具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

干扰素激活蛋白(STING)是固有免疫反应中一个重要分子，在防御病毒及胞内细菌感染、介导I型干扰素产生过程中发挥重要功能。STING作为信号转导级联反应中的重要组成部分，既可以在病原体(病毒、细菌、寄生虫等)感染时发挥免疫防御作用，也可以在肿瘤发生时发挥抗肿瘤免疫反应。当cGAS-STING信号通路过度激活时，也可能引起一系列的自身免疫性疾病。

本发明发现，细胞尤其是免疫效应细胞电转结束转入培养基中培养一段时间后，加入cGAS-STING信号通路抑制剂进行培养能明显提高细胞电转后的存活率，由此完成本发明。

本文中，细胞可以是任何感兴趣的细胞，尤其是本领域常规用于电转、以表达外源基因的细胞，可以是真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细胞(如大肠杆菌和其他细菌等)。例如，细胞可以是人的细胞。细胞的例子包括但不限于HEK293细胞、MDCK细胞和Hela细胞等。在某些实施方案中，细胞是免疫细胞。本文中，免疫效应细胞指在免疫应答中参与清除异物抗原和行使效应功能的免疫细胞，包括但不限于T细胞、TIL细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR-T细胞、CIK细胞、TCR-T细胞和巨噬细胞中的一种或多种。优选地，在某些实施方案中，适用于本发明方法的免疫效应细胞选自T细胞、TIL和CAR-T细胞中的一种或多种。

本文中，cGAS-STING信号通路抑制剂可以是本领域周知的各种能抑制cGAS-STING信号通路的制剂，包括但不限于能够抑制cGAS-STING信号通路的蛋白、核酸和小分子化合物。例如，能够抑制cGAS-STING信号通路的蛋白包括抑制STING表达和/或结合活性的蛋白或降低或消除线粒体膜电势的蛋白，包括但不限于ULK1、ULK2、caspase3、caspase7和caspase9。能够抑制cGAS-STING信号通路的核酸包括但不限于靶向cGAS-STING信号通路或降低或消除线粒体膜电势的siRNA、反义RNA、核酶和基因编辑载体，如CRIPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体。能够抑制cGAS-STING信号通路的小分子化合物包括但不限于能够抑制STING表达和/或结合活性的小分子化合物或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物、能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物和能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物。所述能够抑制STING表达和/或结合活性的小分子化合物或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物包括但不限于式1-14中的小分子化合物。所述能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物包括但不限于式15-23中的小分子化合物。所述能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物包括但不限于式24-33中的小分子化合物。

