cloth, rust, soil and pigment for many years, and consists of lysis solution, binding solution, rinsing solution 1, rinsing solution 2, nano magnetic beads and eluent, and the method for extracting DNA by the kit comprises the following steps: digesting cells in a test material by a lysis solution, adsorbing DNA by magnetic beads, separating the magnetic beads, rinsing the magnetic beads and eluting the DNA. The innovation point of the invention is a special reagent system, which can effectively remove inhibitors such as humic acid, polysaccharide, cation and the like in complex material to be detected, is beneficial to the extraction of DNA in complex material to be detected containing rust, soil, pigment and the like, ensures that the DNA has higher purity and better integrity, and is more beneficial to the downstream STR amplification and electrophoretic map analysis.)
技术领域
本发明涉及一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒与提取方法，属于生物和医学检验技术领域。
背景技术
DNA是自然界生物几乎都含有的生物大分子，每个生物之间都有其特异性，利用短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分型技术可以有效的对每个生物进行准确识别，DNA检验技术是案件侦破过程中使用的重要方法之一。通常情况下，公安部门人员在案发现场锁定物证类型多为脱落细胞类，主要包括实物物证与擦拭物证，此类物证可能是陈年的旧衣服类且易脱色。由于案发现场环境复杂，搜集的物证检材中可能含有铁锈、泥土等物质，这类样本通常含有大量的多糖、腐殖酸及阳离子，对于这类微量且复杂物证检材很难有行之有效的方法提取高纯度的DNA。目前市面上用于提取纯化DNA的方法有Chelex100法、硅珠过柱法、磁珠法等。而这些方法存在一定不足：如Chelex100法提取DNA需要对物证进行清洗，使得本来微量的DNA样本进一步损耗；硅珠过柱法提取复杂DNA，操作繁琐、灵敏度低、抗抑制能力弱；目前市面上虽然有基于磁珠法原理的自动化DNA提取工作站，但无法实现含有多种抑制物检材DNA的高效提取，导致STR位点检出率低。上述三种方法虽然对常规检材提取效果较好，但都不能解决复杂检材的抑制性问题，这些复杂检材包含：多年陈旧布料、铁锈、泥土、色素等。
针对上述情况，有必要开发一种即具有高提取灵敏度，又要有超强去杂质能力的DNA提取纯化试剂盒，依据该试剂盒体系的建立，可以实现微量复杂样本检材中DNA的高效提取与纯化。
发明内容
本发明主要目的是在于提供一种提取与纯化复杂样本中微量DNA的方法，解决复杂样本中DNA提取纯化的难题，实现快速、简便、高质量地提取与纯化。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒与提取方法。所述试剂盒包括一种超强去杂质的裂解液、超高促进DNA与磁珠的结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液六部分。
本发明采用如下技术方案：
一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒，所述试剂盒包含：裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液。所述试剂盒能够有效去除复杂物证检材中的抑制物如腐殖酸、多糖以及阳离子等。
其中，所述裂解液组成为盐酸胍0.5-5mM；十二烷基磺酸钠1-5mM；EDTA 5-50mM；蛋白酶K 20-100mg/ml；PVP 2-80mM；所述的裂解液在使用时，使用醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M缓冲液调节PH值范围为3.5-6。
所述结合液组成为异硫氰酸胍2-6M，醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M，DMSO 1-100mM。
所述漂洗液1组成为盐酸胍1-3M，无水乙醇体积百分比55％，醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M。
所述漂洗液2组成为醋酸钠0.5-2M，无水乙醇体积百分比75％；
所述纳米磁珠悬浮液中，悬浮纳米磁珠尺寸为50-100nm。纳米磁珠悬浮液中，所述磁珠质量百分比为10-30％，使用0.5-1xPBS作为缓冲液。磁珠材料包括铁化合物、钴化合物和镍化合物中的一种或多种。
所述洗脱液组成为0.1-0.5X TE。
