具体实施方式

本发明提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2A在大丽轮枝菌致病力中的应用。

在本发明中，所述VdILV2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。为了验证VdILV2A的缺失是否会影响大丽轮枝菌致病力，本发明以野生型菌株V592为基础菌株构建了敲除VdILV2A基因的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV2A，并在ΔVdILV2A基础上进行基因互补，得到互补菌株ECVdILV2A。所述敲除VdILV2A基因的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV2A的构建方法利用同源重组原理完成，具体可参见现有技术获得敲除以及互补突变体(WANG S,XING H,HUAC,GUO H S,ZHANG J.An improved single-step cloning strategy simplifies theAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation(ATMT)-based gene-disruptionmethod for Verticillium dahliae.Phytopathology,2016,106(6):645-652.)。本发明分别以ΔVdILV2A、互补菌株ECVdILV2A和野生型菌株V592为实验对象，分别测定以下指标：病情指数、维管束变褐程度、菌丝穿透力和寄主上的定殖能力，结果表明，敲除突变体ΔVdILV2A所致病害的病情指数分别为55.0～57.0；互补菌株的致病力明显恢复至野生型菌株的水平，病情指数高于90；同时接种30d时，对感病植株进行剖杆观察，敲除突变体ΔVdILV2A维管束变褐程度明显减弱；VdILV2A基因敲除突变体在接种第3d不穿透，而在第5d时能穿透玻璃纸，说明VdILV2A基因敲除导致大丽轮枝菌在玻璃纸上的穿透能力延迟；VdILV2A基因敲除使大丽轮枝菌在棉花根和茎中的定殖都受到一定阻碍。上述实验结果表明，VdILV2A基因敲除可降低大丽轮枝菌的致病力，即VdILV2A基因与大丽轮枝菌致病力相关。

本发明提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2A在大丽轮枝菌支链氨基酸生物合成中的应用。所述支链氨基酸优选包括亮氨酸。

在本发明中，为明确VdILV2A在支链氨基酸合成途径中的作用，在营养缺陷型培养基上培养敲除突变体ΔVdILV2A、互补菌株和野生型菌株V592，添加外源氨基酸，结果表明，5mM Leu对V592和ΔVdILV2A敲除突变体以及互补体ECVdILV2A均有反馈抑制作用，V592相较于敲除体与互补体反馈抑制作用最强；且5mM Leu抑制了VdILV2A基因的表达，VdILV2A参与了Leu的支链氨基酸生物合成途径，这表明VdILV2A基因是支链氨基酸合成途径中的重要组成部分。为了明确催化亚基ΔVdILV2A基因敲除对大丽轮枝菌支链氨基酸合成途径AHAS下游基因表达的影响，通过RT-qPCR分别对下游基因的转录表达进行测定，下游基因的相对表达量表现显著下调，其中异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸合成都必需的二羟酸脱水酶的4个基因(VDAG-03858、VDAG-04620、VDAG-05384和VDAG-09671)、支链氨基酸转氨酶的1个基因(VDAG-02852)和亮氨酸合成必需的2-异丙基苹果酸合成酶的1个基因(VDAG_03299)、3-异丙基苹果酸脱水酶的1个基因(VDAG_00564)、3-异丙基苹果酸脱氢酶的2个基因(VDAG-05325、VDAG-06467)。上述结果表明，AHAS单个亚基基因的敲除对支链氨基酸合成途径大多数下游基因的表达都有影响。

由于AHAS是除草剂作用的靶标，为了验证VdILV2A基因与除草剂的作用关系，采用磺酰脲类除草剂和双草醚接种野生型菌株V592，观察菌落形态发现在1638.4mg/L作用下苯磺隆和双草醚明显抑制了大丽轮枝菌的生长，V592不产生微菌核；并且采用3种不同浓度的苯磺隆和双草醚分别处理V592，结果表明VdILV2A基因的相对表达量呈下调趋势，且浓度越高下调越显著。这表明VdILV2A基因为杀虫剂的作用靶点。因此，本发明提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2A作为药物靶点在防治棉花黄萎病中的应用。

本发明提供了一种用于防治棉花病害的杀菌剂，主要活性成分包括降低大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2A表达的试剂。

在本发明中，所述试剂优选包括磺酰脲类除草剂和/或嘧啶水杨酸类除草剂。所述磺酰脲类除草剂的浓度优选不低于819mg/L，更优选为900～1638.4mg/L，最优选为1638.4mg/L。所述嘧啶水杨酸类除草剂的浓度优选不低于409mg/L，更优选为500～1638.4mg/L，最优选为1638.4mg/L。

本发明对所述杀菌剂的使用方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的杀菌剂的常规喷施方法即可。所述杀菌剂通过降低VdILV2A基因的致病力达到防控病害发生和发展的目的。