在某些实施方案中，本发明涉及使用能够抑制STING表达和/或结合活性的小分子化合物或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物来培养电转的细胞，例如使用式1-14中的小分子化合物中的任一种或多种来培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)来培养电转。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式9所示小分子化合物Compound 18来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式12所示Compound 13来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式5所示化合物H-151来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式9所示小分子化合物18共同来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式12所示Compound13来培养电转的细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及使用能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物来培养电转的细胞，例如使用式15-23中的小分子化合物中的任一种或多种来培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式15所示化合物化合物奎纳克林来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式16所示化合物羟氯喹来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式19所示化合物RU.365来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式20所示化合物RU.521来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式15所示化合物化合物奎纳克林和如式16所示化合物羟氯喹共同来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式15所示化合物化合物奎纳克林和如式19所示化合物RU.365共同来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式15所示化合物化合物奎纳克林和如式20所示化合物RU.521共同来培养电转的细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及使用能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物来培养电转的细胞，例如使用式24-33中的小分子化合物中的任一种或多种来培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式24所示化合物化合物BX795来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式25所示化合物Tozasertib来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式27所示化合物20b来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式29所示化合物CYT387来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式24所示化合物化合物BX795和如式25所示化合物Tozasertib共同来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式24所示化合物化合物BX795和如式27所示化合物20b共同来培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式27所示化合物20b和如式29所示化合物CYT387共同来培养电转的细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及使用能够抑制STING表达和/或结合活性的小分子化合物或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物和所述能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物共同来培养电转的细胞，例如使用式1-14中的小分子化合物中的任一种和式15-23中的小分子化合物中的任一种共同来培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式15所示化合物化合物奎纳克林来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式15所示化合物化合物奎纳克林来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式15所示化合物化合物奎纳克林来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式9所示小分子化合物Compound 18和如式15所示化合物化合物奎纳克林来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式12所示小分子化合物Compound 13和如式15所示化合物化合物奎纳克林来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式16所示化合物羟氯喹来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式16所示化合物羟氯喹来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式9所示小分子化合物Compound 18和如式16所示化合物羟氯喹来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式12所示小分子化合物Compound 13和如式16所示化合物羟氯喹来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式19所示化合物RU.365来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式19所示化合物RU.365来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式9所示小分子化合物Compound 18和如式19所示化合物RU.365来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式12所示小分子化合物Compound 13和如式19所示化合物RU.365来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式20所示化合物RU.521来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式20所示化合物RU.521来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式9所示小分子化合物Compound 18和如式20所示化合物RU.521来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式12所示小分子化合物Compound 13和如式20所示化合物RU.521来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及使用能够抑制STING表达和/或结合活性的小分子化合物或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物和能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物共同来培养电转的细胞，例如使用式1-14中的小分子化合物中的任一种和式24-33中的小分子化合物中的任一种共同来培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式24所示化合物化合物BX795来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式24所示化合物化合物BX795来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式9所示小分子化合物Compound18和如式24所示化合物化合物BX795来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式12所示小分子化合物Compound 13和如式24所示化合物化合物BX795来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式25所示化合物Tozasertib来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式25所示化合物Tozasertib来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式9所示小分子化合物Compound 18和如式25所示化合物Tozasertib来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式12所示小分子化合物Compound 13和如式25所示化合物Tozasertib来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式27所示化合物20b来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式27所示化合物20b来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式9所示小分子化合物Compound 18和如式27所示化合物20b来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式12所示小分子化合物Compound 13和如式27所示化合物20b来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式1所示化合物CCCP(羰基氰基3-氯苯腙)和如式29所示化合物CYT387来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式5所示化合物H-151和如式29所示化合物CYT387来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式9所示小分子化合物Compound 18和如式29所示化合物CYT387来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式12所示小分子化合物Compound 13和如式29所示化合物CYT387来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及使用能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物和能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物共同来培养电转的细胞，例如使用式15-23中的小分子化合物中的任一种和式24-33中的小分子化合物中的任一种共同来培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式15所示化合物化合物奎纳克林和如式24所示化合物化合物BX795来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式16所示化合物羟氯喹和如式24所示化合物化合物BX795来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式19所示化合物RU.365和如式24所示化合物化合物BX795来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式20所示化合物RU.521和如式24所示化合物化合物BX795来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式15所示化合物化合物奎纳克林和如式25所示化合物Tozasertib来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式16所示化合物羟氯喹和如式25所示化合物Tozasertib来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式19所示化合物RU.365和如式25所示化合物Tozasertib来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式20所示化合物RU.521和如式25所示化合物Tozasertib来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式15所示化合物化合物奎纳克林和如式27所示化合物20b来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式16所示化合物羟氯喹和如式27所示化合物20b来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式19所示化合物RU.365和如式27所示化合物20b来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式20所示化合物RU.521和如式27所示化合物20b来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，使用如式15所示化合物化合物奎纳克林和如式29所示化合物CYT387来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式16所示化合物羟氯喹和如式29所示化合物CYT387来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式19所示化合物RU.365和如式29所示化合物CYT387来共同培养电转的细胞。在某些实施方案中，使用如式20所示化合物RU.521和如式29所示化合物CYT387来共同培养电转的细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及使用能够抑制STING表达和/或结合活性的小分子化合物或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物、能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物和能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物共同来培养电转的细胞，例如使用式1-14中的小分子化合物中的任一种或多种、式15-23中的小分子化合物中的任一种或多种和式24-33中的任一种或多种小分子化合物共同来培养电转的细胞，优选地，使用式1-14中的小分子化合物中的任一种、式15-23中的小分子化合物中的任一种和式24-33中的任一种小分子化合物共同来培养电转的细胞。

