一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体及其制备方法与用途
阅读说明：本技术 一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体及其制备方法与用途 (siRNA nucleic acid liposome targeting BIRC6 gene and preparation method and application thereof ) 是由 谭亚南 关新元 李咏梅 李珊珊 罗敏 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体及其制备方法和用途,其中,所述靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体包括脂质体组分和BIRC6抑制剂；所述脂质体组分包括DOTAP、Chol、DPPC和DSPE-PEG2000；所述BIRC6抑制剂为靶向BIRC6的siRNA,所述靶向BIRC6的siRNA序列为GUUUCAAAGCAGGAUGAUGdTdT。本发明提供的siRNA核酸脂质体表面带正电性,不易被核酸酶降解,能够使负载的siRNA进入细胞靶向性沉默BIRC6基因,并能有效抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和肿瘤形成,达到治疗三阴性乳腺癌的目的。本发明siRNA核酸脂质体具备良好的细胞摄取和溶酶体逃逸能力,具有BIRC6靶向性,有利于基因药物在体内的靶向运输,实现基因药物体内长循环和对BIRC6高表达肿瘤的靶向沉默效果。(The invention discloses a siRNA nucleic acid liposome targeting a BIRC6 gene and a preparation method and application thereof, wherein the siRNA nucleic acid liposome targeting the BIRC6 gene comprises a liposome component and a BIRC6 inhibitor; the liposome component comprises DOTAP, Chol, DPPC and DSPE-PEG 2000; the BIRC6 inhibitor is siRNA targeting BIRC6, and the siRNA sequence of the BIRC6 is GUUUCAAGCAGGAUGAUGdTdT. The siRNA nucleic acid liposome provided by the invention has positive electricity on the surface, is not easily degraded by nuclease, can enable the loaded siRNA to enter a cell targeting silencing BIRC6 gene, and can effectively inhibit the proliferation and tumor formation of triple negative breast cancer cells, thereby achieving the purpose of treating triple negative breast cancer. The siRNA nucleic acid liposome has good cell uptake and lysosome escape capacity, has the BIRC6 targeting property, is beneficial to the targeted transportation of gene drugs in vivo, and realizes the long circulation in gene drug objects and the targeted silencing effect on BIRC6 high-expression tumors.)
技术领域
本发明涉及药物递送技术领域，尤其涉及一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体及其制备方法与用途。
背景技术
三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)特指ER、PgR表达缺失以及HER2过表达或基因扩增缺失的乳腺癌类型，占全部乳腺癌的12％-17％。与其他亚型相比，TNBC生物学上更具侵袭性，患者的复发率更高，5年预后更差。尽管PARP抑制剂，PD-L1抗体atezolizumab目前已被分别批准用于BRCA突变、PD-L1表达阳性的TNBC患者，但针对TNBC的靶向治疗尚处于早期，化疗仍是标准治疗方法。TNBC患者尽管对化疗具有一定的反应率，但是仍有60％-70％的病人对化疗不敏感。因此，急需鉴定更多可用于TNBC治疗的分子靶点并研发相应的靶向治疗手段。