所述裂解液作用为，包括具有特定工作浓度的盐酸胍、十二烷基磺酸钠、EDTA、PVP、蛋白酶K和醋酸0.2-1M、醋酸钠0.2-1M、缓冲液协同作用，赋予了本发明对于人脱落细胞有良好的裂解功能，适用于人DNA的提取，并能保证DNA结构的完整性，能鳌合阳离子、溶解腐殖酸与多糖等物质，从而实现复杂样本杂质的去除；
所述结合液作用为，提供DNA与磁珠有效的结合环境，其中DMSO的加入有利于促进磁珠免受杂质的干扰，促进磁珠能有效的与DNA进行结合与吸附作用。
所述漂洗液作用为通过漂洗液操作，可以有效去除磁珠上除DNA以外的所附着的杂质，进一步提高磁珠吸附的DNA在质量，有利于后续STR扩增使用；通过优化漂洗液所含的离子浓度以及无水乙醇的含量，进行梯度的溶解与洗涤除DNA以外的离子、蛋白、多糖等。
所述纳米磁珠，为磁性纳米粒子，在结合液的作用下能够有效的与DNA的结合，其尺寸为50-100nm，分散在0.5-1xPBS缓冲液中。
制备如上所述的试剂盒的方法，包括如下步骤：
按照各组分含量分别配制裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液。
本发明同时提供如上所述的一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒的提取方法，包括如下步骤：
1)取待提取物证片段或擦拭的棉签放入离心管中，向离心管中加入裂解液，接着加入蛋白酶K溶液，涡旋混匀后，放入恒温摇床温浴；
2)温浴后，离心；取出上清液于新的离心管中，向上清液中等体积加入结合液，再加入纳米磁珠悬浮液，室温，放于振荡器中连续振荡吸附；
3)吸附完成后，将离心管置于磁力架上，静置，吸弃管中废液，保留磁珠；
4)向离心管中加入漂洗液1，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠；
5)向离心管中加入漂洗液2，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠；
6)将离心管置于室温干燥；
7)加入洗脱液，涡旋振荡，使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
进一步地，步骤1)中，取待提取物证片段或擦拭的棉签放入离心管中，取150-600μl裂解液，按照加入裂解液总体积的5％～10％加入蛋白酶K溶液，涡旋混匀后，放入56～60℃恒温摇床温浴8-30min；优选地，步骤1)中，取待提取物证片段或擦拭的棉签放入离心管中，取150-600μl裂解液，按照加入裂解液总体积的5％加入蛋白酶K溶液，涡旋混匀后，放入56℃恒温摇床温浴8-30min。
进一步地，步骤2)中，温浴后，离心10000rpm，1min；取出上清液于新的离心管中，向上清液中等体积加入结合液，再加入10-20μl纳米磁珠悬浮液，室温，放于振荡器中连续振荡吸附10-20min；
进一步地，步骤3)中，吸附完成后，将离心管置于磁力架上，静置5-10min，吸弃管中废液，保留磁珠。
进一步地，步骤4)中，向离心管中加入500-1000μl漂洗液1，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠。
进一步地，步骤5)中，向离心管中加入500-1000μl漂洗液2，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠。
进一步地，步骤6)中，将离心管置于室温干燥5-20min。
进一步地，步骤7)中，加入30-70μl洗脱液，涡旋振荡，使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
特别地，本发明同时提供如上所述的一种用于微量物证复杂性检材DNA提取纯化的试剂盒的提取方法，包括如下步骤：
1)取待提取物证合适大小片段或擦拭的棉签放入离心管中，向离心管中加入100-600μl裂解液，接着按照裂解液总体积的5％加入蛋白酶K溶液，涡旋混匀后，放入56-60℃恒温摇床温浴8-30min；
2)温浴后，离心10000rpm，1-5min；取出上清液于新的离心管中，向上清液中等体积加入结合液，再加入10-20μl纳米磁珠悬浮液，室温，放于振荡器中连续振荡吸附10-20min；
3)吸附完成后，将离心管置于磁力架上，静置5-10min，吸弃管中废液，保留磁珠；
4)向离心管中加入500-1000μl漂洗液1，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠；
5)向离心管中加入500-1000μl漂洗液2，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠；
6)将离心管置于室温干燥5-20min；
7)加入30-70μl洗脱液，涡旋振荡，使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
本发明能发挥积极的作用在于：超高的DNA回收效率，可以对微量的脱落细胞进行高效的回收；超强的去除杂质能力，对铁锈、泥土、多年的陈旧布料等复杂的检材提取的DNA质量好，操作简单，所用时间较短，同时可以匹配自动化核酸提取仪，有效提高工作效率。
附图说明
图1不同提取方法提取复杂检材DNAreal-time PCR扩增曲线；
图2实施例1STR图谱；
图3实施例2STR图谱；
图4chelex-100提取复杂检材DNA STR图谱。
具体实施方式
根据上述发明的技术方案，借助一下实施例对本发明做进一步描述，该实施例作为示范性，仅供参考。
实施例1
为实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒，包括：超强去杂质裂解液、超高促进DNA与磁珠的结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液六部分组成，
其中，所述纳米磁珠为购买的商业化纳米磁珠(prenano-30-NA，金准智造生物科技有限公司)50nm；