下面结合实施例对本发明提供的大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2A的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种敲除VdILV2A基因的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV2A的构建方法

根据VdILV2A基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的上下游同源比设计引物，利用同源重组技术，构建敲除载体，以野生型菌株V592为初始菌株，构建突变株，具体参见现有技术(WANG S,XING H,HUA C,GUO H S,ZHANG J.An improved single-step cloningstrategy simplifies the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(ATMT)-based gene-disruption method for Verticillium dahliae.Phytopathology,2016,106(6):645-652.)获得敲除VdILV2A基因的大丽轮枝菌突变株(ΔVdILV2A-1，ΔVdILV2A-2)。

实施例2

一种大丽轮枝菌VdILV2A基因互补突变体ECVdILV2A的构建方法

以实施例1构建的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV2A为初始菌株，参见现有技术(WANGS,XING H,HUA C,GUO H S,ZHANG J.An improved single-step cloning strategysimplifies the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(ATMT)-basedgene-disruption method for Verticillium dahliae.Phytopathology,2016,106(6):645-652.)获得大丽轮枝菌VdILV2A基因互补突变体(ECVdILV2A-1，ECVdILV2A-2)。

实施例3

为了明确VdILV2A基因敲除对大丽轮枝菌致病力的影响，以野生型菌株V592为对照，测定了VdILV2A基因敲除突变体对棉花的致病力。致病性测定方法如下：

把上述构建的敲除突变体、互补菌株和V592接种到Czapek-Dox液体培养基中26℃，200r/min摇培5d。棉苗第5片真叶长出后，通过使用根浸接种方法，每盆棉花接种200mL浓度为1.0×10⁷CFU/mL的菌液，每个菌株重复3个水培盒(共36株棉苗)。接种后每天都观察，从发病开始数病指，每隔3d数一次一般记录到发病后一个月，病害分级标准为：0级：不发病；1级：1～2片子叶发病；2级：1片真叶发病；3级：2片真叶发病；4级：3片及3片以上真叶发病。病情指数按照式I计算。

病情指数＝[Σ各级病株数×级数/(总株数×最高病级)]×100 式I

病情指数为3次生物学实验重复平均值。

第30天剖秆，用体式显微镜拍照维管束(Olympus SZX7,Japan)。

结果显示，敲除突变体ΔVdILV2A-1和ΔVdILV2A-2所致病害的病情指数分别为57.0和55.0；互补菌株的致病力明显恢复至野生型菌株的水平，病情指数高于90。接种30d时，对感病植株进行剖杆观察，敲除突变体ΔVdILV2A-1和ΔVdILV2A-2维管束变褐程度明显减弱(图2)。

实施例4

为了分析VdILV2A基因敲除导致大丽轮枝菌致病力下降是否与其穿透寄主的能力有关，以V592为对照，对VdILV2A敲除突变体菌株进行了玻璃纸穿透实验，具体方法如下：

在倒好的MM基本培养基上铺己高温灭菌处理过的大小基本与培养皿一致的玻璃纸。用牙签挑取菌丝接种到至玻璃纸中央，分别培养3d、4d和5d将玻璃纸扔掉，让菌株再长7d，看培养皿上是否能长出菌落，每个菌株设3个重复。

结果表明，VdILV2A基因敲除突变体则在接种第5d时才能穿透玻璃纸(图3)。这表明，VdILV2A基因的敲除使大丽轮枝菌穿透延迟，降低了大丽轮枝菌感染性。

实施例5

为了明确VdILV2A基因对大丽轮枝菌侵染及定殖能力的影响，对接种了野生型菌株V592、VdILV2A基因敲除突变体和互补菌株的棉株，通过qPCR进行真菌生物量测定。接种不同菌株后26d，取棉花的根(红茎线以下取根5cm)、茎(棉苗一半株高处取茎5cm)、叶，分别提取根、茎、叶的总DNA。qPCR所用引物[转录间隔区(Internaltranscribed spacer，ITS)-F(5'-TGTTGCTTCGGCGGCTCGTT-3'，SEQ ID NO:6)和ITS-R

(5'-GCGTTTCGCTGCGTTCTTCA-3')(SEQ ID NO:7)]是基于大丽轮枝菌核糖体RNA(Z29511)的ITS1和ITS2区设计的。以组成型表达的β-tubulin基因(DQ266153)作为内参基因(内参基因:β-tubulin-F：TCACCAGCCGTG GCAAGGTTG，SEQ ID NO:8；β-tubulin-R:AGCAAAGGGCGGTCTGGAC GTTG，SEQ ID NO:9)，对每个样品的总DNA进行标准化定量。每个反应设3个重复。

采用RT-qPCR检测定殖棉花不同组织中VdILV2A的表达情况，采用试剂盒法提取棉花不同组织的RNA，反转录得到的cDNA为模板进行RT-qPCR检测，设计的引物序列如下：