BIRC6是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中分子量极大(接近530kDa)和研究较少的成员。我们前期研究发现BIRC6在三阴性乳腺癌中高表达，该过表达能够促进三阴性乳腺癌细胞增殖，并且与三阴性乳腺癌病人短的预后生存时间有关，揭示沉默BIRC6表达有望用于三阴性乳腺癌治疗。
目前，临床上尚没有沉默BIRC6表达的抑制剂。使用siRNA进行基因治疗可以下调癌细胞中异常基因的表达并在癌症治疗中显示出较大的潜力。然而，未经修饰的siRNA易被核酸酶降解、细胞摄取效率差，临床应用受到限制。目前还没有将siRNA沉默BIRC6基因用于三阴性乳腺癌等治疗药物中的研究。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体及其制备方法与用途。
本发明的技术方案如下：
一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体，其中，包括脂质体组分和BIRC6抑制剂；所述脂质体组分包括DOTAP、Chol、DPPC和DSPE-PEG2000；所述BIRC6抑制剂为靶向BIRC6的siRNA，所述靶向BRIC6的siRNA序列为GUUUCAAAGCAGGAUGAUGdTdT。
所述靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体，其中，所述脂质体组分按重量份计包括70份的DPPC，0-20份的DOTAP、5份的Chol和5份DSPE-PEG2000。
所述靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体，其中，所述脂质体组分和BIRC6抑制剂的质量比为10-100:1。
所述靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体，其中，所述脂质体组分和BIRC6抑制剂的质量比为60:1。
一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体的制备方法，其中，包括步骤：
将DPPC、DOTAP、Chol和DSPE-PEG2000溶解于乙醇中，且在60℃的水浴中加热，得到乙醇相溶液；
将所述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，且在400rpm的转速下搅拌8min，将制备好的溶液在室温下冷却，得PEG修饰的阳离子脂质体溶液；
取靶向BIRC6的siRNA用DEPC水配成浓度为2μM的siRNA溶液，将所述siRNA溶液与所述PEG修饰的阳离子脂质体溶液按照设定的质量比混合，涡旋30s后室温静置30min，得到所述靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体。
一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体，在制备治疗或预防BIRC6基因异常表达引起的疾病中的药物中的用途。
所述的用途，其中，所述疾病为三阴性乳腺癌。
一种脂质体制剂，其中，包含本发明所述靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体及药学上可接受的载体。
有益效果：本发明提供一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体，其由阳离子脂质体组分与BIRC6抑制剂结合后通过静电吸附方式形成siRNA核酸脂质体。由于阳离子脂质体本身带有正电荷，可以与带有负电荷的siRNA通过静电作用紧密结合，形成脂质体与核酸的复合物，促进内-溶酶体逃逸，保护核酸不受核酸酶降解，为进一步核酸药物发挥药效提供保障；另一方面引入PEG化磷脂，可减少纳米粒被网状内皮系统的巨噬细胞吞噬，实现体内长循环，延长核酸递送系统在肿瘤组织的滞留蓄积时间，降低毒副作用，实现高效低毒的治疗目标。本发明所述siRNA核酸脂质体表面带正电性，不易被核酸酶降解，能够使负载的siRNA进入细胞靶向性沉默BIRC6基因，并能有效抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和肿瘤形成，达到治疗三阴性乳腺癌的目的；本发明提供的靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体有利于基因药物在体内的靶向运输，可提高三阴性乳腺癌治疗效率，对基因药物用于BIRC6高表达肿瘤的靶向治疗具有重要意义。
附图说明
图1所示为本发明靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体的制备流程。
图2所示为含有不同质量比DOTAP的pCLNs的粒径及表面电位。
图3所示为siRNA核酸脂质体的凝胶电泳阻滞图。
图4所示为siRNA核酸脂质体的粒径和电位。