所述裂解液组成为盐酸胍2mM；十二烷基磺酸钠3mM；EDTA20mM；蛋白酶K 20mg/ml；PVP 50mM；醋酸0.2M、醋酸钠0.2M缓冲液调节工作PH值为5；
所述结合液组成为异硫氰酸胍(5M)，醋酸0.2M、醋酸钠0.2M，DMSO(20mM)；
所述漂洗液1组成为盐酸胍(2M)，无水乙醇体积百分比55％，醋酸0.2M、醋酸钠0.2M，
所述漂洗液2组成为醋酸钠(1M)，无水乙醇体积百分比75％；
所述磁珠悬浮液中，纳米磁珠粒径为50nm，纳米磁珠质量百分比为10％，使用1xPBS作为缓冲液；
所述洗脱液组成为0.1-0.5X TE；
按照上述各组分含量分别配制裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液。
用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒的提取方法，包括如下步骤：
1)取待提取物证陈旧衣物同时带有铁绣、泥土混合物合适大小(1cmx2cm)片段放入离心管中，向离心管中加入200μl裂解液，接着加入40mg/ml的蛋白酶K溶液10μL，涡旋混匀后，放入56℃恒温摇床温浴10min；
2)温浴后，离心10000rpm，1min；取出上清液于新的离心管中，向上清液中等体积加入结合液，再加入10μl纳米磁珠悬浮液，室温，放于振荡器中连续振荡吸附10min；
3)吸附完成后，将离心管置于磁力架上，静置5min，吸弃管中废液，保留磁珠；
4)向离心管中加入500μl漂洗液1，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠；
5)向离心管中加入500μl漂洗液2，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠；
6)将离心管置于室温干燥10min；
7)加入50μl洗脱液，涡旋振荡，使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
实施例2
为实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒，包括：超强去杂质裂解液、超高促进DNA与磁珠的结合液、漂洗液1、漂洗液2、纳米磁珠悬浮液和洗脱液六部分组成，
其中，所述纳米磁珠为购买的商业化纳米磁珠(prenano-30-NA，金准智造生物科技(吉林)有限公司)50nm；
所述裂解液组成为盐酸胍1mM；十二烷基磺酸钠2mM；EDTA 10nM；蛋白酶K 30mg/ml；PVP 30mM；醋酸0.3M、醋酸钠0.3M缓冲液调节工作PH值为4.5；
所述结合液组成为异硫氰酸胍(4M)，醋酸0.3M、醋酸钠0.3M，DMSO(80mM)；
所述漂洗液1组成为盐酸胍(3M)，无水乙醇55％(体积百分比)，醋酸0.3M、醋酸钠0.3M；
所述漂洗液2组成为醋酸钠(2M)，无水乙醇75％(体积百分比)；
所述磁珠悬浮液中，纳米磁珠粒径为100nm，纳米磁珠质量百分比为20％，使用0.5xPBS作为缓冲液；
所述洗脱液组成为0.5XTE。
用于微量复杂性物证检材DNA提取纯化的试剂盒的提取方法，包括如下步骤：
1)取待提取物证陈旧衣物同时带有铁泥混合物合适大小(1cmx2cm)片段放入离心管中，向离心管中加入300μl裂解液，接着加入30mg/ml的蛋白酶K溶液15μL，涡旋混匀后，放入56℃恒温摇床温浴15min；
2)温浴后，离心10000rpm，1min；取出上清液于新的离心管中，向上清液中等体积加入结合液，再加入15μl纳米磁珠悬浮液，室温，放于振荡器中连续振荡吸附15min；
3)吸附完成后，将离心管置于磁力架上，静置8min，吸弃管中废液，保留磁珠；
4)向离心管中加入600μl漂洗液1，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠；
5)向离心管中加入600μl漂洗液2，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁珠后置于磁力架，吸弃液体保留磁珠；
6)将离心管置于室温干燥12min；
7)加入50μl洗脱液，涡旋振荡，使磁珠重悬至洗脱液中进行保存待用。
对比实验：为说明在复杂样本检材提取DNA的突出效果，本实验选择目前市面上使用的chelex-100作为对比方法，与本发明的试剂盒同时进行微量复杂样本检材DNA提取纯化实验。
chelex-100提取步骤
1)取与实施例1同样大小的多年陈旧布先放入去离子水中56℃孵育30min，样本释放到去离子水中去，吸出孵育液至新的2ml离心管中。
2)向含有样本的孵育液中加入等体积10％的chelex-100，放于90℃恒温振荡器100rpm1小时。
3)12000rpm离心5min后，取上清液用于PCR以及str扩增与电泳。
本发明实验中发明的试剂盒按照实施例1、2进行配置，样本与chelex-100所使用的样本相同，经过消化、裂解、吸附、漂洗和磁珠重悬的DNA。采用相同的荧光定量PCR与STR电泳；实验结果如图1、2、3、4和表1。图1为不同方法对微量复杂检材DNA提取的荧光定量效果对比；图2为实施例1STR图谱、图3为实施例2STR图谱、图4为chelex提取复杂检材DNA STR图谱。表1不同方法对微量复杂检材DNA提取的STR效果对比。由实验结果可以看出本发明的一种用于微量物证复杂性检材DNA提取纯化的试剂盒对于微量复杂检材DNA提取的优势突出。
表1不同方法对微量复杂检材DNA提取的STR效果对比
Chelex-100
实施例1
实施例2
复杂物质检材
未检出
STR位点齐全
STR位点齐全
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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