电转也称为电穿孔，用于将感兴趣的DNA导入宿主细胞中。可采用本领域周知的各种电转方法和电转试剂来实施本发明，例如，可使用LONZAI Device及其提供的电转试剂。可先按照市售电转试剂的说明书配制电转液，加入电转质粒。电转时，用含电转质粒的电转液重悬细胞，在电转仪器中进行电转。

电转质粒可以是任何感兴趣的质粒。电转质粒的量可以是本领域常规的量，例如每5×10⁶个细胞使用3-8μg的质粒进行电转。

电转结束后，取出细胞悬液，加入预热的细胞培养基，然后在常规的条件下(如37℃、5％CO₂)培养。至少培养0.5小时后，将cGAS-STING信号通路抑制剂加入含电转细胞的该细胞培养基中。过早或过晚加入cGAS-STING信号通路抑制剂都可能无法提高电转细胞的总数量和存活率。因此，优选的是，在培养了电转细胞8小时以内、更优选5小时以内、更优选3小时以内在培养基中加入cGAS-STING信号通路抑制剂。例如，在某些特别优选的实施方案中，培养了电转细胞0.5-3h时加入cGAS-STING信号通路抑制剂，优选在培养了45min到2h时加入cGAS-STING信号通路抑制剂，更优选在培养了1-2小时时加入cGAS-STING信号通路抑制剂。

通常，加入后培养基中cGAS-STING信号通路抑制剂的终浓度在0.02-100μM的范围内，优选在0.02-80μM的范围内，更优选地，在0.5-5μM的范围；进一步更优选地，在0.5-1μM的范围或在2.5-5μM的范围。

本文中，细胞培养基可以是各种适合于细胞(尤其是免疫细胞)培养的培养基，尤其是本领域常规用于培养各种电转的细胞的培养基。在某些实施方案中，所述培养基是用于培养免疫细胞的培养基，包括但不限于用于培养T细胞、TIL细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR-T细胞、CIK细胞、TCR-T细胞和巨噬细胞中的一种或多种的培养基。在某些实施方案中，所述培养基是T细胞、TIL和/或CAR-T细胞的培养基，尤其是培养电转的T细胞、TIL和/或CAR-T细胞的培养基。示例性的培养基包括但不限于CTS^TM无血清细胞培养基、DMEM培养基和RPMI1640培养基中的任一种；优选地，为CTS^TM无血清细胞培养基。

按照常规的培养工艺培养电转细胞后，与本领域常规的电转法相比，添加了cGAS-STING信号通路抑制剂进行的培养能明显提高电转细胞的细胞总数和/或存活率。

因此，本发明提供一种培养电转的细胞(尤其是免疫效应细胞)的方法，所述方法包括在电转结束后，将电转的细胞转入培养基中培养了0-8h时，在培养基中加入cGAS-STING信号通路抑制剂，继续进行培养。优选地，在培养基中培养了0-5h、0-3h、0-1h或1-2h时，加入cGAS-STING信号通路抑制剂进行培养。

在某些实施方案中，本发明提供一种电转法制备表达外源基因的细胞(尤其是免疫效应细胞)的方法，该方法包括：

1)通过电转向细胞中导入含有表达外源基因的核酸；

2)用含有cGAS-STING信号通路抑制剂的培养基培养1)中电转了外源基因的细胞；

其中，电转结束后在培养电转的细胞0.5-8h时、优选0.5-5h、更优选0.5-3h、更优选0.5-2h、更优选1-2h时加入cGAS-STING信号通路抑制剂。

本发明也提供cGAS-STING信号通路抑制剂在培养电转的细胞(尤其是免疫效应细胞)中的应用。

本发明还提供一种细胞培养基，该细胞培养基含有cGAS-STING信号通路抑制剂。优选地，该细胞培养基是免疫效应细胞的培养基。更优选地，所述cGAS-STING信号通路抑制剂选自能够抑制STING表达和/或结合活性的或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物、能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物和能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物中的一种或多种。