图5中A至C所示的结果显示siRNA核酸脂质体能够在体内外将靶向BIRC6的siRNA有效递送至三阴性乳腺癌细胞中，A显示将MDA-MB-468细胞与游离Cy3-siRNA或pCLNs/Cy3-siRNA孵育至指定时间后，用流式细胞仪检测Cy3-siRNA的细胞内荧光强度；B显示将MDA-MB-468细胞与pCLNs/Cy3-siRNA孵育至指定时间后，通过激光共聚焦扫描显微镜观察脂质体的细胞内定位和溶酶体逃逸情况；C显示将游离Cy3-siRNA或pCLNs/Cy3-siRNA静脉注射至MDA-MB-468异种移植瘤小鼠后，观测其体内分布情况。
图6中A至G所示的结果显示siRNA核酸脂质体能够明显抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和肿瘤形成，A显示经核酸脂质体处理后MDA-MB-468细胞中BIRC6的蛋白表达情况(左)及相对细胞增殖率(右)；B显示经核酸脂质体和EGFR抑制剂gefitinib处理后MDA-MB-468细胞的凋亡比例；C-E显示经核酸脂质体和EGFR抑制剂gefitinib处理后MDA-MB-468异种移植瘤的代表性图片(C)，肿瘤体积(D)和肿瘤重量(E)；F显示经核酸脂质体和EGFR抑制剂gefitinib处理后MDA-MB-468异种移植瘤的免疫组化分析；G显示Ki67和cleaved caspase3染色的平均荧光密度。
具体实施方式
本发明提供一种靶向BIRC6基因的siRNA核酸脂质体及其制备方法与用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。下例实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
关于一种PEG修饰的阳离子脂质体的制备
本实施例1提供的一种PEG修饰的阳离子脂质体是通过以下步骤构建制得的：
按重量份计，选取70份的热敏脂质DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、0份的DOTAP((2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺)、5份的Chol(胆固醇)和5份的DSPE-PEG2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)溶解于乙醇溶液，60℃水浴加热。取2mL F68水溶液(1mg/mL)加热至60℃。在60℃条件下，将上述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，并在400rpm下搅拌8min。将制备好的溶液在室温下冷却，得PEG修饰的阳离子脂质体(pCLNs)。
实施例2
关于一种PEG修饰的阳离子脂质体的制备
本实施例2提供的一种PEG修饰的阳离子脂质体是通过以下步骤构建制得的：
按重量份计，选取70份的热敏脂质DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、5份的DOTAP((2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺)、5份的Chol(胆固醇)和5份的DSPE-PEG2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)溶解于乙醇溶液，60℃水浴加热。取2mL F68水溶液(1mg/mL)加热至60℃。在60℃条件下，将上述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，并在400rpm下搅拌8min。将制备好的溶液在室温下冷却，得PEG修饰的阳离子脂质体(pCLNs)。
实施例3
关于一种PEG修饰的阳离子脂质体的制备
本实施例3提供的一种PEG修饰的阳离子脂质体是通过以下步骤构建制得的：
按重量份计，选取70份的热敏脂质DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、10份的DOTAP((2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺)、5份的Chol(胆固醇)和5份的DSPE-PEG2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)溶解于乙醇溶液，60℃水浴加热。取2mL F68水溶液(1mg/mL)加热至60℃。在60℃条件下，将上述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，并在400rpm下搅拌8min。将制备好的溶液在室温下冷却，得PEG修饰的阳离子脂质体(pCLNs)。
实施例4
关于一种PEG修饰的阳离子脂质体的制备
本实施例4提供的一种PEG修饰的阳离子脂质体是通过以下步骤构建制得的：
按重量份计，选取70份的热敏脂质DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、20份的DOTAP((2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺)、5份的Chol(胆固醇)和5份的DSPE-PEG2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)溶解于乙醇溶液，60℃水浴加热。取2mL F68水溶液(1mg/mL)加热至60℃。在60℃条件下，将上述乙醇相溶液快速分散至F68水溶液中，并在400rpm下搅拌8min。将制备好的溶液在室温下冷却，得PEG修饰的阳离子脂质体(pCLNs)。