VdILV2A-qPCR-F：ATGTCGCCTGTCACCTCGC(SEQ ID NO:2)；

VdILV2A-qPCR-R：ATACAACCTCTGGCGCTCTCC(SEQ ID NO:3)；

β-tubulin-F：TCACCAGCCGTGGCAAGGTTG(SEQ ID NO:4)；

β-tubulin-R：AGCAAAGGGCGGTCTGGACGTTG(SEQ ID NO:5)；

大丽轮枝菌β-tubulin(DQ266153)是内参基因。

反应体系(10μL)：

RT-qPCR检测的反应程序如下：50℃2min；95℃2min；953s，60℃30s，共40个循环。结果的数据用7500Fast Real-Time PCR System进行分析，以2^-ΔΔCt的方法计算。

结果表明，ΔVdILV2A突变体在根和茎组织中的生物量均显著低于V592菌株和2个互补体菌株(图4)。以上结果表明，VdILV2A基因敲除使大丽轮枝菌在棉花根和茎中的定殖都受到一定阻碍；该结果与ΔVdILV2A突变体在棉苗上引起的病情指数和维管束褐变程度一致。

实施例6

为了确定亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸营养缺陷型对ΔVdILV2A、互补菌株和野生型菌株V592的菌丝生长的影响，在FGA固体培养基中添加不同浓度(1mM、5mM)的外源氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，进一步阐明亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸营养缺陷型对菌丝生长的影响，三种菌株在FGA固体培养基上的接种位置如图5A所示。

AHAS催化亚基基因ΔVdILV2A在FGA培养基上正常生长，为明确AHAS催化亚基基因在支链氨基酸合成途径中起的作用，发现5mM Leu对V592和ΔVdILV2A敲除突变体以及互补体ECVdILV2A均有反馈抑制作用，V592相较于敲除体与互补体反馈抑制作用最强，而异亮氨酸和缬氨酸并未产生相同结果(图5B)。

采用RT-qPCR法检测野生型菌株V592中VdILV2A基因的表达量，检测方法见实施例5记载。结果表明，5mM Leu抑制了VdILV2A基因的表达，VdILV2A参与了Leu的支链氨基酸生物合成途径(图6)。

上述结果表明，VdILV2A基因是支链氨基酸合成途径中的重要组成部分。

采用RT-qPCR法检测ΔVdILV2A基因敲除突变体中AHAS合成途径下游基因的相对表达量。

结果所显示的Ct值(Threshold cycle)定义为达到超出荧光信号的检测阈值时所需要的循环数，结果的数据用7500Fast Real-Time PCR System进行分析，以2^-ΔΔCt的方法计算。

所用引物序列如下：

表1 AHAS合成途径下游基因RT-qPCR检测用引物

RT-qPCR检测的反应条件和反应程序同上。

结果见图7。为了明确催化亚基ΔVdILV2A基因敲除对大丽轮枝菌支链氨基酸合成途径AHAS下游基因表达的影响，通过RT-qPCR分别对下游基因的转录表达进行测定，下游基因的相对表达量表现显著下调，其中异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸合成都必需的二羟酸脱水酶的4个基因(VDAG-03858、VDAG-04620、VDAG-05384和VDAG-09671)、支链氨基酸转氨酶的1个基因(VDAG-02852)和亮氨酸合成必需的2-异丙基苹果酸合成酶的1个基因(VDAG_03299)、3-异丙基苹果酸脱水酶的1个基因(VDAG_00564)、3-异丙基苹果酸脱氢酶的2个基因(VDAG-05325、VDAG-06467)。上述结果表明，AHAS单个亚基基因的敲除对支链氨基酸合成途径大多数下游基因的表达都有影响。

实施例7

AHAS抑制剂处理实验

选择了2种不同化学类型的除草剂，分别为苯磺隆(磺酰脲类除草剂)和双草醚(嘧啶水杨酸类除草剂)，分别配制浓度为12.8～1638.4mg/L的药液，分别接种至野生型菌株V592的菌落上，观察药剂对菌株生长的影响。

观察菌落形态发现，在1638.4mg/L作用下苯磺隆和双草醚明显抑制了大丽轮枝菌的生长，V592不产生微菌核(图8A)。

选择了3种浓度(409.6mg/L、819.2mg/L和1638.4mg/L)的苯磺隆和双草醚分别处理V592，测定VdILV2A基因的相对表达量，测定方法同实施例5记载。

结果表明，VdILV2A基因的相对表达量呈下调趋势，且浓度越高下调越显著(图8B)。这些结果表明，苯磺隆和双草醚都能抑制VdILV2A基因的表达。再次证明，VdILV2A是支链氨基酸合成的必需基因。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 石河子大学

<120> 大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2A的应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1926