因此，在某些实施方案中，本发明的细胞培养基是含有所述能够抑制STING表达和/或结合活性的或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物的用于培养免疫效应细胞的培养基；优选地，是含有选自式1-14中任一种或多种小分子化合物的培养基。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养基是含有所述能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物的用于培养免疫效应细胞的培养基；优选地，是含有选自式15-23中任一种或多种小分子化合物的培养基。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养基是含有所述能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物的用于培养免疫效应细胞的培养基；优选地，是含有选自式24-33中任一种或多种小分子化合物的培养基。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养基是含有所述能够抑制STING表达和/或结合活性的或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物和所述能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物的用于培养免疫效应细胞的培养基；优选地，是含有选自式1-14中任一种或多种小分子化合物和选自式15-23中任一种或多种小分子化合物的培养基。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养基是含有所述能够抑制STING表达和/或结合活性的或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物和所述能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物的用于培养免疫效应细胞的培养基；优选地，是含有选自式1-14中任一种或多种小分子化合物和选自式24-33中任一种或多种小分子化合物的培养基。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养基是含有所述能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物和所述能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物的用于培养免疫效应细胞的培养基；优选地，是含有选自式15-23中任一种或多种小分子化合物和选自式24-33中任一种或多种小分子化合物的培养基。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养基是含有所述能够抑制STING表达和/或结合活性的或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物、所述能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物和所述能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物的用于培养免疫效应细胞的培养基；优选地，是含有选自式1-14中任一种或多种小分子化合物、选自式15-23中任一种或多种小分子化合物和选自式24-33中任一种或多种小分子化合物的培养基。

常规用于培养T细胞、TIL细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR-T细胞、CIK细胞、TCR-T细胞和巨噬细胞中的一种或多种，尤其是常规用于培养T细胞、TIL细胞和/或CAR-T细胞的培养基。更优选地，该培养基是常规用于培养电转的免疫效应细胞的培养基。在这类培养基中添加cGAS-STING信号通路抑制剂，用于培养电转后的免疫效应细胞，可明显提高细胞的总数和存活率。优选地，该培养基中cGAS-STING信号通路抑制剂的终浓度在0.02-100μM的范围内，优选在0.02-80μM的范围内，更优选地，在0.5-5μM的范围；进一步更优选地，在0.5-1μM的范围或在2.5-5μM的范围。本发明示例性的免疫效应细胞培养基为含有cGAS-STING信号通路抑制剂的CTS^TM无血清细胞培养基、DMEM培养基或RPMI1640培养基；优选地，为含有cGAS-STING信号通路抑制剂的CTS^TM无血清细胞培养基；更优选为含有所述浓度的cGAS-STING信号通路抑制剂的CTS^TM无血清细胞培养基。

本发明的有益效果在于，通过使用含有cGAS-STING信号通路抑制剂，如能够抑制STING表达和/或结合活性的或降低或消除线粒体膜电势的小分子化合物、所述能够抑制或拮抗cGAS的小分子化合物和所述能够抑制或拮抗TBK1的小分子化合物中的一种或多种的培养基对电转后的细胞、尤其是免疫效应细胞进行培养，能够明显地降低电转后细胞的死亡率，提高细胞电转后的活细胞数量与活细胞比例。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中使用到的电转仪为购自Lonza的LONZA Nucleofector^TM2b；实施例中使用到的其它方法和试剂为本领域常规的方法和试剂。

本申请中用到的化合物的结构式如下所示：

以下实施例中所使用的pNB328-EGFP为中国专利CN105154473B中所记载，此处将其全部内容以引用的方式纳入本文。

以下实施例中所用小分子化合物G150、H-151和IRAK-IN-4均购自MCE，货号分别为HY-128583、HY-112693和HY-114181。C-170购自Cayman Chemical，货号30157。其他所使用的试剂均通可通过商业途径购买获取。

实施例1：人肝癌组织来源TIL细胞的分离培养

收集新切除的肝癌标本，立即在无菌条件下进行处理。具体方法如下：去除肝癌标本周围的正常组织和坏死区域，从标本的不同区域取下大小为1-2mm³的小组织块，24孔板的每一孔放置一块。每孔加2mL完全培养基(含10％FBS的AIM-V培养基)和3000IU/mL的IL-2。将24孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。培养起始后的第5-6天为所有孔进行半量换液。之后，根据TIL生长情况，每隔1-2天进行一次半量换液。一旦孔内TIL长满，且所有贴壁细胞已除去，就将各个长满孔内的TIL收集起来。