采用微粒粒度与表面电位仪分别测定含有不同质量比DOTAP的pCLNs的粒径及表面电位。结果如图2所示，当DOTAP组分重量份为0份时，pCLNs的粒径为65.47±1.0nm，表面电位为-11.4±1.89mV。随着DOTAP组分重量份比例逐渐增加至20份时，pCLNs的粒径为100.2±11.2nm，表面电位为40.6±4.41mV。结果说明随着DOTAP组分比例增加，pCLNs的粒径增大，但仍保持在100nm左右，在体内转运过程中可通过“增强渗透和保留”(EPR)效应优先聚集到肿瘤组织；表面电荷从负电荷反转成正电荷，且大于30mV，利于稳定复合带负电荷的siRNA，保护其免受核酸酶的降解。
实施例5
1)关于一种PEG修饰的阳离子脂质体的制备
本实施例5提供的PEG修饰的阳离子脂质体的制备方法与实施例4中相同在此不做过多的陈述。
2)关于一种复合siRNA脂质体的制备：
本实施例5提供的复合siRNA脂质体是通过以下步骤制得：
取BIRC6基因的siRNA用DEPC水配成浓度为2μM的siRNA溶液，BIRC6基因的siRNA序列优选为GUUUCAAAGCAGGAUGAUGdTdT。将siRNA溶液与PEG修饰的阳离子脂质体pCLNs溶液按照设定的质量比(pCLNs质量：siRNA质量＝10：1)缓慢混合，涡旋30s后室温静置30min，得到pCLNs/siRNA复合物(如图1所示)。
实施例6
1)关于一种PEG修饰的阳离子脂质体的制备
本实施例6提供的PEG修饰的阳离子脂质体的制备方法与实施例4中相同在此不做过多的陈述。
2)关于一种复合siRNA脂质体的制备：
本实施例6提供的复合siRNA脂质体是通过以下步骤制得：
取BIRC6基因的siRNA用DEPC水配成浓度为2μM的siRNA溶液，BIRC6基因的siRNA序列优选为GUUUCAAAGCAGGAUGAUGdTdT。将siRNA溶液与PEG修饰的阳离子脂质体pCLNs溶液按照设定的质量比(pCLNs质量：siRNA质量＝20：1)缓慢混合，涡旋30s后室温静置30min，得到pCLNs/siRNA复合物(如图1所示)。
实施例7
1)关于一种PEG修饰的阳离子脂质体的制备
本实施例7提供的PEG修饰的阳离子脂质体的制备方法与实施例4中相同在此不做过多的陈述。
2)关于一种复合siRNA脂质体的制备：
本实施例7提供的复合siRNA脂质体是通过以下步骤制得：
取BIRC6基因的siRNA用DEPC水配成浓度为2μM的siRNA溶液，BIRC6基因的siRNA序列优选为GUUUCAAAGCAGGAUGAUGdTdT。将siRNA溶液与PEG修饰的阳离子脂质体pCLNs溶液按照设定的质量比(pCLNs质量：siRNA质量＝40：1)缓慢混合，涡旋30s后室温静置30min，得到pCLNs/siRNA复合物(如图1所示)。
实施例8
1)关于一种PEG修饰的阳离子脂质体的制备
本实施例8提供的PEG修饰的阳离子脂质体的制备方法与实施例4中相同在此不做过多的陈述。
2)关于一种复合siRNA脂质体的制备：
本实施例8提供的复合siRNA脂质体是通过以下步骤制得：
取BIRC6基因的siRNA用DEPC水配成浓度为2μM的siRNA溶液，BIRC6基因的siRNA序列优选为GUUUCAAAGCAGGAUGAUGdTdT。将siRNA溶液与PEG修饰的阳离子脂质体pCLNs溶液按照设定的质量比(pCLNs质量：siRNA质量＝60：1)缓慢混合，涡旋30s后室温静置30min，得到pCLNs/siRNA复合物(如图1所示)。
实施例9
1)关于一种PEG修饰的阳离子脂质体的制备
本实施例9提供的PEG修饰的阳离子脂质体的制备方法与实施例4中相同在此不做过多的陈述。
2)关于一种复合siRNA脂质体的制备：
本实施例9提供的复合siRNA脂质体是通过以下步骤制得：
取BIRC6基因的siRNA用DEPC水配成浓度为2μM的siRNA溶液，BIRC6基因的siRNA序列优选为GUUUCAAAGCAGGAUGAUGdTdT。将siRNA溶液与PEG修饰的阳离子脂质体pCLNs溶液按照设定的质量比(pCLNs质量：siRNA质量＝100：1)缓慢混合，涡旋30s后室温静置30min，得到pCLNs/siRNA复合物(如图1所示)。
为了测试本发明实施例5-实施例9所获得的pCLNs/siRNA复合物中脂质体组分与siRNA的最佳质量比，我们实施凝胶电泳阻滞实验。首先，制备1％琼脂糖凝胶并加入溴化乙锭(终浓度为50μg/100mL)。将pCLNs/siRNA复合物与5×上样缓冲液混匀后加入至凝胶孔，设置电泳参数：100V，30min。电泳结束，取出凝胶，于凝胶成像系统中观察并拍照。结果显示，随着pCLNs质量的增加，siRNA通过凝胶的流动性降低，当pCLNs与siRNA的质量比为60:1时，其siRNA条带完全堵塞在凝胶孔中(如图3所示)，脂质体与siRNA完全密接，形成稳定的复合物。选用该比例作为BIRC6基因的siRNA与PEG修饰的阳离子脂质体pCLNs的优选复合比例。