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcgcctg tcacctcgcc ccttctgctt cgtcagcagg ccacatccca cgtccgccgc 60

ttcagccgag ggcgacgacg gccgttcaga tggagagcgc cagaggttgt atcccctgat 120

aattcagtca gcggtgccag cgccattctg cacgcacttc aggccgcaga cgtcactcat 180

ctcttcgtca atctcggctc ggaccaccca gctttcctga cggcgtttgc catgaaggcg 240

tatcccaggg tcaaggtcgt cacgtcgccg aatgagatga atgcgctgtc ggcagcctcg 300

ggctatgcca tggtcactgg gaagccagca gctgtactcg ttcacgtcga atgcggcaca 360

caggctttgg cgggcgcggt gcacaatatc agtaagggcc gcttgccggt ggtgatagtt 420

gccggcaccg tgcccatcac gatggaagga gagctaccgg ggagtcgtaa cgagtgcgtg 480

gatatcccag accagcgctc tatcgtccgt caatacatga agtatgatca tgagatccga 540

tctccgcaca atgctgtaca gattgtgctc cgggctcttc agatggcgac aagtacgccg 600

cagggcccaa catatgtcat cgcatcgcga gagacactcg aagcacaaac atcgatccaa 660

agcatcaagc cttcgcaaga tccagagaag aacctctggg tggagaaaat cggcctccac 720

atgcaagacg tcgcgcgctt gggcgacatt ctcatcaggg ccaagtcccc tctgatcgtc 780

acgagttatg ccggccggaa tcctgctgcc tttcgagcgc ttcacgattt ggcccggcgc 840

ctcgctatcc ccgtgcacga gaatgcgccg gtggttaaca atttcccgac gactagtttc 900

ctccaccaag gccaaacttg gaacggcggc gggcagctcg aggccttggc cgaagcagac 960

gtggtcctcg tcgtcgactc ggatgttcca tggataccgt ccgagtctag gccgagcgat 1020

gaggcccgcg tcttccacct cgactgcgat cctctgaaag gcagcgccac gctctggagt 1080

cttccggccg agaagcgctg gatgtgtgat gcatcggtgg cgttgaaaca gctagacgag 1140

tacgtcaaga cgagcctgga actctttact gaagctgcaa agagtaggat caacgtcagg 1200

acatctctgc tgacacggcg tttcgaggca cgagcgcgga gactcgaagc agaagaagtg 1260

gcctcttcag acggaaaggt cacggtgccg tactttatga gccgcttccg caaggcgaca 1320

gaaggtctcg acgtattagc gctcaacgag agcatgacca atcttggcaa ggtcgctgac 1380

cacctacggc acgaccaaca caactcactg ttgggcagtg gtggcggctc gctcgggtgg 1440

tattctgggg ctgctgttgg ggtggccatg gcgttgggag aagaggccgc tgtgggtgat 1500

gcggccgacc gtcttgtcac ggcgtttgtg ggagatggaa cgttcctgtt tggggtgcct 1560

gccagtgcct actggatggc catgcggtat gcgacgccgt acctaaccgt cgtctggaat 1620

aacggcggct ggacgagccc gaagaatgcc tgcttgagga ttcatcctga gatgaaagat 1680

tttgtgcgac gtagcgatgg cggaggacgg catgatggca gcagggcaac agctttggct 1740

gaggcgatgg gcgtcagcat ttcgccgtca ccttcgtttg gaaagattgc tgagggtgcc 1800

ggtgatgctt ggtggacagt cgtgaagagg gcagacgagg tcgatggagc catcgcggag 1860

gccgttcgga tggtgaggga gctcaagcga tgtgcagtga ttgaggtagc cattgccagt 1920

gtgtga 1926

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcgcctg tcacctcgc 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atacaacctc tggcgctctc c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaccagccg tggcaaggtt g 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcaaagggc ggtctggacg ttg 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgttgcttcg gcggctcgtt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgtttcgct gcgttcttca 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaccagccg tggcaaggtt g 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcaaagggc ggtctggacg ttg 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agagctcgag gccctcatct c 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcctccgtc gtcagtccg 19

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgctttcga ggtcatttgg catg 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacgagaatt tgttcagcgt ctcg 24

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggcagacc aacatcaaca gg 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttgcgcagg aatagcgaga ag 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgagagggca tgatttcccc g 21

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcagggattg ccctcccac 19

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaccccatca agaagtacaa gccc 24

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcagacttt ggttaccatc gc 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagtcccagt tcccaagacc 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtcagtggtc gcaagagtgc aatc 24

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

attgactggg ccaatgtcgg 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtggatgcgc ataaagggc 19

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atgtctgaca caaagacgtt tcgc 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgccgacaat gtctgtggtg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgtagtgttt ggaggcgacc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccgaggaggt gttcttggag 20