实施例2：人活化T细胞的制备

用含有5μg/ml的抗CD3抗体和5μg/ml的抗CD28抗体的包被液包被六孔板室温2-4小时，吸去包被液后用生理盐水洗涤孔板1-3次，加入含2％FBS AIM-V培养基待用；人外周血PBMC(购买自ALLCELLS)37℃水浴复苏，将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；再将洗涤后的初始T细胞转移至盛有待用培养基的抗体包被孔中，37℃，5％CO₂培养3～4天后进行后续实验。

实施例3cGAS小分子抑制剂G150在电转制备过表达EGFP的TIL细胞中的应用

按以下步骤电转表达EGFP的TIL：

1)预先将AIM-V培养基加入12孔板内的4个孔，每孔2mL，随后转入细胞培养箱内37℃5％CO₂预热1小时；

2)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：

3)取实施例1获得的TIL至4个EP管内，每个EP管内加入5×10⁶个细胞，1200rpm离心5min，弃上清，随后用500μL生理盐水重悬细胞，重复离心步骤洗涤细胞沉淀；

4)向2)中配置好的电转液加入质粒pNB328-EGFP 5μg，随后室温静置30min以内；

5)用4)中配置好的含质粒的电转液重悬4管TIL，每管100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA Nucleofector^TM2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择T-020；

6)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至EP管中，每管加入预热的AIM-V培养基200μL，随后转入1)中12孔板内含预热AIM-V培养基的孔中，37℃、5％CO₂培养；

7)分别在培养0h、1h和5h后向3个孔加入式22所示化合物G150至终浓度为2.5μM；剩下的一孔不加G150，作为对照孔，随后继续培养。

重复培养操作3次，对培养5天后的各孔中细胞数量和细胞活率用细胞计数仪进行检测，取平均值。

结果如图1-5所示。图1显示电转后0h加入G150的TIL细胞培养5天后荧光显微镜观察到的EGFP阳性细胞。图2显示电转后0h、1h和5h加入G150至2.5μM培养5天后的EGFP阳性细胞的流式细胞分析结果。图3-5分别显示TIL电转pNB328-EGFP后0h、1h、5h加入G150至2.5μM处理组和不加入G150的对照组培养5天后的活细胞数，活细胞比例及EGFP阳性细胞比例。结果显示，TIL电转表达EGFP的质粒后0h、1h和5h加入G150分子能够明显提升TIL细胞电转后的活细胞数量、活细胞比例以及EGFP表达阳性的细胞比例。这表明加入cGAS抑制剂G150能够明显提升TIL细胞电转后的存活水平和提升外源基因的转入效率。

实施例4cGAS小分子抑制剂G150在电转制备过表达EGFP的T细胞中的应用

按以下步骤电转表达EGFP的T细胞：

1)预先将AIM-V培养基加入12孔板内的4个孔，每孔2mL，随后转入细胞培养箱内37℃5％CO₂预热1小时；

2)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：

3)取实施例2获得的活化T细胞至4个EP管内，每个EP管内加入5×10⁶个细胞，1200rpm离心5min，弃上清，随后用500μL生理盐水重悬细胞，重复离心步骤洗涤细胞沉淀；

4)向2)中配置好的电转液加入质粒pNB328-EGFP 5μg，随后室温静置30min以内；

5)用4)中配置好的含质粒的电转液重悬4管T细胞，每管100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA Nucleofector^TM 2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择T-020；

6)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至EP管中，每管加入预热的AIM-V培养基200μL，随后转入1)中12孔板内含预热AIM-V培养基的孔中，37℃、5％CO₂培养；