3)siRNA脂质体的理化性质研究：
按照实施例4和实施例9方法配置阳离子脂质体pCLNs和pCLNs/siRNA复合物，使用微粒粒度与表面电位仪测定相应脂质体的粒径和表面电位，使用透射与扫描电镜研究脂质体的空间结构。结果显示pCLNs和pCLNs/siRNA复合物表现出脂质体常规的球形形态和良好的尺寸均匀性(如图4A所示)。当pCLNs与siRNA混合后，脂质体的粒径由100.2±11.2nm变为155.3±1.6nm，zeta电位由40.6±4.41mV变为18.9±1.31mV(如图4B所示)，表明pCLNs/siRNA复合物制备成功。
4)siRNA脂质体的细胞摄取和肿瘤靶向能力研究：
选取Cy3标记的siRNA，按照实施例9中的方法制备siRNA脂质体。将三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468接种于24孔板或35mm玻璃底培养皿中孵育过夜，加入pCLNs/Cy3-siRNA复合物，共孵育1h、4h和12h，最终siRNA浓度为100nM。为了评估细胞对siRNA的摄取情况，使用胰蛋白酶处理并收集细胞，通过流式细胞术进行荧光分析。结果显示，荧光细胞比例随着pCLNs/Cy3-siRNA孵育时间的增加而增加，并在孵育12h后仍保持较高水平(如图5A所示)。为了实现高效的细胞质基因沉默，siRNA脂质体进入细胞后从溶酶体中逃逸是必要的。为了研究siRNA从溶酶体中的逃逸情况，观察前，细胞中加入0.5mL Lysotracker Blue(标记溶酶体)试剂，37℃孵育30min，弃去培养基，PBS洗涤，4％多聚甲醛固定后封片，激光共聚焦显微镜观察复合物细胞内分布并拍摄荧光照片。如图5B显示，孵育4h后，红色荧光(Cy3-siRNA)和蓝色荧光(LysoTracker)共定位于MDA-MB-468细胞，表明Cy3-siRNA位于溶酶体中。孵育12h后，红色荧光与蓝色荧光分离，提示Cy3-siRNA已从溶酶体逃逸到细胞质中。以上结果表明，制备的siRNA脂质体具备良好的细胞摄取和溶酶体逃逸能力。
进一步，我们评估pCLNs包被的siRNA是否可以通过血液到达肿瘤部位并在循环中稳定。首先，将MDA-MB-468细胞植入雌性裸鼠乳腺脂肪垫，建立原位三阴性乳腺癌模型。当肿瘤体积达到～100mm3时，静脉注射pCLNs/Cy3-siRNA或者游离Cy3-siRNA，siRNA剂量为20μg。在注射后的指定时间，使用Maestro体内成像系统对小鼠进行成像。结果显示，注射pCLNs/Cy3-siRNA组肿瘤内荧光强度逐渐增加，直至注射36h后荧光仍保持较高水平，而注射Cy3-siRNA组肿瘤内没有荧光(如图5C所示)。这些结果表明，制备的siRNA核酸脂质体在注射后能够高效地递送到肿瘤部位，并且在循环中是稳定的。
5)siRNA脂质体对三阴性乳腺癌细胞的体外疗效研究：
按照实施例9中的方法，选取脂质体组分和靶向BIRC6的siRNA制备pCLNs/siBIRC6复合物，将复合物与MDA-MB-468细胞孵育48h后，通过免疫印迹检测BIRC6的表达水平。结果显示，pCLNs/siBIRC6能够实现BIRC6的有效敲低(如图6A左所示)。随后，将MDA-MB-468细胞接种于96孔板中，贴壁后加入相应脂质体孵育72h后，通过MTT实验检测细胞的增殖速率。结果显示，pCLNs/siBIRC6能够显著抑制细胞的生长(如图5A右所示)。进一步，将相应脂质体或者EGFR抑制剂gefitinib加入到MDA-MB-468细胞中，孵育72h后，通过流式细胞术检测细胞的凋亡比例。结果显示，与gefitinib处理相比，pCLNs/siBIRC6复合物显著增加了细胞凋亡水平(如图6B所示)。以上结果表明，制备的siRNA脂质体能够在体外有效抑制三阴性乳腺癌细胞的生长。
6)siRNA脂质体对三阴性乳腺癌细胞的体内疗效研究：
我们在接种MDA-MB-468细胞的原位裸鼠模型中评估了pCLNs/siBIRC6复合物的抗肿瘤作用。具体而言，将MDA-MB-468细胞注射到4～5周龄雌性裸鼠乳腺脂肪垫中，当肿瘤体积达到～100mm3时，将小鼠随机分为4个治疗组。gefitinib每日灌胃100mg/kg；静脉注射pCLNs/siBIRC6(每次注射20μg siBIRC6)或等量的pCLNs/siNC，每周重复注射1次，共6周。监测小鼠肿瘤体积和重量。结果显示，相比gefitinib处理组，pCLNs/siBIRC6基因治疗更能有效抑制肿瘤生长(如图6C所示)，其肿瘤体积减少了91.58％(如图6D所示)。而且，pCLNs/siBIRC6处理组的肿瘤重量也低于gefitinib处理组(如图6E所示)。随后，将肿瘤组织取出进行免疫组化染色，图6F-G显示pCLNs/siBIRC6处理比gefitinib更能有效阻断细胞增殖(Ki67)和诱导细胞凋亡(cleaved caspase3)。这些结果表明，制备的siRNA核酸脂质体能够有效抑制三阴性乳腺癌细胞的肿瘤形成。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。