7)分别在培养0h、1h和5h后向3个孔加入式22所示化合物G150至终浓度为5μM；剩下的一孔不加G150，作为对照孔，随后继续培养。

重复培养操作3次，对培养5天后的各孔中细胞数量和细胞活率用细胞计数仪进行检测，取平均值。

结果如图6-8所示。图6-8分别显示活化T细胞电转pNB328-EGFP后0h、1h、5h加入G150至5μM处理组和不加入G150的对照组培养5天后的活细胞数，活细胞比例及EGFP阳性细胞比例。结果显示，T电转表达EGFP的质粒后0h、1h和5h加入G150分子能够明显提升活化T细胞电转后的活细胞数量、活细胞比例以及EGFP表达阳性的细胞比例。这表明加入cGAS抑制剂G150能够明显提升活化T细胞电转后的存活水平和提升外源基因的转入效率。

实施例5STING小分子抑制剂H-151在电转制备过表达EGFP的TIL细胞中的应用

按以下步骤电转表达EGFP的TIL细胞：

1)预先将AIM-V培养基加入12孔板内的4个孔，每孔2mL，随后转入细胞培养箱内37℃5％CO₂预热1小时；

2)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：

3)取实施例1获得的TIL细胞至4个EP管内，每个EP管内加入5×10⁶个细胞，1200rpm离心5min，弃上清，随后用500μL生理盐水重悬细胞，重复离心步骤洗涤细胞沉淀；

4)向2)中配置好的电转液加入质粒pNB328-EGFP 5μg，随后室温静置30min以内；

5)用4)中配置好的含质粒的电转液重悬4管TIL细胞，每管100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA Nucleofector^TM 2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择T-020；

6)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至EP管中，每管加入预热的AIM-V培养基200μL，随后转入1)中12孔板内含预热AIM-V培养基的孔中，37℃、5％CO₂培养；

7)分别在培养0h、1h和5h后向3个孔加入式5所示化合物H-151至终浓度为0.5μM；剩下的一孔不加H-151，作为对照孔，随后继续培养。

重复培养操作3次，对培养5天后的各孔中细胞数量和细胞活率用细胞计数仪进行检测，取平均值。

结果如图9-11所示。图9-11分别显示TIL细胞电转pNB328-EGFP后0h、1h、5h加入H-151至0.5μM处理组和不加入H-151的对照组培养5天后的活细胞数，活细胞比例及EGFP阳性细胞比例。结果显示，TIL细胞电转表达EGFP的质粒后0h、1h和5h加入H-151分子能够明显提升TIL细胞电转后的活细胞数量、活细胞比例以及EGFP表达阳性的细胞比例。这表明加入STING抑制剂H-151能够明显提升TIL细胞电转后的存活水平和提升外源基因的转入效率。

实施例6STING小分子抑制剂H-151在电转制备过表达EGFP的T细胞中的应用

按以下步骤电转表达EGFP的T细胞：

1)预先将AIM-V培养基加入12孔板内的4个孔，每孔2mL，随后转入细胞培养箱内37℃5％CO₂预热1小时；

2)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：

3)取实施例2获得的活化T细胞至4个EP管内，每个EP管内加入5×10⁶个细胞，1200rpm离心5min，弃上清，随后用500μL生理盐水重悬细胞，重复离心步骤洗涤细胞沉淀；

4)向2)中配置好的电转液加入质粒pNB328-EGFP 5μg，随后室温静置30min以内；

5)用4)中配置好的含质粒的电转液重悬4管T细胞，每管100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA Nucleofector^TM 2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择T-020；

6)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至EP管中，每管加入预热的AIM-V培养基200μL，随后转入1)中12孔板内含预热AIM-V培养基的孔中，37℃、5％CO₂培养；

7)分别在培养0h、1h和5h后向3个孔加入式5所示化合物H-151至终浓度为1μM；剩下的一孔不加H-151，作为对照孔，随后继续培养。

重复培养操作3次，对培养5天后的各孔中细胞数量和细胞活率用细胞计数仪进行检测，取平均值。

结果如图12-14所示。图12-14分别显示活化T细胞电转pNB328-EGFP后0h、1h、5h加入H-151至1μM处理组和不加入H-151的对照组培养5天后的活细胞数，活细胞比例及EGFP阳性细胞比例。结果显示，T细胞电转表达EGFP的质粒后0h、1h和5h加入H-151分子能够明显提升活化T细胞电转后的活细胞数量和EGFP表达阳性的细胞比例。这表明加入STING抑制剂H-151能够明显提升活化T细胞电转后的存活水平和提升外源基因的转入效率。

对比例1cGAS小分子抑制剂IRAK-IN-4在电转制备过表达EGFP的TIL细胞中的应用

按以下步骤电转表达EGFP的TIL细胞：

1)预先将AIM-V培养基加入12孔板内的4个孔，每孔2mL，随后转入细胞培养箱内37℃5％CO₂预热1小时；

2)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：

3)取实施例1获得的TIL细胞至4个EP管内，每个EP管内加入5×10⁶个细胞，1200rpm离心5min，弃上清，随后用500μL生理盐水重悬细胞，重复离心步骤洗涤细胞沉淀；

4)向2)中配置好的电转液加入质粒pNB328-EGFP 5μg，随后室温静置30min以内；

5)用4)中配置好的含质粒的电转液重悬4管TIL细胞，每管100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA Nucleofector^TM 2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择T-020；

6)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至EP管中，每管加入预热的AIM-V培养基200μL，随后转入1)中12孔板内含预热AIM-V培养基的孔中，37℃、5％CO₂培养；

7)分别在培养0h、1h和5h后向3个孔加入cGAS抑制剂IRAK-IN-4至终浓度为2μM；剩下的一孔不加IRAK-IN-4，作为对照孔，随后继续培养。

重复培养操作3次，对培养5天后的各孔中细胞数量和细胞活率用细胞计数仪进行检测，取平均值。

结果如图15-17所示。图15-17分别显示TIL细胞电转pNB328-EGFP后0h、1h、5h加入IRAK-IN-4至2μM处理组和不加入IRAK-IN-4的对照组培养5天后的活细胞数，活细胞比例及EGFP阳性细胞比例。结果显示，TIL电转表达EGFP的质粒后0h、1h和5h加入IRAK-IN-4分子未见明显提升TIL细胞电转后的活细胞数量、活细胞比例以及EGFP表达阳性的细胞比例。这表明加入cGAS抑制剂IRAK-IN-4对提升TIL细胞电转后的存活水平和提升外源基因的转入效率作用不明显。

对比例2STING小分子抑制剂C-170在电转制备过表达EGFP的T细胞中的应用

按以下步骤电转表达EGFP的T细胞：

1)预先将AIM-V培养基加入12孔板内的4个孔，每孔2mL，随后转入细胞培养箱内37℃5％CO₂预热1小时；

2)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：

3)取实施例2获得的活化T细胞至4个EP管内，每个EP管内加入5×10⁶个细胞，1200rpm离心5min，弃上清，随后用500μL生理盐水重悬细胞，重复离心步骤洗涤细胞沉淀；

4)向2)中配置好的电转液加入质粒pNB328-EGFP 5μg，随后室温静置30min以内；

5)用4)中配置好的含质粒的电转液重悬4管T细胞，每管100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA Nucleofector^TM 2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择T-020；

6)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至EP管中，每管加入预热的AIM-V培养基200μL，随后转入1)中12孔板内含预热AIM-V培养基的孔中，37℃、5％CO₂培养；

7)分别在培养0h、1h和5h后向3个孔加入STING抑制剂C-170至终浓度为2μM；剩下的一孔不加C-170，作为对照孔，随后继续培养。

重复培养操作3次，对培养5天后的各孔中细胞数量和细胞活率用细胞计数仪进行检测，取平均值。

结果如图18-20所示。图18-20分别显示活化T细胞电转pNB328-EGFP后0h、1h、5h加入C-170至2μM处理组和不加入C-170的对照组培养5天后的活细胞数，活细胞比例及EGFP阳性细胞比例。结果显示，T电转表达EGFP的质粒后0h、1h和5h加入C-170分子未见明显提升T细胞电转后的活细胞数量、活细胞比例以及EGFP表达阳性的细胞比例。这表明加入STING抑制剂C-170对提升活化T细胞电转后的存活水平和提升外源基因的转入效率作用不明显。

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